Thermomonospora amylolytica来源嗜碱β-葡萄糖苷酶的克隆、异源表达及其酶学性质研究.pdf

中国饲料2023 年第 17 期基 金 项 目 院云 南 省 基 础 研 究 专 项要要要青 年 项 目渊202101AU070138冤曰大理苍山综合科学考察渊二期冤子项目要要要大理苍山高海拔真菌多样性科学考察渊KY2126109940冤作者简介院黄裕颖袁硕士研究生袁主要研究方向为微生物来源嗜热 茁-葡萄糖苷酶功能研究袁E-mail院*通讯作者院尹以瑞袁博士袁特聘副教授袁主要研究方向为滇西北极端酶资源开发与利用袁E-mail院来源嗜碱茁-葡萄糖苷酶的克隆尧异源表达及其酶学性质研究黄裕颖袁 李馨伟袁 李蕾袁 朱倩袁 饶孟迪袁 尹以瑞*渊大理大学农学与生物科学学院袁云南大理 671003冤DOI院10.15906/11-2975/s.2022100004-07摘要 茁-葡萄糖苷酶能催化水解纤维二糖为葡萄糖袁在医药尧农业尧食品尧饲料等领域有着非常广泛的应用遥 本研究从嗜热放线菌渊Thermomonospora amylolytica冤中获得一个碱性 茁-葡萄糖苷酶基因袁命名为 tabg12a遥 该基因在大肠杆菌中成功进行克隆和异源表达袁并对其酶学性质进行研究遥 结果表明院tabg12a 的最适反应 pH 和温度分别为 8.0和 45 益袁其在 pH 8.0 9.6 下保持 50%以上相对活性袁在 pH 为 4.0 10.0 缓冲液孵育 24 h 后仍保持 80%以上的相对酶活袁在 30 益下孵育 2 h 仍保持 70%以上的相对酶活袁在 35 益下孵育 1 h 仍保持 50%以上的相对酶活遥 1 mmo/L的 K+和 Ca2+对其表现出促进作用袁提高至 120%曰0.1%的 SDS 和 1 mmo/L Cu2+下仍保持 100%的相对活性遥 以上酶学性质预示着该酶在食品尧饲料和纤维素乙醇生产等领域具有潜在利用价值遥关键词 茁-葡萄糖苷酶曰嗜热放线菌曰异源表达曰嗜碱曰酶学性质中图分类号 S816.3文献标识码 A文章编号 1004-3314渊2023冤17-0056-06茁-葡萄糖苷酶 渊茁-glucosidase曰EC.3.2.1.21冤属于纤维素酶类袁可水解末端尧非还原性的烃基-茁-葡萄糖苷或芳香基-茁-葡萄糖苷的 茁-D-糖苷键袁同时释放葡萄糖和相应的配基袁是纤维素酶系的重要组成部分袁 通常被认为是纤维素酶类的限速酶渊周林芳袁2017曰倪嘉璐袁2010冤遥 茁-葡萄糖苷酶在食品尧医疗尧饲料尧纺织以及农业等领域都具有巨大的开发价值 渊来亚鹏袁2017曰Verdoucq袁2004曰Rosenthal袁1992冤遥 茁-葡萄糖苷酶在自然界中分布广泛袁在动物尧植物和微生物中均有发现袁但动物源 茁-葡萄糖苷酶提取产量少尧 成本高袁植物源 茁-葡萄糖苷酶活性低且不稳定袁目前的研究主要集中在微生物上渊姚瑶袁2018曰Oliveira袁2017曰韩笑袁2008冤袁如丝状真菌尧酵母菌尧乳酸菌以及放线菌中都有研究渊张媛媛等袁2019冤遥 其中袁嗜热放线菌被认为是潜在的纤维素酶生产者袁 但对于其来源的 茁-葡萄糖苷酶仍需进一步研究渊Haigerdal等袁2021冤遥 Thermomonospora amylolytica 渊原名为Actinomadura amylolytica YIM77502T冤为地热环境来源嗜热放线菌袁其适宜生长温度为 28 65 益袁在 45 60 益时生长最佳渊Jiang 等袁1993冤遥本研究将从嗜碱放线菌 Thermomonosporaamylolytica 中克隆获得的一个 茁-葡萄糖苷酶基因袁 命名为 tabg12a袁 并构建重组表达载体 pET-28a-tabg12a袁将其导入到大肠杆菌中进行克隆和异源表达袁对所获得的重组 茁-葡萄糖苷酶的酶学性质进行研究袁为 茁-葡萄糖苷酶在食品尧饲料和纤维素乙醇生产等领域的利用提供酶源储备遥1材料与方法1.1菌株和载体嗜热放线菌渊Thermomonosporaamylolytica冤为本课题组保存袁表达载体使用 pET-28a 渊+冤袁E.coli DH5琢 和 E.coli BL21 分别用于功能基因的克隆和表达遥56中国饲料2023 年第 17 期1.2主要试剂与仪器限制性内切酶 EcoR玉和Hind 芋购买自 Thermo Scientific遥 pEASY-无缝克隆和组装试剂盒尧DNA Marker尧DNA 聚合酶和胶回收纯化试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司遥 SDS-PAGE 变性丙烯酰胺凝胶快速制备盒以及 Ni-NTA 蛋白纯化试剂盒购自上海生物工程股份有限公司遥 葡萄糖测定试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司遥LB 基础培养基渊g/L冤院酵母提取物 5袁胰蛋白10袁氯化钠 10袁pH 7.4曰固体培养基添加 2%的琼脂袁121 kpa袁高温灭菌 30 min遥艾柯超纯水生成仪渊成都唐氏康宁科技发展有限集团冤尧电子分析天平渊水康市宙稳电子商务有限公司冤尧高压蒸汽灭菌锅渊上海博迅医疗生物仪器股份有限公司冤尧超净工作台渊济南鑫贝生物技术有限公司冤尧Haier 冰箱渊青岛海尔股份有限公司冤尧酶标仪 渊赛默飞世尔仪器有限公司冤尧 高速冷冻离心机渊上海安亭科学仪器公司冤尧超声波细胞破碎仪渊宁波新芝生物科技有限公司冤尧SPX-250B-D 型恒温振荡培养箱 渊上海一恒科学仪器有限公司冤尧Ep鄄pendorf PCR 仪 渊杭州柏恒科技有限公司冤尧BIO-RAD 电泳仪渊北京六一生物科技有限公司冤遥1.3试验方法1.3.1序列分析基于基因组注释从 T.amylolyt鄄ica基因组中预测到一个糖苷水解酶第三家族渊GH3冤茁-葡萄糖苷酶功能基因 渊NCBI NO.WP233358985.1冤袁使用 BLASTx 和 BLASTp 在线软件渊http院/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi冤 对其 DNA和蛋白质序列进行分析袁 并使用 SignalP 渊http院/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/冤对其信号肽进行预测遥通过 MEGA 7 软件采用最大似然方法渊ML冤和泊松校正模型构建系统发育树遥1.3.2目的基因的扩增使用 Primer 5.0 设计兼并 引 物 tabg12a-F院5爷-ATAGAATTCCAGGTC鄄CACGCCCGGACCGC-3爷袁tabg12a-R院5爷-TC鄄TAAGCTTTCAGGGGGCGGTGCAGGTGACG-3爷袁用于 PCR 扩增不含信号肽的功能基因片段渊划线区域分别为限制性内切酶 EcoR玉和 Hind 芋酶切位点序列冤遥 将提取的 T.amylolytica 的 DNA 作为模板袁扩增条件为预变性 94 益袁4 min袁变性 94 益袁30 s袁退火 55 益袁35 s袁延伸 72 益袁2 min袁32 个循环后袁最后延伸 72 益袁5 min遥 PCR 产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定袁并于紫外灯下观察袁利用胶回收试剂盒对 PCR 产物进行纯化袁具体操作步骤根据试剂盒说明书进行遥1.3.3重组表达载体的构建及转化使用限制性内切酶 EcoR玉和 Hind 芋对上述 PCR 产物和载体 pET-28a 进行双酶切遥 通过 T4-DNA 连接酶将酶切后的 PCR 产物和载体进行连接袁连接构建重组克隆质粒遥25 益反应 2 h袁获得连接产物加入 E.coli DH5琢 感受态中进行转化袁 通过菌落 PCR 筛选获得含有重组载体 pET-28a-tabg12a 的阳性克隆子袁并进行测序验证遥1.3.4重组蛋白的诱导表达将验证成功的重组载体 pET-28a-tabg12a 导入 E.coli BL21渊DE3冤中进行异源表达遥 在含 50 滋g/mL 卡那霉素抗性的LB 平板上活化后袁从平板上挑取单菌落接种于含50 滋g/mL 卡那霉素的 10 mL LB 液体培养基中袁37 益袁220 r/min袁过夜培养袁作为种子液遥 以 1%接种量袁 将种子液接种于含 50 滋g/mL 卡那霉素的100 mL LB 液体培养基中袁37 益袁180 r/min袁 培养2 3 h 至 OD600抑0.6袁加入异丙基-茁-D-硫代半乳糖苷渊IPTG冤至终浓度为 0.2 mmol袁再转入 25 益袁180 r/min 诱导表达 6 h遥将发酵液于 4 益袁8000 r/min离心 20 min袁弃上清袁收获菌体袁保存至-20 益冰箱袁备用遥1.3.5粗酶液的提取和鉴定使用 30 mL PBS缓冲液渊pH 7.6冤将上述菌体进行重悬袁置于冰水浴中进行超声破碎袁 裂解液于 4 益袁12000 r/min离心 30 min袁取上清液作为粗酶液进行酶学性质研究袁以相同处理含载体 pET-28a 的 E.coli BL21渊DE3冤 为对照遥 重组克隆子菌体使用 10%SDS-PAGE渊十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳冤进行电泳袁通过考马斯亮蓝染料 R-250 染色蛋白条带遥1.4酶学性质1.4.1茁-葡萄糖苷酶活性测定运用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶检测试剂盒检测 茁-葡萄糖苷酶的活力遥 检测底物为纤维二糖遥 取 10 滋L 稀释一定倍数的纯酶液加入到 180 滋L 含有 1%渊m/V冤纤维二糖的缓冲液中袁 在最适温度下反应 15 min后-80 益条件下冷冻 2 3 min 终止反应遥取 10 滋L反应混合液加入在 96 孔培养板中袁 加入 200 滋L57中国饲料2023 年第 17 期注院1.蛋白 Marker曰2.诱导前的 E.coli BL21渊DE3冤-pET-28a-tabg12a 的菌体曰3.IPTG 诱导后的E.coli BL21渊DE3冤-pET-28a-tabg12a的菌体遥图 2SDS-PAGE 胶图分析重组茁-葡萄糖苷酶 tabg12a图 1tabg12a 与邻近 茁-葡萄糖苷酶蛋白序列的系统发育关系葡萄糖氧化酶-过氧化物酶检测试剂盒缓冲液袁于 37 益孵育 10 min 后袁使用酶标仪在 492 nm 处测定其吸收值遥 一个单位渊U冤被定义为每分钟从纤维二糖中释放 2 滋moL 葡萄糖所需要的酶量遥每组试验设置 3 个平行遥1.4.2茁-葡萄糖苷酶最适反应温度的测定将粗酶液在 pH 7 条件下分别在 25尧30尧35尧40尧45尧50尧55尧60尧65尧70尧75 益中反应 10 min 后测定酶活力袁记录 茁-葡萄糖苷酶的最适反应温度遥1.4.3最适反应 pH 的测定将粗酶液在 45 益条件下分别在 pH 3尧3.6尧4尧4.6尧5尧5.6尧6尧6.6尧7尧7.6尧8的柠檬酸-磷酸氢二钠系列缓冲液以及 8尧8.6尧9尧9.6尧10 的甘氨酸-盐酸缓冲液中反应 10 min 后测定酶活力袁记录 茁-葡萄糖苷酶的最适反应 pH遥1.4.4热稳定性的测定将粗酶液分别放置于30尧35尧40尧45 益袁pH 为 5.6 条件下保温不同的时间渊0 120 min冤袁每 20 min 为一个梯度袁测定酶活力遥 以保温 0 min 室温下所测得的酶活为对照组袁其余温度下所测得的酶活与其相比袁记录 茁-葡萄糖苷酶保温处理后酶液残余酶活力遥1.4.5pH 稳定性的测定将粗酶液在 4 益条件下和 pH 为 3.0尧4.0尧5.0尧6.0尧7.0尧8.0尧9.0尧10.0 的缓冲液分别处理 24 h 后袁 取上述处理的酶液进行酶活力测定袁 以不做处理条件下所检测到的活性为对照组袁其余 pH 缓冲液处理后测得的酶活与其相比袁 记录 茁-葡萄糖苷酶处理后酶液残余酶活力遥1.4.6不同金属离子和抑制剂对 茁-葡萄糖苷酶活力的影响将粗酶液在 45 益分别加入不同的金属离子 渊K+尧Mg2+尧Fe3+尧Ca2+尧Zn2+尧Co2+尧Cu2+尧Ag+尧Mn2+尧Pb2+尧Ni2+冤袁直到浓度为 1 mmol/L和 10 mmol/L袁不同抑制剂乙二胺四乙酸二钠渊EDTA冤尧十二烷基硫酸钠渊SDS冤尧苯甲基磺酰氟渊PMSF冤和二硫苏糖醇渊DTT冤至浓度为 0.1%和 1%处理 10 min袁以未加入金属离子的酶液反应体系作为阳性对照组袁以未加入 茁-葡萄糖苷酶酶液反应体系为阴性对照袁记录 茁-葡萄糖苷酶处理后酶液残余酶活力遥2结果2.1序列分析在 T.amylolytica基因组中预测到一个 GH3 家族的 茁-葡萄糖苷酶功能基因渊NCBINO.WP 233358985.1冤袁 大小为 2211 bp袁 命名为tabg12a遥 通过信号肽分析在该蛋白 N 端渊1 32冤预测到一个信号肽袁并对不含信号肽的 DNA 片段渊2115 bp冤进行 PCR 扩增尧基因的克隆和异源表达遥如图 1 所示袁系统进化树分析表明袁该 茁-葡萄糖苷酶 tabg12a 与 Thermomonospora cellulosilytica来源的 茁-葡萄糖苷酶聚在一支遥2.2SDS-PAGE 电泳分析经 SDS-PAGE 电泳分析可得重组 茁-葡萄糖苷酶 tabg12a 在 63 75 KDa 处有较为明显的条带袁如图 2 所示袁与理论预测的蛋白分子量基本一致袁 说明其为重组的目的蛋白遥58中国饲料2023 年第 17 期图 3重组 茁-葡萄糖苷酶最适 pH图 4重组 茁-葡萄糖苷酶最适温度图 5重组 茁-葡萄糖苷酶 pH 稳定性图 6重组 茁-葡萄糖苷酶的热稳定性2.3酶学性质分析2.3.1重组蛋白酶的最适 pH酶易受 pH 的影响袁过酸或过碱的条件通常会使酶活力下降甚至失活遥如图 3 所示袁此放线菌来源的重组 茁-葡萄糖苷酶 tabg12a 在 pH 8.0 9.6 下保持 50%以上相对活性遥在 pH 8 的条件下达到最大活性袁pH 增大袁酶活性逐渐下降袁表明该酶最适反应 pH为 8遥2.3.2重组蛋白酶的最适温度如图 4 所示袁随着温度的升高袁酶活逐渐增高袁直至 45 益达到最大活性袁45 益后酶活以较快速度降低至 50%袁表明该酶最适温度为 45 益遥2.3.3重组蛋白酶的 pH 稳定性任何能够使酶的结构空间发生改变的因素都会影响到其稳定性袁pH 稳定性是 茁-葡萄糖苷酶很重要的一种属性袁由图 5 可知袁该酶在 pH 为 4.0 10.0 缓冲液孵育 24 h 后仍保持 80%以上的相对酶活袁表明该酶 pH 稳定性较强且具一定的耐受性遥2.3.4重组蛋白酶的热稳定性由图 6 可知袁该酶的热稳定性较好袁在 30 益下保温 2 h 酶活仍保持在原酶活的 70%以上袁在 35 益下保温 1 h 酶活仍具原酶活的 50%以上袁 其在 35 益下的半衰期为 80 min袁说明该酶在 30 35 益下稳定性较好遥2.3.5金属离子和抑制剂对酶稳定性的影响 如图 7 所示袁1 mmol/L 的金属离子 K+尧Mg2+尧Fe3+尧Ca2+具有较明显的促进作用袁而 1 mmol/L 的 Zn2+尧Ag+对酶活性有显著的抑制作用袁 其中 Ag+的抑制作用最为显著袁酶活基本为 0遥 10 mmol/L 时所有金属离子对 茁-葡萄糖苷酶活力都有一定的抑制作用袁 其中影响最明显的是 Ag+尧Zn2+尧Pb2+以及Mn2+遥 说明该 茁-葡萄糖苷酶需要依赖金属离子维持其活性遥如图 8 所示袁0.1%和 1%的 EDTA 对 茁-葡萄糖苷酶活力具有强烈的抑制作用袁其他抑制剂对其活性无显著影响袁1%的 SDS 也表现出对 茁-葡萄糖苷酶活力显著的抑制作用袁PSMF 和 DTT 对其活性也表现出抑制作用袁但相对酶活仍保持在70%遥3结论及讨论本论文对嗜热放线菌来源的 茁-葡萄糖苷酶利用大肠杆菌进行异源表达袁获得重组 茁-葡萄糖苷酶 tabg12a袁 实现酶高表达量和高活力遥 其tabg12a 最适反应 pH 为 8袁最适反应温度为45益袁此放线菌来源的重组 茁-葡萄糖苷酶tabg12a 在pH 为 4 10 孵育 24 h 残余酶活较高袁 表明该酶pH 稳定性较强遥 目前 茁-葡萄糖苷酶活性的研究表明袁 多数 茁-葡萄糖苷酶的最适pH 在 6.0 左右59中国饲料2023 年第 17 期图 8抑制剂对 茁-葡萄糖苷酶活性的影响渊朱凤妹等袁2014冤袁本研究中的tabg12a 茁-葡萄糖苷酶为高碱工业的应用提供了一定的酶源储备遥嗜热放线菌来源的 茁-葡萄糖苷酶 tabg12a 在30 35 益下稳定性较好遥 目前研究的 茁-葡萄糖苷酶中袁放线菌来源的较少遥 刘晴等渊2014冤研究的腾冲嗜热厌氧杆菌来源的 6-磷酸-茁-葡萄糖苷酶在70 益尧pH 4 10 条件下表现出良好的稳定性遥 余奕宏等渊2021冤研究的嗜酸乳杆菌来源的 GIM1.208茁-葡萄糖苷酶在 20 50 益尧pH 2.2 6.0 有较高的稳定性遥 郭金玲等渊2021冤研究的黑曲霉来源的 茁-葡萄糖苷酶在 30 50 益袁pH 2.0 8.0 具有较好的稳定性遥金属离子 Ag+尧Zn2+尧Pb2+尧Mn2+以及金属螯合剂 EDTA尧SDS 作为其嗜热放线菌来源 茁-葡萄糖苷酶 tabg12a 的抑制剂袁根据谢宇等渊2008冤报道来源于曲霉的 茁-葡萄糖苷酶袁K+尧Na+尧Mg2+和 Zn2+对其有激活作用袁 而 Ag+和 Fe2+对其具有明显的抑制作用遥来自黑曲霉 渊Aspergillus sp.NL-1冤的 茁-葡萄糖苷酶袁Ag+对该酶具有强的抑制作用 渊赵林果等袁2007冤袁与本研究的放线菌来源的重组茁-葡萄糖苷酶 tabg12a 的结果相似遥 可能是由于金属离子改变了酶的构象从而抑制了酶的活性袁EDTA 作为金属螯合剂袁可能需要二价阳离子参与反应袁表明其酶需要依靠金属离子维持其活性袁在工业应用过程中应该避免加入这些抑制剂遥茁-葡萄糖苷酶的重要作用已日益被重视渊李淑彬等袁2003冤袁由于在工业生产中热稳定性高的酶比普通酶有更有优势渊裴雯雯等袁2021冤袁作为纤维素酶类的关键酶袁 热稳定性高以及 pH耐受范围广泛能够更有效地提高纤维素的降解效率袁 在动物饲料中添加适合比例的酶可提高饲料利用率袁能够有效促进动物生长尧减少粪便排放并在改善生态环境和防治动物疾病等方而均有明显效果袁同时避免了因添加抗生素尧激素等物质对动物产生的不良影响 渊刘大森等袁2011冤袁因此袁获得热稳定性高的 茁-葡萄糖苷酶越来越成为一种趋势遥 本论文研究中运用基因克隆尧 异源表达手段所获得的重组酶的热稳定性高袁在工业生产尧食品加工尧饲料和纺织工业等都占据重要地位袁 为提高人类对纤维素的资源利用率具有非常大的应用价值遥图 7不同离子对 茁-葡萄糖苷酶活性的影响10 mmol/L1 mmol/L60中国饲料2023 年第 17 期Cloning袁heterologous expression and characterization of a basophilic茁-glucosidase fromHUANG Yuying袁LI Xinwei袁LI Lei袁ZHU Qian袁RAO Mengdi袁YIN Yirui*渊College of Agronomy and Biological Sciences袁Dali University袁Dali袁Yunnan Province 671003袁China冤Abstract 茁-glucosidase can catalyze the hydrolysis of cellobiose to glucose袁which has been widelyused in medicine袁agriculture袁food袁feed and other fields.Here袁a basophilic 茁-glucosidase gene 渊denominatedtabg12a冤 was obtained from Thermomonospora amylolytica.The gene was successfully cloned and heterologousexpressed in E.coli袁and its enzymatic properties were characterized.The results showed that tabg12aexhibited optimal activity at pH 8.0 and 45 益袁respectively.It maintained more than 50%relative activity atpH 8.0 9.6袁more than 80%relative enzyme activity after 24 h incubation in pH 4.0 10.0袁more than 70%relative enzyme activity after incubation at 30 益 for 2 h袁and more than 50%relative enzyme activity afterincubation at 35 益 for 1 h.1 mmol/L of K+and Ca2+could promote its activity to 120%.The relative activityremained 100%in the presence of 0.1%SDS and 1 mmol/L Cu2+.These properties indicated that tabg12a hadpotential applications in food袁feed and cellulosic ethanol production etc.Key words 茁-glucosidase曰Thermomonospora amylolytic曰heterologous expression曰basophile曰enzymaticproperties参考文献1 郭金玲袁陈程鹏袁周一郎袁等.黑曲霉 茁-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究J.中国酿造袁2021袁40渊2冤院83 87.2 韩笑袁陈介南袁王义强袁等.茁-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达研究进展J.生物技术通报袁2008袁3院8 12.3 来亚鹏袁刘刚袁王娟袁等.嗜热真菌 茁-葡萄糖苷酶基因克隆表达与调控的研究进展J.纤维素科学与技术袁2017袁25渊2冤院69 76.4 李淑彬袁陆广欣袁林如妹袁等.嗜热菌要工业用酶的新来源J.中国生物工程杂志袁2003袁23渊7冤院67 71.5 刘大森袁鞠涛袁杨方袁等.纤维素酶在反刍动物饲料中的应用研究进展J.东北农业大学学报袁2011袁42渊6冤院7 11.6 刘晴袁 张宇微袁 张宇宏袁 等.热稳定 6-磷酸-茁-葡萄糖苷酶TteBglB 异源表达尧分离纯化及酶学性质分析J.中国农业科技导报袁2014袁16渊6冤院52 58.7 倪嘉璐袁张琪琳袁沈利峰袁等.茁-葡萄糖苷酶产生菌的筛选及发酵培养基优化J.浙江树人大学学报院自然科学版袁2010袁1院22 26.8 裴雯雯袁曾艳袁刘娟娟袁等.茁-葡萄糖苷酶的枯草芽孢杆菌表达尧酶学性质分析及其在宝藿苷玉制备中的应用J.食品工业科技袁2022袁43渊6冤院133 140.9 谢宇袁尚晓娴袁胡金刚袁等.茁-葡萄糖苷酶纯化及酶学性质研究J.江西农业大学学报袁2008袁3院521 524.10 姚瑶袁霍元鹏袁周伟袁等.高产 茁-葡萄糖苷酶菌株的筛选及产酶条件优化J.江西农业学报袁2018袁30渊3冤院97 101.11 余奕宏袁丁小娟袁丁筑红袁等.嗜酸乳杆菌 GIM1.208 茁-葡萄糖苷酶的异源表达尧纯化及酶学性质研究J.生物化学与生物物理进展袁2021袁48渊1冤院88 99.12 张媛媛袁苏敏袁朴春红袁等.微生物来源的 茁-葡萄糖苷酶在食品工业中应用进展J.食品工业科技袁2019袁40渊16冤院329 33513 朱凤妹袁彭丽莎袁李军袁等.茁-葡萄糖苷酶基因克隆及在丝状真菌中高效表达的研究进展J.食品安全质量检测学报袁2014袁10渊5冤院3052 3058.14 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