NY∕T 3074-2017 牛流行热诊断技术(农业).pdf

ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3074一2017牛流行热诊断技术Diagnostic techniques for bovine ephemeral fever 2017 -06-12发布2017 - 10一01实施中华人民共和国农业部发布刚昌本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由农业部兽医局提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会CSAC/TC181)归口。本标准起草单位:中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人:郑福英、殷宏、刘永生、宫晓炜、陈启伟、高闪电。NY/T 3074-2017 I NY/T 3074-2017 引本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及附录B与牛流行热病毒间接ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性该专利持有人已向本文件的就专利授权许可进行谈判。联系方式获得:专利持有人姓名:地址:甘肃省兰请注意除利的责任。按NY/T体进行定性和不能进行定应用。H 立场。合理且元歧视的条款和条件下，。相关信息可以通过以下热病毒血清抗 ，而技术可同时牛流行热诊断技术1 范围本标准规定了牛流行热的临床诊断和实验室诊断的技术要求。本标准适用于牛流行热的诊断。2 规范性引用文件NY/T 3074-2017 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求NY/ T 543- 2002 牛流行热微量中和试验方法3 生物安全措施进行牛流行热实验室诊断时，如病毒分离、血清处理等，按照GB19489的规定执行。4 临床诊断4. 1 流行特点4. 1. 1 以3岁5岁壮年牛多发，奶牛、黄牛易感性最强。4. 1.2 通过媒介昆虫叮咬呈病毒血症的病牛，再叮咬易感牛传播扩散，多发生于夏末秋初蚊虫活跃的多雨季节。4. 1.3 呈跳跃式传播，疫区与疫区之间交叉存在无病的清洁区。4. 1.4 有一定的周期性，间隔时间为1年7年不等。4. 1.5 发病率高、死亡率低，在没有继发感染的情况下病牛多为良性经过。4. 2 临床症状4.2. 1 病牛表现为突发高热，体温高达39.50C42. 50C，持续2d3 d。4. 2. 2 病牛流泪、畏光，眼结膜充血;有鼻炎性分泌物;口腔发炎、流涎;呼吸急促、困难。4. 2. 3 高热期病牛食欲废绝，反色停止，瘤胃服胀、蠕动停止，便秘或腹泻。4. 2. 4 娃振母牛可发生流产、死胎。4. 2. 5 乳牛的产乳量明显降低，甚至停止。4.3 剖检病变4.3. 1 主要病变在肺部，急性死亡的病例可见有明显的肺间质气肿，有些病例可见肺充血与水肿。4.3.2 淋巴结充血、肿胀;真胃、小肠和盲肠呈卡他性炎症和渗出性出血。4. 4 结果判定符合4.1流行特点，病牛出现4.2临床症状和4.3剖检病变，判为疑似牛流行热。5 实验室诊断5. 1 样品采集与储存5. 1. 1 样品的采集NY/T 3074-2017 选择处于发热期(体温39.5.C42. 5.C)的活畜采集样品，从其颈静脉无菌采集2管肝素抗凝血，每管5mL6 mL;另外，再采集5mL6 mL血液收集到血清管中，用于分离血清。5. 1.2 样晶的储存5. 1.2. 1 样品采集后，置于冰上冷藏送至实验室。5. 1.2.2 2管肝素抗凝血，1管置于4.C冷藏，另外1管冻存于一80.C。5. 1.2.3 将血清管稍倾斜放于37.C温箱内，保温2h;然后，3000r/ min离心10mino吸取血清，转移到另外的无菌1.5 mL离心管中，冻存于一20.C。5. 2 器械与设备组织破碎仪、低翩翩心伊阳、全自动凝胶成像系统、恒温培养箱、洗瓶或者洗板机、5. 3 牛流行热病毒分50L容量的A.l)、牛白细5.3.2样5. 3. 3. 1 接种1日即可。5. 3. 3. 1.2 5. 3. 3. 1. 3 -80.C。接种5.3. 3. 2 传代5. 3. 3. 2. 1用颅骨。5.3. 3. 2. 2 用另一管中，在天平上称离心10min，取上清再接种乳鼠。5. 3. 4 观察结果mL容量的灭菌离心第1代接种乳鼠在接种后10d12 d死亡，死前元明显症状。第2代接种乳鼠在接种后5d7 d 死亡，死亡前表现后腿麻痹，常倒向一侧。从第3代开始，接种乳鼠在接种后3d5 d有规律地集中死亡，死前主要表现为神经症状，颤抖，后腿麻痹，步态不稳，常倒向一侧，皮肤痊孪性收缩，多数经1d2d死亡。5. 3. 5 病毒鉴定将盲传至3代5代的乳鼠脑组织，按照5.3.3.2的步骤处理，取上清，参照5.4做进一步鉴定。5. 3. 6 结果判定接种乳鼠出现临床神经症状，并且参照5.4鉴定结果阳性，判定为牛流行热病毒分离阳性;否则，判2 定为牛流行热病毒分离阴性。5.4 RT-PCR方法5.4. 1 试验材料NY/T 3074-2017 去离子水、DEPC水、病毒RNA提取试剂盒、一步法RT-PCR 试剂盒、DL2000 DNA分子质量标准、琼脂糖、TAE缓冲液、引物(浓度为25pmol/L)。相关溶液的配制方法见附录A。可以采用引物420F/ 420 R用于牛流行热病毒核酸的检测，引物的靶基因、序列和扩增产物的大小见表1。目的正向引物反向引物5.4.2 RNA提取表1RT-PCR检测牛流行热病毒核酸的引物靶基因糖蛋白(G)基因糖蛋白(G)基因序列(5-3) AGAGCTTGGTGTGAATAC CCAACCTACAACAGCAGA 产物大小420 bp 含有牛流行热病毒的肝素抗凝血(冷藏或冻存的均可)作为阳性对照样本，采自健康牛(未感染牛流行热病毒或接种牛流行热病毒疫苗)的抗凝血作为阴性对照样本。用病毒RNA提取试剂盒从阳性对照样本、阴性对照样本和待检样本中提取病毒RNA，提取步骤按照试剂盒说明书进行。提取的病毒RNA立即进行RT-PCR扩增或冻存于-800C备用。5.4.3 RT-PCR反应5. 4. 3. 1 用商品化一步法RT-PCR试剂盒进行扩增，反应体系为50L。按照说明书配制试剂盒中的各种成分，再加人1L正向引物420F、lL反向引物420R、5LRNA模板，用DEPCJj(补足至50L。5.4.3.2 每次进行RT-PCR反应时均设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照用阳性对照样本的病毒RNA作为模板，阴性对照用阴性对照样本的病毒RNA作为模板，空白对照用DEPC水作为模板。5. 4. 3. 3 RT -PCR扩增程序为:500C 30 min, 940C 2 min, 35个循环(940C20 s, 460C 1 min, 720C 30 s)，最后720C10 min。5.4.4 RT-PCR产物的电泳RT-PCR反应结束后，取RT-PCR产物8L、DL2000分子质量标准5L ，在1%琼脂糖凝胶中进行电泳。以100mA电泳20min，然后用凝胶成像系统观察结果并拍照保存。5. 4. 5 质控标准阳性对照出现一条420bp的特异性扩增条带，阴性对照和空白对照元420bp的扩增条带，说明试验成立。5. 4. 6 结果判定被检样品出现一条420bp的特异性扩增条带，判为RT-PCR结果阳性，判定检出牛流行热病毒核酸。被检样品元420bp的特异性扩增条带，判为RT-PCR结果阴性，判定未检出牛流行热病毒。5.5 间接ELISA方法5.5. 1 试验材料牛流行热病毒重组G蛋白抗原(制备方法见附录B)、标准阳性对照血清(制备方法见附录C)、标准阴性对照血清(制备方法见附录D)、商品化辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗牛IgG抗体、血清稀释液、TMB底物溶液、包被液、封闭液、PBST洗涤液、终止液、一次性封板膜、酶标板。相关试剂的配制方法见附录E.5. 5. 2 操作步骤3 NY/T 3074-2017 5.5.2. 1 抗原包被用包被缓冲液将牛流行热病毒重组G蛋白抗原稀释至1.5g/mL，100L/孔包被酶标板，37C吸附1h，转人40C吸附12h16h。翌日甩掉孔内液体，每孔加300L洗涤液，洗涤3次，每次1min，最后一次拍干。5. 5. 2. 2 封闭酶标板加人封闭液，每孔100L，用封口膜封口，37C孵育30min。然后，取掉封口膜，甩掉孔内液体，每孔加300L洗涤液，洗涤3次，每次1min，最后一次拍干。5.5.2.3 加入血清加人血清稀释液，每孔9010L，海匀。用封口膜封口，液，洗涤3次，每次1min 5.5.2.4 加入HRP加人工作浓度取掉封口膜，5/P二三O.血清学可疑;6 综合判定凡具有5.3. 6、热病毒抗体血清学4 育30mino然后，干。A. 1 pH 7. 4 PBS的配制NaCl KCl KHzP04 NazHP04 12 加人去离子水7.4，121.C、30A.2 A.3 Tris碱EDTA 冰醋酸加入去应用前，NY/T 3074-2017 附录A(规范性附录)RT-PCR试验溶液的配制5 NY/ T 3074-2017 附录B(规范性附录)牛流行热病毒重组G蛋白抗原的制备B. 1 器械与设备超声波细胞破碎仪、恒温摇床、制冰机、紫外可见分光光度计。B. 2 试验材料引物420FG/420FR(25pmol/L)、Nde1限制性内切酶、Xho1限制性内切酶、T4DNA连接酶、琼脂糖凝胶DNA提取试齐盒、pET-30a质粒、感受态大肠杆菌BL21(DE3)、5mg/mL卡那霉素、异丙基- -D-Wit代毗喃半乳糖昔CIPTG)、His标签蛋白纯化试剂盒、LB培养基、一次性针头滤器(孔径0.45m)。B. 3 引物序列上游引物420FG:5-GCA CATATG AGA GCT TGG TGT GAA TAC-3; Nde 1 下游引物420RG:5-CTA CTCGAG CCA ACC TAC AAC AGC AGA - 3 0 Xho 1 上游引物420FG位于牛流行热病毒糖蛋白(G)基因的1168bp1185 bp，5端加了Nde1限制性内切酶酶切位点和3个保护性碱基;下游引物420RG位于牛流行热病毒G基因的1570 bp 1 587坤，5端加了Xho1限制性内切酶酶切位点和3个保护性碱基。B. 4 表达载体的构建和鉴定B. 4. 1 扩增、回收PCR产物除了将引物420F/420R更换为420FG/420RG外，扩增方法如5.4.3，用牛流行热病毒RNA作为模板。扩增结束后，用商品化琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒纯化回收合适大小的PCR产物。B. 4. 2 双酶切PCR产物和pET-30a质粒酶切体系30L:B.4.1中回收的PCR产物23L，10 X H Buffer 3L，Nde 1和Xho1各2L，3rc水浴3h5 h，以1%琼脂糖凝胶进行电泳，回收酶切后的PCR产物。同时将pET-30a质粒双酶切，将PCR产物替换为pET-30a质粒，其他条件均与双酶切PCR产物的条件相同，回收酶切后的pET-30a质粒片段。B. 4. 3 双酶切后的PCR产物与pET-30a质粒片段连接连接体系10L:B.4. 2中的PCR产物6L，pET-30a质粒片段2L，T4DNA连接酶lL，10XLigation Buffer 1L，160C连接7h8 h。将连接产物转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞中(操作步骤根据说明书进行)，涂布到含卡那霉素(50g/mL)的LB平板上，370C培养12h15 h，挑取平板上大小均一的白色单菌落，分别接种在5mL含卡那霉素(50g/mL)的LB液体培养基中，200r/ min, 370C振荡培养至菌液OD600值为1.01. 20 B.4. 4 阳性菌株的鉴定将B.4.3中的菌液送相关公司测序，测序结果正确，判定为阳性菌株。6 NY/T 3074一2017B.5 目的蛋白的表达和纯化B. 5. 1 取B.4.4中阳性菌株的菌液，以1: 100的比例转接到含卡那霉素(50g/mL)的500mLLB培养基中，370C200 r/ min震荡培养至菌液OD6值O.60. 8，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，诱导培养5h。B. 5. 2 将以上菌液分装到250mL容量的离心管中，在40C6000 r/min离心10min，弃上清。B. 5. 3 用10mL pH 7. 4 PBS重悬沉淀，充分吹散混匀，转移到50mL容量的离心管中，在40C6000 r/min离心10min，弃上清。B. 5. 4用15mL pH 7.4 PBS 仪中，以超声5s间隔1s B. 5. 5将B. 5. 6用His书操作。B. 5. 7 纯化后B. 5. 8 用紫外B. 5. 9 用高中，再放到超声波细胞破碎1次。7 NY/T 3074一2017附录C(规范性附录)标准阳性对照血清的制备C.1 实验用牛的选择选取1头1岁1.5岁的健康黄牛，攻毒前采集其肝素抗凝血和血清样本，按照本标准5.4的要求从抗凝血中检测牛流行热病毒核酸，应为阴性;按照牛流行热微量中和试验方法从血清中检测牛流行热病毒抗体，应为阴性。C.2 牛流行热病毒攻毒试验静脉接种5mL含有牛流行热病毒的抗凝血，间隔2周后做第二次接种，以后每间隔1周接种一次，共接种4次。接种剂量分别为5mL、10mL、15mL、20mL。C.3 血清中和抗体效价的检测在末次接种2周后采集血清，用牛流行热微量中和试验方法测定血清中和抗体效价，效价二三1: 128 符合要求。C.4 标准阳性血清的收集颈动脉放血直至牛死亡，收集全部血液至多个250mL容量的离心管中，旋紧盖子，室温过夜，4000r/min离心15min，取血清即为标准阳性血清，置于一40.C保存备用。8 D. 1 实验用牛的选择选取1头1岁-1.5岁的从抗凝血中检测牛病毒抗体，应为阴性。D.2 附录D(规范性附录)牛流行热病毒标准阴性血清的制备NY/T 3074-2017 本，按照本标准5.4的规定清中检测牛流行热9 NY/T 3074-2017 附录E(规范性附录)间接ELISA试验溶液的配制E.1 包被缓冲液Na2C03 0. 318 g NaHC03 O. 588 g 去离子水200 mL 将Na2C03和NaHC03加入去离子水中，完全溶解后，用0.45m一次性针头滤器过滤除菌，室温保存备用。E.2 洗涤液pH 7.4 PBS 1000 mL 吐温-20 0. 5 mL 将0.5mL吐温20加入1000 mL pH 7.4 PBS溶液中，混匀后使用。E.3 封闭液马血清5mL pH7.4PBS 95mL 将马血清加入pH7.4PBS中混匀，40C保存。E.4 终止液(2mol/L H2804) 浓H2S0411. 1 mL 去离子水88.9 mL 将浓H2S04缓慢加入到去离子水中，混匀，冷却至室温。10 NY 中华人民共和国农业行业标准牛流行热诊断技术NY/ T 3074- 2017 * 并争等中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码100125网址vrwvv.ccap. COD1. cn) 北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销争e争导长开本880rnrnX1230rnrn 1/16 印张1字数20千字2017年9月第1版2017年9月北京第1次印刷书号16109 4212 定价24.00元版权专有侵权必究举报电话[phone]