SPE-HPLC法测定葡萄糖注射液中4种外源性抗氧剂的含量.pdf

第46 卷第10 期2023年10 月遵义医科大学学报Journal of Zunyi Medical UniversityVol.46No.100ct.2023技术与方法SPE-HPLC法测定葡萄糖注射液中4种外源性抗氧剂的含量鹿广玲12，费梅芳,莫利花3张建永1,段灿灿2（1.遵义医科大学药学院，贵州遵义56 30 9 9；2.遵义医科大学基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州遵义56 30 9 9;3.贵州天地药业有限责任公司，贵州兴义56 2 40 0）摘要】目的建立固相萃取-高效液相色谱（SPE-HPLC）法测定直立式聚丙烯输液袋装葡萄糖注射液中抗氧剂10 10、330、10 7 6 及16 8 的含量。方法葡萄糖注射液采用固相萃取柱净化、富集,4mL甲醇与5mL二氯甲烷作为洗脱溶剂，以乙-四氢呋喃-水（6 3:30:7）为流动相，使用WelchXB-Cis色谱柱（4.6 mm250mm,5m）分离，使用紫外可变波长检测器，进样体积为2 0 L,检测波长为2 8 0 nm，外标法定量。结果抗氧剂10 10、330、10 7 6 及16 8 分别在2.455 2 45.49 0 g/mL、2.480247.995g/mL、4.9 0 0 49 0.0 0 0 g/mL和4.9 0 0 49 0.0 0 0 g/mL相关系数均0.9 9 9 8;回收率分别为8 4.6 0%95.42%(RSD:3.83%)、8 5.40%9 6.0 8%（R SD:3.7 5%）)、8 9.2 6%10 0.8 9%(R SD:3.9 3%)、9 1.8 8%10 3.2 6%（R SD:3.38%）。结论方法易于操作且结果可靠，可用于直立式聚丙烯输液袋装葡萄糖注射液中抗氧剂10 10、330、10 7 6 及168 的含量测定。【关键词固相萃取；高效液相色谱法；直立式聚丙烯输液袋；葡萄糖注射液；抗氧剂中图法分类号 R917【文献标志码A文章编号】2 0 9 6-8 159(2 0 2 3)10-10 0 3-0 6Determination of 4 kinds of exogenous antioxidants in glucose injection by SPE-HPLCLu Guangling2,Fei Meifang,Mo Lihua,Zhang Jianyong2,Duan Cancan?2(1.School of Pharmacy,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China;2.Key Laboratory of BasicPharmacology of Ministry of Education and Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Ministryof Education,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China;3.Guizhou Tiandi PharmaceuticalCompany Limited,Xingyi Guizhou 562400,China)Abstract Objective To establish an solid-phase extraction high performance liquid chromatography method fordetermination of antioxidant 1010,330,1076 and 168 in glucose injection with vertical polypropylene infusionbag.Methods A solid-phase extraction column was used with eluent(4 mL of methanol and 5 mL of dichlo-romethane)for purification and enrichment of glucose injection,acetonitrile-tetrahydrofuran-water(63:30:7)was used as mobile phase,and a Welch XB-Cig analytical column(4.6 mm 250 mm,5 m)was used for sepa-ration.Detection was performed using a UV variable wavelength detector at a wavelength of 280 nm.The injec-tion volume was 20 L,and it was quantified using an external standard method.Results For antioxidant 1010,330,1076 and 168,the detection range was 2.455-245.490 g/mL,2.480-247.995 g/mL,4.900-490.000 g/mL and 4.900-490.000 g/mL,respectively,with a correlation coefficients were 0.999 8.Therecovery rates for antioxidant 1010,330,1076 and 168 in the determination method were 84.60%-95.42%(RSD:3.83%),85.40%-96.08%(RSD:3.75%),89.26%-100.89%(RSD:3.93%)and 91.88%-103.26%(RSD:3.38%),respectively.Conclusion This method is convenient and reliable,so it could be基金项目】贵州省科技厅创新人才团队NO：黔科合平台人才（2 0 2 0）50 0 7 】；遵义市科技计划项目NO：遵市科人平台（2 0 2 0)7 ；遵义市优秀青年科技创新人才培养项目NO：遵优青科（2 0 2 1)3号。【通信作者张建永，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：药物分析，E-mail：z h a n g j i a n y o n g 2 0 0 6 12 6.c o m；段灿灿，女，硕士，讲师，研究方向：药物分析，E-mail：d u a n c a n c a n 2 0 0 8 12 6.c o m。:1003.遵义医科大学学报used for determination of antioxidant 1010,330,1076 and 168 in glucose injection with vertical polypropyleneinfusion bag.Key words solid-phase extraction;high performance liquid chromatography;vertical polypropylene infusionbag;glucose injection;antioxidant46卷葡萄糖注射液在医药领域应用广泛，可用于调节电解质、水盐及酸碱平衡，补充体液和能量,治疗低血糖症、高钾血症,还可用作药物稀释剂 等。目前葡萄糖注射液产品常见的包装有玻璃瓶、塑料瓶、非聚氯乙烯软袋、直立式聚丙烯输液袋,其中直立式聚丙烯输液袋可直立放置，更加符合使用习惯,且一般认为材料无毒无味、性质稳定、生产成本低,比其他包装材料更具有适用性和经济性2 。然而直立式聚丙烯输液袋作为药液的包装材料,生产过程中为改进其性能往往需要添加一些辅助材料，如抗氧剂，然而这种抗氧剂是否会迁移到药液中，需要进一步分析。化学药品注射剂与塑料包装材料相容性研究技术指导原则（试行）中表1抗氧剂信息商品名化学名称抗氧剂10 10四-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸 季戊四醇酯抗氧剂3301,3,5-三甲基-2,4,6-三(3,5-二叔丁基4-羟基基)苯抗氧剂10 7 6-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯抗氧剂16 8三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸酯1材料和方法1.1材料1.1.1仪器固相萃取柱（深圳逗点生物技术有限公司,Cis-SPE,500mg/6mL）；高效液相色谱仪（日本岛津公司,LC-2010AHT）;电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，AE240）；二级反渗透装置（山东华周制药设备有限责任公司，FST18000）；超声仪（江苏超声仪器有限公司，KQ-500DA）。1.1.2?试剂乙腈、四氢呋喃、甲醇均为色谱纯;二氯甲烷为分析纯；水为纯化水；对照品信息见表2。表2 对照品信息抗氧剂批号纯度(%)1010M08A7D12647330Y02A9C576421076Y30M9S57404168K09A7Y128361.1.3样品直直立式聚丙烯输液袋装葡萄糖注射液（贵州天地药业有限责任公司生产提供，批号：:1004:要求,应重点考察聚丙烯包装材料中所含添加剂的迁移对药物的影响34。有文献报道注射剂在与聚丙烯材料长期接触的过程中,抗氧剂可能发生迁移,从而对人体健康产生不良影响5。目前生产中常用的抗氧剂包括抗氧剂10 10、330、10 7 6、16 8等6 （表1）。然而目前中国药典中尚未规定注射用药品中抗氧剂迁移量的测定方法。为确保临床用药安全，本研究拟建立并验证固相萃取-高效液相色谱法（solid-phase extraction high performanceliquid chromatography,SPE-HPLC)方法测定直立式聚丙烯输液袋装葡萄糖注射液中4种抗氧剂含量，以期为考察直立式聚丙烯输液袋装葡萄糖注射液中抗氧剂的迁移提供科学依据。分子式C73 Hios O12Cs4 H7s 0;C.sHo2 0;C4,H:O,PDC21110901,DB21112501,DB21112601,DB21112701)。1.2方法1.2.1色谱条件色谱柱：WelchXB-Cis（4.6 m m250mm,5m）);柱温：30;检测波长:2 8 0 nm;流动相：乙腈-四氢呋喃-水（6 3：30：7）；流速：1.5mL/min;进样体积:2 0 L。1.2.2对照品储备溶液的制备分别取抗氧剂1010,330各50 mg，抗氧剂16 8、10 7 6 各10 0 mg，使用电子天平精密称定后，以混合液（乙腈：四氢呋喃=1:1)溶解后定容至10 0 mL,即得。1.2.3对照品溶液的制备精密量取“1.2.2”中对照品储备溶液10 mL,以混合液（乙腈：四氢呋喃厂家=1:1)稀释后定容至10 0 mL,即得。98上海源叶生物科技有限公司99上海源叶生物科技有限公司98上海源叶生物科技有限公司98上海源叶生物科技有限公司CAS编号6683-19-81709-70-22082-79-331570-04-41.2.4供试品溶液的制备精密量取10 0 mL葡萄糖注射液,取出固相萃取柱,以4 mL甲醇和4 mL水依次进行活化,将上述葡萄糖注射液以1.52mL/min 的流速过柱,待固相萃取柱挥干后,再依次用4mL甲醇,5mL二氯甲烷洗脱，收集洗脱液,置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容,经34人10期0.45m滤膜过滤，即得。1.2.5葡萄糖注射液加标样品溶液的制备量取3份葡萄糖注射液适量置于10 0 mL容量瓶，分别加人对照品储备溶液10 0 2 0 0、40 0 L并用葡萄糖注射液定容后，按“1.2.4”中的方法进行溶液制备，即分别得到葡萄糖注射液加标样品1、2、3。2结果2.1专属性分别取空白溶剂（甲醇：二氯甲烷A501B5014040330230N201N201010005A：空白溶剂;B：对照品溶液；C：葡萄糖注射液加标样品溶液；标识峰：1为抗氧剂10 10,2 为抗氧剂330，3为抗氧剂1076;4 为抗氧剂 16 8。2.2线性关系取对照品储备液加混合液（乙腈:四氢呋喃=1:1)稀释,制成抗氧剂10 10 浓度分别为2.455、12.2 7 5、2 4.549、49.0 9 8、147.2 9 4、245.490g/mL；抗氧剂330 浓度分别为2.48 0、12.40024.800、49.59 9、148.7 9 7、2 47.9 9 5 g/mL;抗氧剂10 7 6 浓度分别为4.9 0 0、2 4.50 0、49.0 0 0、98.000、2 9 4.0 0 0、49 0.0 0 0 g/mL;抗氧剂16 8 浓度分别为4.9 0 0、2 4.50 0、49.0 0 0、9 8.0 0 0、2 9 4.0 0 0、490.000g/mL的线性溶液。将6 种不同浓度的抗氧剂混合液，按“1.2.1”规定的色谱条件进行HPLC分析,并分别记录色谱图,绘制标准曲线时表34种抗氧剂的回归方程、相关系数、检出限及定量限抗氧剂T1010y=4 480.1x+2 237.9330y=6 661.4x+7 213.41076y=2 571.6x+1 185.8168y=3 109.2x+6 999.72.4重复性试验米精密称取同一批供试品（批号：DC21110901），按“1.2.5”项下方法平行制备6份葡萄糖注射液加标样品2,按“1.2.1”规定的色谱条件进行HPLC分析，记录色谱图。抗氧剂1010、330、10 7 6 和16 8 含量测定结果的RSD分别为2.0 4%、2.35%、2.48%和2.7 9%，表明方法具鹿广玲等SPE-HPLC法测定葡萄糖注射液中4种外源性抗氧剂的含量究建立的方法具有较好的专属性（图1）。C 501402230220101015t(min)回归方程=1:1）、对照品溶液、葡萄糖注射液加标样品溶液按“1.2.1”规定的色谱条件进行HPLC分析，记录色谱图。结果显示葡萄糖注射液加标样品溶液的色谱峰保留时间与对照品溶液基本一致,抗氧剂1010（4.7 2 5m i n）抗氧剂330（6.38 3min）、抗氧剂1076（12.453m i n）、抗氧剂16 8(14.8 31min）,且分离度均大于1.5,理论塔板数均大于7 0 0 0；空白溶剂在相应的保留时间内未检测到色谱峰,表明本研200图1高效液相色谱以样品的进样浓度与色谱图峰面积分别为横、纵坐标。结果显示：4种抗氧剂分别在2.455 2 45.49 0g/mL2.480 247.995 g/mL、4.9 0 0 49 0.0 0 0g/mL和4.9 0 0 49 0.0 0 0 g/mL内,浓度与峰面积呈现良好的线性关系（表3）。2.3检测限与定量限取4种抗氧剂的标准品适量,精密称定后加混合液（乙腈：四氢呋喃=1:1）逐级稀释,稀释后的样品均按“1.2.1”规定的色谱条件进样，记录色谱图，以信噪比约为10：1、5：1时，分别计算定量限、检测限（表3）。LOD(g/mL)0.999 90.4910.999 80.4960.999 90.9800.999 80.980有良好的重复性。2.5?中间精密度试验在不同时间，由不同人员分别精密称取同一批供试品（批号：DC21110901），按“1.2.5”项下方法，由2 名操作人员各平行制备6份葡萄糖注射液加标样品2,按“1.2.1”规定的色谱条件分别用LC-2010AHT高效液相色谱仪（日:1005.510t(min)152005t(min)LOQ(g/mL)0.9820.9921.9601.960101520遵义医科大学学报本岛津公司）与SPD-20A高效液相色谱仪（日本岛葡萄糖注射液加标样品1、2、3,每个浓度的葡萄糖津公司）进行HPLC分析，记录色谱图。抗氧剂注射液加标样品平行制备3份，按“1.2.1”规定的1010、330、10 7 6 和16 8 计2 次含量测定结果的色谱条件进行HPLC分析，记录色谱图（表4）。RSD分别为2.40%、2.17%、1.9 6%和2.6 2%，表2.7样品的加速试验本实验测得3个批号的葡明方法具有良好的中间精密度。萄糖注射液产品及其稳定性考察样品中抗氧剂2.6回收率试验按“1.2.5 项下方法分别制备1010、330、10 7 6 和16 8 的含量均低于检测限（表5）。表4回收率试验结果(n=9)抗氧剂加标量(g/mL)12.275101024.54949.09812.40033024.80049.59924.500107649.00098.00024.50016849.00098.00046卷测定值(g/mL)回收率(%)10.38584.6010.38984.6410.46585.2521.24686.5521.46187.4221.49887.5746.84895.4243.57688.7542.11485.7810.58985.4010.62685.6910.66686.0221.56986.9721.72487.6021.77587.8047.65696.0844.42589.5742.94986.5922.07890.1121.86989.2622.20590.6344.27490.3644.77591.3844.74891.3298.869100.8991.37493.2487.49489.2823.07394.1823.09594.2723.35495.3245.70993.2846.30194.4946.21094.31101.190103.2693.80095.7190.046平均回收率(%)87.3387.9791.8395.1991.88RSD(%)3.833.753.933.38:1006 10期表5直立式聚丙烯输液袋装葡萄糖注射液加速试验抗氧剂迁移试验结果批号时间（月）0DB21112501360DB21112601360DB21112701363讨论3.1色谱条件的选择参考相关文献7-11 并结合样品的全波长扫描结果，本研究分别考察了3种检测波长为2 7 5、2 8 0、2 2 4nm,3种柱温为2 5、30、40,以及4种流动相体系为甲醇、甲醇-水、乙腈-水、乙腈-四氢呋喃-水，结果表明在波长280nm，柱温30,流动相为乙腈-四氢呋喃-水条件下,样品溶液出峰时间较短，杂质峰较少，峰形较好，且分离度符合要求。3.2洗脱液及用量的选择参考相关文献11-15，本研究以 C18柱为固相萃取柱,考察了6 组不同洗脱剂的洗脱效果,结果表明4 mL甲醇与5 mL二氯甲烷依次洗脱的效果最好，回收率接近10 0%（表6)。表6 洗脱液信息组别种类第一组10 mL甲醇第二组10mL二氯甲烷-无水乙醇(2:3)第三组5mL甲醇与4mL四氢呋喃第四组2 mL甲醇与3mL甲苯-甲醇(1:1)第五组5mL甲醇与3mL二氯甲烷第六组4mL甲醇与5mL二氯甲烷3.3方法学评价目前报道的抗氧剂检测方法有微波萃取-高效液相色谱法16 、超高效液相色谱-串联质谱法17 、气相色谱法18 等。使用微波萃取-高效液相色谱法时，微波加热可能会造成热敏性物质变性或失活,导致结果不准确;超高效液相色谱-串联质谱法对环境的温度、湿度等要求高且仪器结构复杂,维护成本高，不利于产业化；气相色谱法对于难挥发和热不稳定的物质难以分析,如抗氧剂16 8等,不利于整体分析19-2 0 。本研究采用 SPE-HPLC方法，对4种抗氧剂进行含量测定，该方法操作简鹿广玲等SPE-HPLC法测定葡萄糖注射液中4种外源性抗氧剂的含量1010 0.000 05 0.000 05 0.000 05 0.000 05 0.000 050.000 05 0.000 050.000 050.000 05抗氧剂含量（%）33010760.000 050.000 10 0.000 050.000 10 0.000 05 0.000 10 0.000 05 0.000 10 0.000 05 0.000 10 0.000 050.000 100.000 050.000 10 0.000 050.000 10 0.000 050.000 10便、准确度高且重复性好，为药品与包材相容性实验中抗氧剂的含量测定提供了技术参考。3.4抗氧剂迁移量测定本实验中3个批号的直立式聚丙烯输液袋装葡萄糖注射液中4种抗氧剂在加速试验中的迁移量测定结果均低于方法的检测限，且远小于欧洲药典10.0 版2 1 中对抗氧剂的限度要求,即单个抗氧剂含量和抗氧剂总量均不得过0.3%，表明本研究所采用的直立式聚丙烯输液袋与葡萄糖注射液两者相容性良好。本文建立了一种测定葡萄糖注射液中4种外源性抗氧剂含量的固相萃取-高效液相色谱方法，为直立式聚丙烯输液袋与注射液的相容性研究提供了技术手段，同时也为直立式聚丙烯输液袋产业进一步发展提供可以借鉴的方法及科学依据。参考文献1丁大中，于玮洁,栾成章.葡萄糖注射液评价性抽验结果及质量分析J.中国药事，2 0 15,2 9（8）：8 40-8 44.2李晓春,王莉芳，徐长根，等.直立式聚丙烯输液袋的生物安全性评价J.世界最新医学信息文摘，2 0 18，18(45):195-196.【3】国家药品监督管理局药品审评中心.化学药品注射剂与塑料包装材料相容性研究技术指导原则（试行）EB/0L.2021-06-01.【4余秋玲，李根容，龙梅，等.高效液相色谱法测定输液袋中12 种抗氧剂的迁移量J.分析试验室,2 0 2 1,40(9):1075-1079.5喻亮宇,邓勇亮,黄海萍.聚丙烯输液瓶中抗氧剂含量及迁移量的测定研究J.海峡药学,2 0 2 0,32（1）：6 8-71.6 Tao B,Wang G,Yin Z,et al.Determination of the contentsof antioxidants and their degradation products in sodiumchloride injection for blood transfusion J.Anal MethodsChem.2020:8869576.1680.000 10 0.000 10 0.000 10 0.000 10 0.000 100.000 100.000 100.000 10 0.000 10.1007.遵义医科大学学报7赵莹.高效液相色谱法测定复配添加剂中抗氧剂药师,2 0 16,19(12):2 2 6 7-2 2 6 9.1010、10 7 6 和16 8 的含量J.精细与专用化学品，15王文艳,姚羽,郭景文.高效液相色谱法测定甲硝唑注2019,27(4):37-40.射液中四种外源性抗氧剂迁移物J.中国药物与临8饶艳春,熊炜,朱碧君.HPLC法同时测定3种材质药用床,2 0 2 1,2 1(2):311-313.塑料瓶中5种抗氧剂含量J.中国医药导报,2 0 19,1616李樾越,孙会敏,张炬.塑料输液包装材料与容器中抗氧(25);27-31.剂含量测定方法的建立及其在注射液中的迁移研究9徐燕慧.HPLC测定三层共挤输液用袋中四种抗氧剂J.中国药学杂志,2 0 16,51（19):16 9 9-17 0 5.的含量J.海峡药学,2 0 2 0,32（11：8 1-8 4.17余秋玲,张永梅,邱月，等.超高效液相色谱-串联质谱10蔡心怡,王悦雯，冯靖，等.药品包装材料用塑料粒料法快速筛查药用胶塞中12 种抗氧剂J.分析测试学中8 个常用抗氧剂的含量测定J.药物分析杂志，报,2 0 2 2,41(6):9 10-9 15.2020,40(3):523-528.18吴红洋,李莎，张璞，等.药用胶塞中抗氧剂2,6-二叔11 郑景峰,徐燕慧,林芳，等.HPLC 法测定三层共挤输液丁基-4-甲基苯酚含量测定及迁移量研究J.中国药袋装氯化钠和葡萄糖注射液中抗氧剂迁移量J.海业,2 0 2 2,31(1):6 3-6 6.峡药学,2 0 18,30(12):49-52.19 JJia-hui M,Yang Z,Yu Z,et al.Organosulfur in food sam-12陈敏，雷翔霄,王洋，等.分析5%葡萄糖注射液中外源ples:Recent updates on sampling,pretreatment and deter-性抗氧剂的测定J.当代化工研究，2 0 17，17（4）：mination technologies J.Journal of Chromatography A,116-117.2023,1689(1689):463769.13沈丹霞,蔡荣,张芳芳，等.葡萄糖氯化钠注射液中抗20谢兰桂,孙会敏,杨会英等.塑料类药包材抗氧剂的检氧剂16 8 降解产物的HPLC法测定J.药物分析杂测分析策略J.中国药事,2 0 2 2,36（9）：10 0 2-10 0 9.志,2 0 17,37(11):2 0 53-2 0 56.2 1】欧洲药品质量委员会.欧洲药典【S.2020：431-434.14 黄萍,刘兴兰.SPE-HPLC法测定三层共挤输液袋中抗收稿2 0 2 3-0 4-0 3;修回2 0 2 3-0 8-0 8 氧剂在氧氟沙星氯化钠注射液中的迁移量J.中国46卷(编辑：王先恒）:1008: