SN∕T 3165-2012 高粱根腐病菌检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3165-2012 高粱根腐病菌检疫鉴定方法Detection and identification of sorghum milo disease Periconia circinata CL. Mangin)Sacc. 2012-05-07发布2012-11-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检瘦总局SN/T 3165-2012 目IJ1=1 本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检骑检疫局技术中心。本标准主要起草人:林石明、廖富荣、吴搓、陈青、陈红运、黄莲英、王宏毅。I SN/T 3165-2012 高梁根腐病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了高粱根腐病菌的检测和鉴定方法。本标准适用于高粱等种子、苗木及其根围栽培介质中高粱根腐病菌的检测和鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件.其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 1!l0!l5 植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法SN/T 1809 进出境植物种子检疫规程SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样3 方法原理本标准通过分离培养，根据菌落形态特征，病原菌无性世代的分生面子梗和分生于包子的形态特征，病菌所引起的主要为害症状，在感病寄主植物接种后产生的典型症状，对该病原进行鉴定。其他有助于该病菌检测鉴定的相关资料参见附录Ao4 仪器设备和试验用具4. 1 仪器设备离心机，M做镜(20X1 OOOX;或w底yc;源的立体M微锚，8X100X)，培养箱(5 50) :!: 2 C, 带走时器，近紫外光或黑光灯光源，回旋式振荡器，天平，高压灭菌锅，冰冻切片机，超净工作台，恒温水浴锅等。4.2 试验用具移液器，培养皿(直径D.0 cm 12 cn仆，吸水纸或滤纸(直径8.0 cm 11 cm)，筛网(孔径。.047mm) ，pH计，血球计数板，离心管等。5 试剂和培养基5. 1 试剂次氯酸铀0%)，酒精，琼脂，m;糖.甘油(30%50%)等o5.2 培养基弓铃薯培养基(PDA)(参见附录m。SN/T 3165-2012 6 抽样检查按照SN/T1809及SN/T2122规定进行取样。7 病菌分离7. 1 种子样品7. 1. 1 洗涤检验称取5og或适量的种子.加元菌水100mL巧在振荡器中振荡5min口n，取洗涤液在1000r矶盯/址/;) min，充上1清青液力加日适量席尔氏i液夜(其配制方法见G且B/T18085川)，镜检沉淀物o7. 1. 2 吸水纸培养法检查异常的种子.或随机挑取种子，每份样品至少检测200粒种子。用蒸f留水将吸水纸充分;显润(避免产生多余的水)，种子均匀地置于在吸水纸上(如直径9cm的培养皿约25粒/皿)，加盖后在25 C 30。仁、12h紫外光/12h黑暗下培养。5d7 d后观察培养结果，可疑的菌落进行纯化O7. 1. 3 冷冻培养法播种后的种子先在20吃下培养24h，之后于20 C冷冻24h，最后于25C30 C ,12 h紫外光J12 h黑暗下培养。5d7 d后观察培养苟果，挑取菌落边缘菌丝进行纯化。7.2 植物组织将植物组织用1%的次氯酸铀消毒2min.用无菌水冲洗，在元菌条件下晾干.放置在保湿滤纸上，室温下培养2周o如果产生特征性的产币体(参见图A.4)，将于包子抖落在PDA培养基上，挑取单个萌发的拍子进行纯化。培养基制备参见附录B。7.3 根围栽培介质样品称取风干根固栽培介质10g，研碎，加入50mL 饱和l!;糖溶液，充分搅拌5min后，静置，取悬浮液30 mL于50mL的离心管中，再加入10mL的40%(质量浓度)l!;糖溶液，6OOO，!;离心10min 15 min;取上清液用300日(孔径。.047mm)筛网过筛句取过滤液在PDA培养基上进行单咀分离培养(30 C .12 h紫外光/12h黑H的。培养基制备参见附录B。8 病菌鉴定8. 1 症状特征病害危害高粱的整个生育阶段。发病植株的叶片萎焉、卷曲、黄化，穗部的籽粒发育不良。成熟的籽粒没有特别症状。根部和根冠受害后影响植株的生长，严重抑制花穗的发育。苗期发病呈缺水状的萎焉，/J、苗根部皮层、维管束呈褐色水渍状.细根软化并腐烂。成株染病叶片下垂梢卷曲，老叶片黄化，从叶尖端和叶缘开始干枯。发病严重时.根全部腐烂，幼苗枯死。剖开病根和根冠处，组织发红井扩展到维营束组织。2 SN/T 3165-2012 8.2 形态特征在PDA培养基上，菌丝稀疏，污白色至灰色.生长缓慢，产生分生于包子后变暗褐色至黑色(参见图八.l图A.:-3)。菌丝有的元色透明.有的厚壁淡褐色，壁光滑或具小疵.宽2m6m。生长条件不适宜时，可形成厚壁面子o厚壁于包子球形、圆柱形，光滑厚壁，直径9m18nl，顶生或间生，单个或成串。分生于包子梗由粗的菌丝或菌核土长出.单根或2个3个成束，分枝，暗褐色至黑色，厚壁.3个10个隔膜，(l;-;O 11m2;-;0 ,um) X (6 ，um8 ,um) ，基部宽6，umllnl，顶端以下7fLm9 fLm;顶端细胞略膨大，通常有3个产咀细胞，顶端具600180。的特征性弯卷。顶细胞具分阳，分隔部分又可形成产自细胞。产咀细胞单个或2个:-3个串生，球形、圆柱形，光滑，淡褐色，直径;-;fLm7nl，以全壁芽生葡萄砸式(hb-botr)产咀;由产面细胞上向基部连续产币，常形成短链o分生于包子串生，单胞，通常为球形或亚球形，灰色至暗褐色、黑色，初光滑，成熟后壁具刺疵，直径15m27n10参见图A.4图A.70 在培养基上，分生于包子偶尔可直接从菌丝上产生，或从分生于包子梗顶端以下的第一或第二个隔膜处的产面细胞上产生o8.3 致病性测定8. 3. 1 接种体制备刮取在PD八培养3d的可疑菌落的分生于包子，在无菌水中加入高粱的根系洗涤液，配制成10二CFU/mL10(iCFU/mL面子悬浮液。8.3.2 接种试验将高粱种子播种于小盆钵中-每盆播种3粒5粒种子.生长2周3周.备用。用刷子轻扫幼苗叶片进行创伤.将于包子悬浮液喷雾接种于叶片上，每盆接种3片4片叶片.重复两次o如可能，采用己知菌株作阳性对照，用无菌水作空白对照。接种后用干净的塑料袋包扎封口，在饱和湿度，于25飞下培养48 h后，去掉塑料袋;注意观察产生的症状。9 结果判定9. 1 未分离到可疑菌落病菌分离培养7d后，仍未产生可疑菌蓓，则判定为阴性。9.2 分离到可疑菌落分离培养后的可疑菌落.其形态特征如果符合以上的鉴定特征，致病性测定产生典型的症状，而空白对照没有表现症状，则判定为阳性;可疑菌落没有产生典型的症状，则判定为阴性。10 样品保存共试样品和分离纯化后的菌株移入斜面培养，5d7 d后浸没于甘油中，于低温下保存，以备复核O样品检测结束后，其原始记录单和检验报告或证书应归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁O1 SN/T 3165-2012 附录A(资料性附录)高粱根腐病菌相关资料A.1 病原菌特征A. 1. 1 名称学名:PericoniacircinataCL. Mangin)Sacc. ,1906,Syll. Fun忌，18:569.|叫物异名:A.s户ergillus门rc川atusL. Mangin, 1899 英文名称:Milo disease, root rot of sorghum 中文名称:高粱根腐病菌、弯卷黑团于包、高粱黑葱花霉A. 1.2 分类地位属真菌界CFungi)，无性真菌门(Anamorphicfungi) ，黑团于包属(Peiconia Tode，1791)。至今尚未发现其有性阶段oTode, H. J.于1791年命名Pericuza作为真菌新属，至今已记载163种。该属的真菌主要分布于温带和热带地区的腐烂植物组织，淡水、海水和红树林上O部分种类为植物的病原菌和内生菌。该属的模式种为PericoniaLichelloides Tode ex Mral。A.2 寄主植物冰草属CA.groyron吕pp.)、剪股颖属CA.p，rostisspp. )、须芒草属(A.droOp，071spp. )、王主草属CA.rthra.ro71 spp. )、强麦属CA.uena叩p.)、雀麦属(Brom川spp.)、沙茅属CCaLamouilfa spp.)、柑桔属(Citrspp. )、鸭茅属CDactylis spp. )、披碱草CElymspp.)、画眉草属(Eragrustisspp. )、羊茅属(F estuca spp. )、大豆属(Glyctnespp. )、大主属CHordeum spp. )、;俞平属(K(】eleriaspp. )、赖甲:属CLeymus spp. )、百桔)冯CMedicaguspp. )、茶国CP川icumspp. )、陆牧草;同CPhleumspp.)、月禾j冯(P 叩p.)、裂秤草属(丛如zachyr叩mspp. )、狗尾草属(Setariaspp.)、印第安草属(Sorghastrum spp. )、高粱属CSurghum spp. )、高粱(Srghumvulre)、小麦属CTriti正umspp. )、鼠茅属CVul户叩spp. )和玉米(Zeamays)等。A.3 传播途径和病菌的生物学特性病菌在土壤病残体中存话，主要通过土壤传播o美国曾经从高粱种子中分离到该病菌，种子亦可作为初侵染源。厚壁面子的功能尚不清楚，可能是病菌的重要存活菌体。病菌在病残f本上存活。厚壁面子的功能尚不清楚，可能是病菌的重要存活菌体o分生J包子或菌丝本可能是侵染高粱根部的初侵染菌源O侵染根部时，初形成类似附着胞侵入根部，菌丝在皮层至微管束的细胞间发育蔓延。通过镜检土壤中拔出的病株，其细根上可见大量子包子。分生于包子经扣。C48C热处理10mi口，在PDA上萌发率仍达50%70%。分生于包子在含有高粱根的蒸馆水中的萌发率达ss%，而无高粱根的蒸悟水中则不萌发。在含有根系分泌物的蒸馆水中.4 SN/T 3165-2012 子包子的萌发率也较高。分生于包子在18h内萌发产生芽管及附着胞，3 d5 d在根皮上产生小的、红色斑点，容易从根皮病斑土重新分离到病菌。A.4 地理分布美讪IC美国、阿根廷等);亚洲(日本、韩国等);欧洲(普遍分布);大洋洲(澳大利亚)等。A.5 与大刺黑团于包的区别在I壤丰而粱根部经常可以分离到与相似的、)肉牛的j(iIJ黑凶但(P.macros户inosaLdcbvrc)，两种甫的形态有较大仄别(参见国A.7国A.的。大刺!:民间甜的分生由于相i不分技成在顶端稀疏分枝，直或略弯曲，暗褐色，1个4个隔膜，长约420m ，宽10ml1m，基部8m9m以上。在PDA上，分生于包子梗隔膜可达11个。顶部细胞或基部细胞硝大。第一产血细胞在顶细胞上轮生，淡褐色，形状多样，(8tLm13 tLm)(5 F日18tLm);第二产由细胞球形至宽卵球形.淡褐色，刺吭不明显，(6 vm8m) X (5 vm8m) 0分生于包子球形，暗褐色至黑色，刺疵明显，于第二产由细胞上单生或呈短链，直径18vm32mo 大刺黑团于包菌的分生于包子上的刺庇为暗褐色、圆锥形，高2.5 ，!Lm6. 0 tLm，基部宽2t1m3 ,11m; 其分生于包子梗较长(420m以上)，顶端直或弯曲但不弯卷，分生于包子较大(直径18lim:-l2 Vm)，由于上刺庇较长，在大多数培养基上能够立民J萌发，不产生毒素.无致病性。A.6 病菌形态图图A.1 Periconia circinata在PDA培养4d后正面菌落J SNjT 3165-2012 图A.2 Periconia circinata在PDA培养6d后正面菌落图A.3 Periconia circinata在PDA培养6d后反面菌落图A.4 Periconia circinata在根部的病菌特征6 SN/T 3165-2012 . 图.5 Periconia circinat分生于包子梗图.6 Periconia circinata分生于包子图.7 Periconia circinata线条图仿自Ellis，M. B. (1971) 7 SN/T 3165-2012 图A.8 Periconia macros pinosa线条图仿自Elli日，M.B. (971)J 吕SN/T 3165-2012 附录B(资料性附录)PDA培养基的配制B.1 培养基配方马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，纯净水1000 mLc B.2 培养基配制将马铃薯去皮，洗净，称取200g，切成小块，放入1000 mL水中煮沸20min，用双层纱布过滤，得到马铃薯汁，补足水分，再加入20g葡萄糖和琼脂不断搅拌至琼脂完全融化.补充水量至1000 mL，再加热至沸腾，高压灭菌后使用。选用市售PDA培养基，加纯净水，高压灭菌后使用O在i音养基中加入洗净的高粱根系，可提高病菌分离的效率。用于根围栽培介质分离的培养基.加入链毒素(100，ug/mU可减少污染，提高分离效率。SN/T 3165-2012 参考文献lJ 白金铠主编.杂粮作物病害.中国农业出版社.1997. 2J Bunning &. Griffi lhs, 1984, Transaclion of Bri lain Mycological Socie厅，78:147.:-lJ Dunkle,L. D. ,Odyvody,G. N. and B.八.Jone日，1975，Heat activation of conidial germination in Periconia circi日且1且，PhYlppalhology，65: 1321-1322. 4J Ellis, M. B. &. 1. P. Elli日，1997, Microfungi on Land Plants: in Identification日andhook，The Rich日lOndPubli吕hingCo. LLd. 5 J Elli凹，M.丑，1971,Dematiaceous hyphomycetes, CMI, Kew, Surrey, England, P:47 -:14S. 6J Ha口吕ll1ga口dHarLley，Proceeding吕ofthe AssociaLion of ()fficial Seed Analy吕tsof America. 52: 14:， 1962. 7J Farr, D. 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Ah时y，2001，AReview of Soyhean (Gl.ycine 7I1a工)Seed, Pod,and Flower Mycofloras in North America,with Methods and a Key for Identification of Selected Fungi, Mycopathologia, Volume 150, Numher 1 pp. 15-27(3). 16J http:/en.wikiped且org.10 N-ON|-的问军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准高粱根腐病菌检疫鉴定方法SN/T 316,-2012 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京rjJ两城-:m.7口J北街16号(100015)总编室:[phone]x 网址.c口中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷兴开本880X1230 1116 印张I字数20千字2012年10月第一版2012年10月第一次印刷印数1-1600定价18.00元兴书号1550日6 2-23978 SN/T 3165-2012