吡啶硫酮铜胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺能量利用、脂质过氧化指标和基因表达的影响.pdf

四川动物 Sichuan Journal of Zoology 2023，42（6）：609-617吡啶硫酮铜胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺能量利用、脂质过氧化指标和基因表达的影响李舒泓，陈天赐，赵永鹏，李呈浩，梁植，郭慧*（广东海洋大学水产学院，湛江市海洋生态与养殖环境重点实验室，广东湛江524025）摘要：目的研究吡啶硫酮铜（CuPT）对凡纳滨对虾 Litopenaeus vannamei肝胰腺能量利用、脂质过氧化相关指标和抗氧化、凋亡相关基因表达量的影响。方法设置空白对照组、DMSO溶剂对照组（0.128 mL L1）和2个CuPT处理组（64 g L1和128 g L1），每组3个平行，在200 L水体中暴露48 h，分别于胁迫0 h、3 h、12 h、24 h和48 h取肝胰腺进行测定。结果随着CuPT暴露浓度的增加及胁迫时间的延长，凡纳滨对虾肝胰腺中的糖原、乳酸含量显著下降（P0.05），丙二醛含量显著升高（P0.05）；锰超氧化物歧化酶基因、谷胱甘肽过氧化物酶基因、过氧化氢酶基因和凋亡相关基因半胱氨酸蛋白酶 3基因和肿瘤抑制基因的表达水平也发生了显著变化（P0.05）。结论CuPT可能影响凡纳滨对虾正常能量供应，并使机体出现脂质过氧化，还会影响机体内抗氧化应激以及凋亡相关基因的表达水平。关键词：吡啶硫酮铜；凡纳滨对虾；肝胰腺；能量利用；脂质过氧化；基因表达中图分类号：Q959.223+.63；S917.4 文献标志码：A 文章编号：1000-7083（2023）06-0609-09Effects of Copper Pyrithione on Energy Utilization,Lipid Peroxidation andGene Expression in the Hepatopancreas of Litopenaeus vannameiLI Shuhong，CHEN Tianci，ZHAO Yongpeng，LI Chenghao，LIANG Zhi，GUO Hui*（Key Laboratory of Marine Ecology and Aquaculture Environment of Zhanjiang，College of Fisheries，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong Province 524025，China）Abstract:ObjectiveThe effects of copper pyrithione（CuPT）on hepatopancreas energy utilization，lipid peroxidation-related indexes，and the expression of antioxidant and apoptosis-related genes in Litopenaeus vannamei were studied.MethodsL.vannamei grew in 200 L water containing DMSO（0.128 mL L1），64 g L1 or 128 g L1 of CuPT for 48 h.The hepatopancreaswere obtained at 0 h，3 h，12 h，24 h，and 48 h after exposure，respectively.ResultsWith the increase of concentration of CuPT and the exposure time，the contents of glycogen and lactic acid decreased significantly（P0.05）compared to the control group，while the content of malondialdehyde increased significantly（P0.05）.At the same time，the expression levels of antioxidant-encoding genes MnSOD，GPx and CAT，and apoptosis-related genes caspase3 and p53 changed significantly（P0.05）.ConclusionCuPT may disrupt the normal energy supply and cause lipid peroxidation of L.vannamei，and also affects the expression levels of antioxidant stress and apoptosis-related genes.DOI：10.11984/j.issn.1000-7083.20220348收稿日期：2022-09-29 接受日期：2023-04-25作者简介：李舒泓（1998），女，硕士研究生，研究方向：水产动物健康养殖，E-mail：*通信作者Corresponding author，副教授，研究方向：水产动物健康养殖生态学，E-mail：609四川动物 2023 年 第 42 卷 第 6 期Sichuan Journal of Zoology Vol.42 No.6 2023Keywords:copper pyrithione（CuPT）；Litopenaeus vannamei；hepatopancreas；energy utilization；lipid peroxidation；gene expression近年来，随着人们对海洋资源开发力度的不断加大，生物污损的危害日渐突出，海洋防污问题也越来越严峻。海洋防污剂通常被添加到船舶及其他海洋设备的涂料中以减少生物黏附、防止腐蚀（Qian et al.，2013）。但防污涂料中使用的很多防污剂都具有不同程度的生态毒性，如三丁基锡因对海洋生态环境具有严重的影响已于2008年在全球范围内被禁止用作防污剂成分（汝少国，李雪富，2017）。新型防污剂吡啶硫酮铜（copper pyrithione，CuPT）因具有高效、易降解的特点而被广泛应用（Almond&Trombetta，2017），2014 年全球以CuPT 为主要成分的防污剂占有的市场份额超过50%（Ciriminna et al.，2015）。起初，CuPT被认为是非持久性的化合物，因其在海水中的直接光照条件下能够快速地被光降解形成毒性较低的化合物。然而，在光照有限的地方，如在游艇码头和港口背光处的水体或浑浊度较高的水体中，则容易发生积累（Maraldo&Dahllf，2004；Turley et al.，2005）。目前，已经在日本太平洋海岸和越南中北部沿海海域的沉积物中检测到 CuPT 的存在（Harino et al.，2006，2007）。此外，Gnal等（2022）报道在污水处理厂的废水中可检测到 CuPT的浓度为10260 ng L1。随着CuPT的广泛使用，其对水生生物的毒性影响也开始引起人们的关注。汝少国和李雪富（2017）的研究显示，CuPT对藻类、多毛类、软体动物、鱼类、甲壳类等生物均具有较高的生态毒性。以鱼类为例，CuPT可导致底鳉Fundulus heteroclitus幼鱼的畸形和侧肌炎症团块的形成（Mochida et al.，2008）；可引起斑马鱼Danio rerio胚胎形态学异常、凋亡增加和抗氧化能力降低（Almond&Trombetta，2017）；可引起斑马鱼组织损伤（Gnal et al.，2022）和褐牙鲆Paralichthys olivaceus胚胎发育畸形（Shin et al.，2022）。在软体动物中，CuPT暴露导致一种贻贝Unio crassus血细胞总数发生显著变化，总蛋白在暴露7 d后显著下降（Tekov et al.，2020）。在甲壳类动物中，CuPT可导致凶猛片钩虾Elasmopus rapax的RNA/DNA比率显著降低（Vivien et al.，2012）。然而，生物体对环境污染物的生理反应是一个极其复杂的过程，因此，需要深入研究 CuPT对非目标生物的毒性作用机制。甲壳动物是水生生态系统中分布较为广泛的种群，其典型的底栖生活习性和特殊的生理生化特征使其体内易积累有毒物质，常作为水环境污染的指示生物。利用甲壳动物系统研究水环境毒理学和生态风险评价具有重要的实用价值，对保护人类和动物的生存与健康具有重要的意义。凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei又名南美白对虾，是当前世界上养殖产量最高的三大优良品种之一（徐德峰等，2022），也是我国养殖规模和产量第一的经济甲壳动物（李会峰，2019）。凡纳滨对虾对环境胁迫非常敏感，且容易养殖、处理，已经被作为毒理学研究的模型生物（Su et al.，2019）。肝胰腺是十足目Decapoda甲壳动物消化系统中最大的器官，同时也是甲壳动物重要的代谢器官，其与一些重金属和有机异生素解毒相关（Vogt，2019）。Chen等（2022）报道了 CuPT对凡纳滨对虾血细胞的毒性影响，但关于CuPT对其肝胰腺的毒性影响还未见报道。本实验以凡纳滨对虾为研究对象，检测CuPT胁迫对肝胰腺糖原、乳酸、丙二醛（MDA）含量，以及抗氧化相关基因，如锰超氧化物歧化酶基因（MnSOD）、谷胱甘肽过氧化物酶基因（GPx）、过氧化氢酶基因（CAT）和凋亡相关基因，如半胱氨酸蛋白酶3基因（caspase3）和肿瘤抑制基因（p53）的表达量，旨在从生物化学和分子生物学水平研究610李舒泓等：吡啶硫酮铜胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺能量利用、脂质过氧化指标和基因表达的影响CuPT对凡纳滨对虾的毒性影响，为深入CuPT对水生生物的毒性效应机制研究提供前期基础。1材料与方法1.1实验动物凡纳滨对虾平均体重 7.51 g1.94 g，来自广东海洋大学东海岛养殖基地，实验前暂养在养殖桶（300 L）中 14 d。实验用海水经过消毒过滤，实验过程中为养殖海水连续曝气，海水盐度26，pH7.57.9，温度 26.226.8，溶解氧含量5.86.2 mgL1。暂养期间，每日按照对虾体重的 5%投喂 2 次（0800 和 2000）普通商业虾饲料，每天换水50%，实验前24 h停止投喂。1.2实验仪器与试剂Finnpipette移液器（Thermo）、电热恒温培养箱（武汉一恒苏净科学仪器有限公司）、RT-6100酶标仪（Rayto）、TG16W 离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）、TGL16M 冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）、HT-111B 恒温摇床（上海赫田科学仪器有限公司）、XB220A 电子分析天平（Precisa）、JY98-IIIN细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）、81-2恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）、NanoDrop 2000分光光度计（NanoDrop Technologies）；反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit（TaKaRa）；荧光定量试剂 SYBR Premix Ex Taq（Takara）；荧光定量仪器Light Cycler 480（Roche）。1.3胁迫实验根据已有研究（Mochida et al.，2008；Vivien et al.，2012；Almond&Trombetta，2017），以二甲基亚砜（DMSO，广东光华科技股份有限公司）为助溶剂制备浓度为1 g L-1的CuPT母液（纯度97%，上海源叶生物科技有限公司），实验时用海水进一步稀释到实验所需浓度。根据 Chen 等（2022）的研究，实验设置空白对照组、DMSO 溶剂对照组（0.128 mL L1）和2 个 CuPT 处理组（64 gL1和128 g L1）。挑选体色健康、大小均一、无病患、活力强且处于蜕皮间期的个体进行实验，每桶20尾。每组 3个平行，每桶盛有 200 L暴露溶液。在48 h的暴露过程中不投喂，每24 h更换50%暴露溶液，其他条件与暂养期相同。由于CuPT在光照条件下容易降解，根据 Tekov 等（2020）的报道，本实验在黑暗环境中进行。在胁迫0 h、3 h、12 h、24 h和48 h取样，每桶取对虾3尾，分离肝胰腺于1.5 mL冻存管中放入液氮速冻，80 保存。1.4生化分析取肝胰腺组织在冰上解冻，称量组织样品，加入PBS（pH7.4），用匀浆器将样品充分匀浆，低温离心（2 500 r min1，20 min），吸取上清用于检测。根据使用说明书，使用糖原、乳酸和MDA的ELISA检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）检测肝胰腺中的糖原、乳酸和MDA含量。1.5肝胰腺基因表达根据说明书，用 Trizol 法提取肝胰腺细胞总RNA，使用 NanoDrop 2000 分光光度计检测 RNA的质量及浓度，琼脂糖凝胶电泳验证 RNA 完整性。qRT-PCR 的引物（表 1）使用 Primer Premier 5设计。使用去基因组DNA的反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit合成 cDNA。利用荧光定量分析仪器Light Cycler 480 和荧光定量试剂SYBR Premix Ex Taq 进行 RNA 表达量分析。10 L反应 体 系 为：5 L 2SYBR Premix Ex Taq、1 L cDNA（50 ng L1）、正向和反向引物各 0.4 L（10 mmol L1）和 3.2 L ddH2O。通过 2ct法计算mRNA相对表达水平（Livak&Schmittgen，2001）。1.6数据分析利用 SPSS 19.0 进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）和多重比较（Tukey）分析。数据以x SD表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1毒性症状在各实验组中，凡纳滨对虾均未出现死亡现象。但64 g L1和128 g L1 CuPT处理组观察到611四川动物 2023 年 第 42 卷 第 6 期Sichuan Journal of Zoology Vol.42 No.6 2023虾聚集、身体侧翻的现象，而空白对照组和DMSO溶剂对照组中的虾游动正常，在水体中分布均匀。2.2凡纳滨对虾肝胰腺糖原、乳酸含量与空白对照组及 DMSO 溶剂对照组相比，在CuPT胁迫初期（3 h），2个处理组的糖原、乳酸含量均呈明显下降（P0.05），128 g L1组的下降幅度显著高于 64 gL1组（P0.05）。随着胁迫时间延长（1224 h），64 g L1组的糖原、乳酸含量趋于稳定，在胁迫48 h时显著下降（P0.05）；128 g L1组的糖原、乳酸含量在胁迫 24 h 后显著下降（P0.05）（图1）。2.3凡纳滨对虾肝胰腺MDA含量胁迫开始后，2个处理组的MDA含量与空白对照组、DMSO溶剂对照组之间的差异显著（P0.05），在 CuPT 胁迫初期（3 h），2 个处理组的 MDA 含量均 显 著 升 高（P0.05）；随 着 胁 迫 时 间 延 长，表1荧光定量PCR引物Table 1Primers used for qRT-PCR基因GeneactinMnSODGPxCATcaspase3p53GenBank登录号GenBank accession numberAF300705DQ298207.1AY973252AY518322EU421939KC422442序列Sequence（5-3）F：CATCAAGGAGAAACTGTGCTACGR：CATGATGGAGTTGTAGGTGGTCTF：GCAATGAATGCCCTTCTACCR：CAGAGCCTTTCACTCCAACGF：AGGGACTTCCACCAGATGR：CAACAACTCCCCTTCGGTAF：TCAGCGTTTGGTGGAGAAR：GCCTGGCTCATCTTTATCF：GGTGGACAAAGGCGTGAGTAR：GTTCTTGAGGTTCTCGGCCAF：CGTCAGTCGGTGGTGTATCAGR：GAATGTGCCAGAGTAGAGTCAGC图1CuPT对凡纳滨对虾肝胰腺糖原和乳酸含量的影响Fig.1Effects of CuPT on the content of glycogen and lactic acid in the hepatopancreas of Litopenaeus vannamei不同大写字母代表相同处理组不同胁迫时间之间具有显著差异（P0.05）；不同小写字母代表相同胁迫时间不同处理组间具有显著差异（P0.05）；下同Different capital letters indicate there is a significant difference between the same treatment group at different exposure times（P0.05），different lowercase letters indicate there is a significant difference between different treatment groups at the same exposure time（P0.05）；the same below612李舒泓等：吡啶硫酮铜胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺能量利用、脂质过氧化指标和基因表达的影响64 gL1组的 MDA 含量变化趋势较为平稳，128 g L1组的MDA含量则持续增加，二者均在胁迫48 h时达到峰值（P0.05）（图2）。2.4凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化、凋亡基因表达胁迫开始后，MnSOD表达水平在64 g L1组的 12 h和 24 h被显著诱导，48 h后受到显著抑制（P0.05）；在128 g L1组的12 h被显著诱导，24 h后受到显著抑制，达到最低，在 48 h 又显著增加（P0.05）（图 3：A）。GPx表达水平在 64 g L1组和 128 g L1组均呈先下降后增加的趋势，在 3 h显著下降（P0.05），在12 h显著上升至峰值，在24 h和48 h恢复至初始水平（图3：B）。2个处理组的CAT表达水平均在3 h和48 h被显著抑制，128 g L1组的 CAT表达水平在 12 h和 24 h被显著诱导，并在24 h 达到峰值（图 3：C）。64 g L1组的 caspase3和 p53 表达水平均在 3 h 被显著抑制而后上升，分别在 24 h 和 12 h 达到峰值后下降（P0.05）。128 g L1组的 caspase3 表达水平在 12 h 被显著诱导达到峰值，后在24 h被显著抑制，128 g L1组的p53表达水平与64 g L1组相似，在3 h被显著抑制，在12 h 达到峰值，而后缓慢下降，在48 h时恢复至对照组水平（P0.05）（图4）。图2CuPT对凡纳滨对虾肝胰腺MDA含量的影响Fig.2Effects of CuPT on MDA contentin the hepatopancreas of Litopenaeus vannamei图3CuPT对凡纳滨对虾肝胰腺MnSOD、GPx和CAT基因mRNA表达的影响Fig.3Effects of CuPT on mRNA expression ofMnSOD，GPx，and CAT genes in the hepatopancreasof Litopenaeus vannamei613四川动物 2023 年 第 42 卷 第 6 期Sichuan Journal of Zoology Vol.42 No.6 20233讨论3.1CuPT胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺能量利用的影响糖原是反映生物体碳水化合物储备和能量状态的参数之一，被认为是压力的有效生物标志物（Jiang et al.，2019；Li et al.，2019）。乳酸是甲壳类动物无氧代谢的产物，也是糖异生合成葡萄糖的生物合成途径前体（Rosas et al.，2001）。水生动物对环境刺激物高度敏感，可能通过调节能量代谢来适应外界环境。本实验中，随着CuPT暴露时间的增加，凡纳滨对虾肝胰腺中的糖原含量显著下降，这与硫化物（Li et al.，2017）、亚硝酸盐（Li et al.，2019）暴露后凡纳滨对虾肝胰腺中糖原含量的变化趋势一致，可能是为了应对CuPT胁迫所导致的能量需求上升，机体通过调动糖原作为能量代谢底物以维持所需能量。肝胰腺中的乳酸含量同糖原含量表现出相同下降趋势，与低氧胁迫下花鲈Lateolabrax maculatus（常志成等，2018）、褐牙鲆（李洁等，2015）肝脏中糖原、乳酸含量的下降相似。同一指标在同一暴露时间、不同暴露浓度时的差异较为明显，表明高浓度的CuPT对凡纳滨对虾能量利用的影响较大。64 g L1 CuPT 处理组暴露324 h肝胰腺中的糖原、乳酸含量无显著差异，而在胁迫48 h差异显著，这可能是由于在胁迫的前中期依靠当下营养物质的分解量足够维持机体生存，而随着时间的推移，机体所需能量持续上升，需要额外消耗能量以维持生存；而128 g L1 CuPT处理组肝胰腺中的糖原、乳酸含量在胁迫24 h显著下降可能是由于高浓度 CuPT对机体的刺激更大，导致机体在24 h时需要消耗更多的营养物质以维持生存。综上所述，一定浓度的CuPT胁迫影响凡纳滨对虾的能量代谢。3.2CuPT胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺脂质过氧化的影响脂质过氧化被用作氧自由基应激和生物体氧化损伤程度的生物标志物，MDA是脂质过氧化的主要产物之一，其含量可以反映细胞过氧化损伤的程度，而MDA含量的增加，可能是抗氧化防御系统已经不堪重负，抗氧化酶的活性不足以防止有毒物质引起的脂质过氧化和细胞损伤（武晓会等，2018；Jiang et al.，2019）。本实验中CuPT胁迫下的凡纳滨对虾肝胰腺中的 MDA 含量呈显著上升趋势，与此前 CuPT 胁迫下华美盘管虫 Hydroides elegans（陈新等，2016）和溪红点鲑Salvelinus fontinalis（Borg&Trombetta，2010）中 MDA 含量的变化趋势一致。这证明本实验浓度的 CuPT可能引起了图4CuPT对凡纳滨对虾肝胰腺caspase3和p53 mRNA表达的影响Fig.4Effects of CuPT on mRNA expression of caspase3 and p53 in the hepatopancreas of Litopenaeus vannamei614李舒泓等：吡啶硫酮铜胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺能量利用、脂质过氧化指标和基因表达的影响凡纳滨对虾肝胰腺的氧化应激，机体产生过多活性氧自由基，最终导致脂质过氧化的发生。3.3CuPT胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶基因表达的影响抗氧化剂系统在生物体中普遍存在，它们在对抗自由基以抵抗细胞和组织的损伤中发挥着重要作用。生物体的SOD、CAT和GPx可以对抗活性氧，以保护其生物体的细胞免受氧化损伤（郭慧等，2017a）。此前有报道显示CuPT可以引起总的华美盘管虫的SOD酶活性的显著增加和抑制CAT酶的活性（陈新等，2016）。为了分析CuPT胁迫是否造成凡纳滨对虾肝胰腺组织的氧化应激，本实验对 CuPT胁迫下凡纳滨对虾的肝胰腺抗氧化酶MnSOD、GPx、CAT基因进行了基因表达水平分析，结果发现在CuPT胁迫下，凡纳滨对虾肝胰腺中的MnSOD表达水平在不同浓度组中均在12 h开始被显著诱导，高浓度组在24 h被抑制，但在48 h又显著升高。据报道，在亚硝酸胁迫下凡纳滨对虾血细胞的MnSOD基因表达也呈现相似的趋势，在胁迫的早期（8 h）和后期（48 h）均表现为显著上调，这可能是因为MnSOD在胁迫的早期和晚期起到更重要的抗氧化作用（Guo et al.，2013）。此外，抗氧化酶基因GPx在胁迫3 h均显著下降，12 h显著升高后恢复到正常水平，这与游离棉酚胁迫下鲤Cyprinus carpio 肝脏的 GPx 基因表达趋势相似（张静等，2020）。CAT表达水平在胁迫后短时间被抑制后，在 12 h 和 24 h 显著升高，在 48 h 又被显著抑制，这与副溶血弧菌Vibrio Parahemolyticus胁迫下罗氏沼虾 Macrobrachium rosenbergii CAT 基因的表达趋势相似（孔嘉明等，2021），但是CAT表达水平只在高浓度处理组显著升高，低浓度处理组没有显著变化，这可能是CAT对高浓度处理组的响应更敏感。总的来说，CuPT胁迫下，凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化基因的表达水平发生显著变化，可能是为了减轻肝胰腺的氧化损伤，但由于CuPT的持续胁迫，MDA在机体内的持续累积，抗氧化系统的清除修复能力开始下降，无法清除过多的活性氧自由基，活性氧的产生与清除之间的动态平衡遭到破坏，导致氧化应激的出现。3.4CuPT胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺凋亡相关基因表达的影响虽然细胞抗氧化防御系统在对虾免疫中有着重要作用，但细胞损伤是不可避免的。细胞凋亡可以清除不需要的、受感染的或有害的细胞。caspases-3是参与细胞凋亡的重要因子，细胞凋亡的过程基本上都是首先激活上游的一些细胞凋亡影响因子，接着活化caspase-3，最终导致下游一系列细胞程序化死亡发生（Chang et al.，2008；郭慧等，2017b）。p53是细胞凋亡信号传导的标志物，p53基因具有调节细胞周期、凋亡和衰老的能力（Qian et al.，2014）。本实验中，发现caspase3和p53基因的显著表达均出现在胁迫中期，低浓度CuPT处理组的caspase3和p53基因在胁迫的早期和晚期出现下调，这与镉胁迫下凡纳滨对虾肝胰腺凋亡基因的表达趋势十分相似，李玲（2021）认为这是由于金属硫蛋白基因的表达可能会抑制p53基因的表达，而caspas3基因表达也会受到p53表达的影响。本实验中 CuPT诱导了凡纳滨对虾肝胰腺中凋亡相关基因的显著表达，最终可能导致肝胰腺细胞凋亡的增加。本文首次研究了 CuPT 对凡纳滨对虾肝胰腺的毒性影响。随着 CuPT胁迫浓度的增加和胁迫时间的推移，凡纳滨对虾肝胰腺中的糖原、乳酸含量显著降低，正常的能量代谢受到阻碍，MDA含量显著提高，使机体出现脂质过氧化现象，导致凡纳滨对虾出现强烈应激反应，机体激活体内的抗氧化酶系统缓解氧化损伤，当应激所导致的氧化损伤超出抗氧化系统的调节范围时，凋亡相关基因表达显著增加，最终可能导致肝胰腺细胞凋亡的发生。参考文献:常志成，温海深，张美昭，等.2018.溶解氧水平对花鲈幼鱼氧化应激与能量利用的影响及生理机制 J.中国海615四川动物 2023 年 第 42 卷 第 6 期Sichuan Journal of 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