重组干扰素.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,重组干扰素,Recombinant,Interferon,1,Alick,和,Jean,发现干扰素,病毒感染的细胞能产生一种因子作用于其他细胞并干扰病毒的复制。,1957,2,什么是干扰素,https:/en.wikipedia.org/wiki/Interferon,(retrieved on January 3,2016),Passage Downloaded from rspb.royalsocietypublishing.org/on December 29,2015,3,Friedman,发现,干扰素抗病毒的作用机制,抑制病毒的信使,RNA,功能,1966-1971,4,干扰素的作用机制,Finlay McNab,Katrin MayerBarber,Alan Sher,Andreas Wack and Anne OGarra“TypeI interferons in infectious disease”.Nature reviews.Immunology:87103.,2015,2,脊椎动物感染病毒体细胞,干扰素细胞因子,IFN,激活,ISGs(interferon stimulated genes),相邻细胞及受感染细胞,抗病毒蛋白,免疫细胞,使细胞裂解,抗病毒抗体,5,干扰素,用于临床,用纯化的人白细胞干扰素成功治疗,2,例慢性乙肝患者，但是由于人白细胞干扰素原材料来源有限，未能大量应用于临床。,1976,6,关于乙肝,张焜和,乙肝病毒感染的基础与临床,江西科学技术出版社,1999,年,07,月第,1,版,第,34,页,高翔,.,乙肝病毒携带者健康歧视的法律规制研究,D.,福建,:,华侨大学,2007.,嗜肝,DNA,病毒：,HBV,本身,无毒害：慢性发作：我国,1.2,亿乙肝病毒携带者,顽强,生命力,引起免疫反应损坏肝脏,干扰素治疗乙肝：,抗病,毒作用,免疫调节作用,抗纤维化作用,7,干扰素的分类及应用,https:/en.wikipedia.org/wiki/Interferon,(retrieved on January 3,2016),主要适应症：,几乎能够抵抗所有病毒引起的感染,目前主要用于,乙肝,、,丙肝,的治疗,8,获得,重组干扰素,科学家们用基因工程技术在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了重组人干扰素。,1980,9,资金来源多样化,1999,1986,2002,1996,2002,2003,1989,体外诱生制备,:,Sendai,诱导人白细胞,人源转化细胞系培养:,多亚型混合干扰素,基因工程,E.Coli,发酵,:,重组人干扰素,工程,CHO,细胞系构建,动物无限细胞系培养,假单胞杆菌工程菌发酵,IFN-n3,批准上市,工艺复杂,产量低:,1g=3,亿,ml,来源困难,价格昂贵,潜在血源性病毒污染,IFN-n1/Wellferon,首次实现大规模商业化生产,活性低,退出临床应用,无糖基化,无,N-met,无活性包涵体,166aa,糖基化蛋白,22.5 ku,分泌表达,产量低成本高,过程严格,IFN-2b/,Alferon,安福隆,无糖基化可溶性蛋白,具有天然分子结构,具有生物活性,生产工艺的发展,10,甘乐能上市,世界上第一个重组人干扰素,IFN-2b,Intron A,由美国,Schering Plough,公司上市，被,FDA,批准于治疗慢性乙肝。,1986,11,甘乐能,适应症,:,本品用于慢性乙型肝炎，慢性丙型肝炎，肾细胞癌，恶性黑色素瘤等疾病的治疗。,用法用量：,皮下注射。,不良反应：,常见为发热、疲乏、头痛和肌痛。,禁忌：,对重组干扰素,-2b,及其所含组分有过敏史的患者禁用。禁止使用本品和利巴韦林联合治疗。,注意事项：,本品含稳定剂间,-,苯甲酚，某些患者可对此发生过敏反应。详见说明书。,一个重组干扰素的典型事例,A specific example of recombinant IFN,12,生产工艺,制剂研究,给药方式,市场分析,研究进展,13,这可能是因为,1,重组人干扰素生产工艺,基因工程假单胞杆菌的构建与保藏,干扰素的发酵工艺过程,干扰素的分离纯化工艺过程,产工艺,14,构建与保藏,发酵,分离纯化,菌种建立,菌种特性,菌种库,工作菌种库,干扰素,-2b,基因的克隆,表达载体的构建,工程菌的构建,制备白细胞,病毒诱导,分离,mRNA,反转录酶,合成,cDNA,、,PCR,ATG,TGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGGTTGCCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCACACGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTCGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTCAGGAAATACTTCCAAAGAATCACCTCTACTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAA,TGA,参考文献：孔晓清，张忆疆,.,假单孢杆菌发酵生产,-2b,干扰素工艺,2010,15,构建与保藏,发酵,分离纯化,菌种建立,菌种特性,菌种库,工作菌种库,干扰素,-2b,基因的克隆,表达载体的构建,工程菌的构建,IFN,基因,连接质粒,转化,E.coli,筛选,鉴定阳性克隆,测序：,人,IFN-2b,基因序列，,501bp,，,165aa,pVG3,参考文献：元英进，制药工艺学，,2007,，,P223,16,构建与保藏,发酵,分离纯化,菌种建立,菌种特性,菌种库,工作菌种库,干扰素,-2b,基因的克隆,表达载体的构建,工程菌的构建,转化,腐生型假单胞杆菌,筛选,高表达、稳定遗传的工程菌,获得原始菌种,参考文献：元英进，制药工艺学，,2007,，,P223,17,构建与保藏,发酵,分离纯化,菌种建立,菌种特性,菌种库,工作菌种库,具有宿主菌的特征：,细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。,菌落：直径,2.5-3.0 mm,，灰绿色半透明状，粘稠。,生化特性,：,Ser,，,L-Val,、,D/L-Arg,和,L-Thr,为碳源。,工程菌的特征：,Sm,R,、,Tc,R,、,Ap,R,具有生产干扰素能力,18,构建与保藏,发酵,分离纯化,菌种建立,菌种特性,菌种库,工作菌种库,加入甘油,原始菌种,传代扩增,冻干保藏,QC,：菌种特性、生产能力、质粒稳定性,菌种检查合格后，方可投产。,19,构建与保藏,发酵,分离纯化,菌种建立,菌种特性,菌种库,工作菌种库,主菌种库,或上一代,工作菌种,库,OD,值,8.0,种子 罐,培养,摇瓶种,子培养,培养 基,Ependorf,管,OD,值,5.5,离 心,20,构建与保藏,发酵,分离纯化,发酵过程,发酵控制,生产菌种,摇瓶培养,活化,种子罐培养,放大,发酵罐培养,菌体收集,发酵液降温,发酵液离心,菌体冷冻保存,配制培养基,蒸汽灭菌,原料,21,构建与保藏,发酵,分离纯化,发酵过程,发酵控制,22,构建与保藏,发酵,分离纯化,分离工艺,纯化工艺,溶解粗干扰素,沉淀与疏水层析,阴离子交换层析与浓缩,阳离子交换层析与浓缩,凝胶过滤层析,无菌过滤分装,检测,菌体裂解,预处理,初级分离,23,构建与保藏,发酵,分离纯化,分离工艺,纯化工艺,溶解粗干扰素,沉淀与疏水层析,阴离子交换层析与浓缩,阳离子交换层析与浓缩,凝胶过滤层析,无菌过滤分装,检测,菌体裂解,预处理,初级分离,24,这可能是因为,2,制剂研究和给药方式,干扰素注射制剂,鼻腔内给药系统,长效干扰素制剂,产工艺,25,0,24,48,72,96,120,144,168,192,时,间(小时),干,扰素浓度,半,衰期平均,4,小时,1,血,清干扰素浓度为零,1,病,毒重新出现,2,降低肾脏排泄,避免酶水解,避免免疫细胞清除,普通干扰素,聚乙二醇化干扰素,WHY,PEG,Xu ZX,et al,.,Hepatology.,1998;28(suppl):702A.,Lam N,et al,.,Hepatology.,1997;26:22631.,26,PEG,分子量,半衰期,抗病毒活性,高,(,长,),低,(,短,),30KD,30KD,5KD,5KD,12KD,延长半衰期与保留活性之间的最佳平衡,WHY,1,2KD,佩乐能,27,1989,-,1999,年,，多亚型人天然干扰素,混合物,IFN-,N3,和,IFN,-,N1,获批,上市,。由于人天然干扰素因其,产量低,、活性低,且,具有潜在的血,源性病毒污染,等特点而逐渐退,出市场,。,1987,年，,Amgen,公司生产的复合干扰素产品,Infergen,（重组集成干扰素,注射液）获批上市，主要用于成年患者的,慢性丙型肝炎治疗,，不过其市场表现平平,。,1990,年，,InterMune,公司上市了第一个,rh,IFN-,产品,Actimmune,，用于,慢性肉芽肿病，重度恶性骨骼石化症,等疾病的治疗,。,1993,年，,Bayer,公司,上市第一个,rh IFN-1b,产品,Betaseron,，,用于,多发性硬化症,（,MS,）的治疗,。,2001,年，,FDA,批准,Schering Plough,公司的长效干扰素,聚乙二醇,IFN-2b,，使得给药频率减少为,1,周,1,次,。,2014,年,7,月和,8,月，,Biogen Idec,公司的长效,IFN-1a,产品,Plegridy,（聚乙二醇干扰素,-1a,）获欧盟和,FDA,批准上市，用于治疗成人多发性硬化症（,MS,），其剂量为每两周一次。,28,这可能是因为,3,市场分析和研究进展,第二大重组蛋白,五巨头垄断全球市场,新型竞争药物冲击,疾病谱差异,国内新药进展,产工艺,资料来源：,FDA,招商证券,29,第二大重组蛋白,干扰素,长效,rh-IFN,短效,rh-IFN,Biogen Idec,公司：,Avonex,（,IFN-1a,）,Merck Serono,公司：,Rebif,（,IFN-1a,）,Bayer,公司：,Betaferon/Betaseron,（,IFN-1b,）,Novartis,公司：,Extavia,（,IFN-1b,）,Roche,公司：,Pegasys,（,PEG IFN-2a,）,美国,MSD,公司：,Peg-Intron,（,PEG IFN-2b,）,近期获批：,Plegridy,（聚乙二醇干扰素,-1a,）,30,第二大重组蛋白,2003-2013,年重组干扰素在全球的销售额由,45.1,亿美元增加到,91.5,亿美元仅次于重组人胰岛素，为全球第二大重组蛋白药物，年复合增长率为,7.33%,。,31,五巨头垄断全球干扰素市场,全球销售额为,91.5,亿美元,:,Biogen Idec,Merck Serono,Bayer,Roche,MSD,2013,年，前五大公司占据约,98%,市场份额，从产品的分类看：,干扰素占据约,79%,份额，,干扰素占据约,21%,。,32,受新型竞争药物冲击,两支长效,干扰素成为丙肝和乙肝的一线用药。近年来，新的核苷类似物口服药物已占据乙肝用药主流，以,Sovaldi,为代表的突破性疗法的口服新药正在改变丙肝的治疗习惯。,干扰素在,MS,治疗地位的产品。普通,干扰素的升级,Plegridy,（聚乙二醇干扰素,-1a,）获批上市，有望成为,干扰素市场重要推动力。,33,疾病谱差异,导致国外,IFN-,国内,IFN-,全球干扰素市场中以复发型多发性硬化症为主要适应症的,IFN-,的市场占比逐年提高，而作为抗肝炎病毒的,IFN-,的市场份额却在逐年萎缩。如图,6,所示，国内基本以,IFN-,为主。,34,疾病谱差异,导致国外,IFN-,国内,IFN-,全球大约,有,250,万人,受,MS,的困扰。,欧美发病率较高，中国发病率较低,。,欧美乙肝和丙肝感染人数较低，中国拥,有全球数量最多的乙肝和丙肝患者，导致国内外干扰素产品结构差异较大。,35,国内干扰素新药的研发情况,在长效干扰素,这一领域中，通化东宝的子公司,厦门特宝公司,的产品进展速度最快，已于,14,年,1,月向国家药监局申请生产；另外,安科生物,的长效干扰素,新药也于,14,年,6,月获批临床试验，,双鹭药业,于,14,年,4,月申请临床试验,。,在干扰素,领域，目前还只有海正药业一家企业在开展新药研发工作，并于,13,年,6,月申请临床试验。,36,37,取保存工作种子批菌种，室温融化,摇瓶活化培养：,30,，,pH7.0,，,250 r/min,，,182h,检测：,OD,值和发酵液杂菌检查。,1,）摇瓶培养,干扰素生产工艺,发酵工艺过程,38,接种：接入,30L,种子罐，接种量,10%,培养：,30,，,pH7.0,控制：级联调节通气量和搅拌转速,DO,为,30%,，,3,4h,，,OD4.0,检测：显微镜和,LB,培养基划线检查，控制杂菌。,2,）种子罐培养,干扰素生产工艺,发酵工艺过程,39,接种：通入,300L,培养基的发酵罐，接种量,10%,。,控制：级联调节通气量和搅拌转速。,前,4h,：,30,，,pH7.0,，,DO,为,30%,4h,后：,20,，,pH6.0,，,DO,为,60%,，,5,6.5h,终点控制：,OD,值达,9.01.0,，,5,冷却水快,速降温至,15,以下,检测：发酵液杂菌检查,3,）发酵罐培养,干扰素生产工艺,发酵工艺过程,40,连续流离心机：冷却的发酵液，,16000 r/min,离心收集。,菌体保存：,20,冰柜，不超过,12,个月。,检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、,质粒结构一致性、质粒稳定性。,4,）菌体收集,干扰素生产工艺,发酵工艺过程,41,种子培养基：,C/N,比较低的培养基,发酵培养基：,C/N,比较高的培养基,pH,控制：加入缓冲体系,2,、培养基的配制,干扰素生产工艺,发酵工艺过程,42,DO,：高时，产物明显提高；同时质粒的稳定性提高,策略：加大转速，增加通气量，必要时用纯氧,3,、,DO,控制,干扰素生产工艺,发酵工艺过程,43,温度：要考虑菌体生长和产物的积累,策略：前期控制在,30,，保证菌体快速生长，后期控制在,20,积累产物，同时防止产物降解,4,、温 度,干扰素生产工艺,发酵工艺过程,44,菌体生长：,pH 6.8,产物积累：,pH 6.0,策,略：两段培养,5,、,pH,值,干扰素生产工艺,发酵工艺过程,45,裂解缓冲液：,纯化水，,2,10,（,pH7.5,）,使用保护剂：,EDTA,、,DTDE,、,PMSF,破碎,-20,菌体：,2,厘米,搅拌：加裂解缓冲液，,2,10,，,2hr,冻融,:,细胞完全破裂，释放干扰素。,1,、菌体裂解,一定的,pH,条件下，细胞破裂，加入表面活性剂,(SDS,、,Triton X-100,而获得。而,pH,环境则由加入的强碱,(NaOH),或缓冲液 提供。在一定的,pH,环境下，表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解,将细胞在,-20,度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。,分离纯化工艺,干扰素生产工艺,46,加絮凝剂,聚乙烯亚胺,：,2,10,，搅拌，对菌体碎片,进行絮凝。,加凝聚剂醋酸钙溶液：,2,10,搅拌，对菌体碎,片、,DNA,等进行沉淀。,离心：,连续流离心机：,2,10,，,16000 r/min,收集上清液：含有重组干扰素蛋白质,杂质沉淀：,121,、,30min,蒸汽灭菌，焚烧处理。,2,、预处理,菌体自溶、核酸、蛋白质及其它有机粘性物质造成的浑浊，如果不经过适当的预处理就直接进行过滤或离心沉降，不但速度极慢，甚至得不到澄清的蛋白质,分离纯化工艺,干扰素生产工艺,47,盐析,:4M,硫酸铵，,2,10,，搅匀静置过夜。,离心：连续流离心机，,16000 r/min,保存：收集沉淀，粗干扰素，,4,。,3,、初级分离,分离纯化工艺,干扰素生产工艺,48,1,、溶解粗干扰素,配制纯化缓冲液：超纯水，,pH7.5,磷酸缓冲液，,0.45 m,滤器和,10 ku,超滤系统，百级层流下收集。冷却至,2,10,。,检查：缓冲液的,pH,值和电导值。,溶解：,2,10,，匀浆，完全溶解。,分离纯化工艺,干扰素生产工艺,49,2,、沉淀与疏水层析,等电点沉淀（,1,）：磷酸调节至,pH 5.0,，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。,疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中，除去非疏水性蛋白。,洗脱与收集：,0.01M,磷酸缓冲液（,pH8.0,）。,分离纯化工艺,干扰素生产工艺,50,2,、沉淀与疏水层析,等电点沉淀（,2,）：磷酸调节,pH4.5,，调节,电导值,40 mS/cm,，,2,10,，静置过夜,超滤：,1000 ku,超滤膜过滤，除去大蛋白。,透析除盐：调整溶液,pH 8.0,，,10 ku,超滤膜，,0.005 M,缓冲液。,分离纯化工艺,干扰素生产工艺,51,3,、阴离子交换层析与浓缩,0.01M,磷酸缓冲液（,pH8.0,）平衡树脂,盐浓度线性梯度,5,50 mS/cm,进行洗脱,配合,SDS-PAGE,收集干扰素峰,浓缩：调整溶液和电导，,10 ku,超滤膜，,0.05M,醋酸缓冲液（,pH5.0,）中透析。,离子交换剂由大量带电荷的侧链和不溶性的树脂结合而成。,DEAE,（二乙胺乙基）等阴离子树脂侧链带正电荷，可与带负电荷的蛋白质结合；,CM,（氯化聚乙烯）等阳离子树脂侧链带负电荷，可与带正电荷的蛋白质结合。,先用离子强度较低的缓冲液上样和洗脱，然后用离子强度高的缓冲液洗脱,分离纯化工艺,干扰素生产工艺,52,4,、阳离子交换层析与浓缩,用,0.1M,醋酸缓冲液（,pH 5.0,）平衡树脂。,上样，相同缓冲液冲洗。,盐浓度线性梯度,5,50 mS/cm,进行洗脱,配合,SDS-PAGE,收集干扰素峰。,浓缩：,10 ku,超滤膜进行。,分离纯化工艺,干扰素生产工艺,53,5,、凝胶过滤层析,洗涤液：,0.15 M NaCl,的,0.01M,磷酸缓冲液（,pH7.0,）清洗系统和树脂,上样，相同缓冲液进行洗脱。,合并干扰素部分,分离纯化工艺,干扰素生产工艺,54,6,、无菌过滤分装,0.22 m,滤膜过滤干扰素溶液,分装,20,以下的冰箱中保存。,分离纯化工艺,干扰素生产工艺,55,7,、检测项目,干扰素鉴别试验,干扰素效价测定,蛋白质含量，纯度测定，分子量,宿主残余蛋白、残余,DNA,干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，,N,端序列,其他：热原，内毒素，残留抗生素,分离纯化工艺,干扰素生产工艺,56,