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Waters故障指南
目录
1 色谱柱使用寿命
27最理想的流速
2 保留时间变化
28 键和的碳链
3 保留时间漂移
29 pH缓冲
4 不同色谱柱和不同批次之间的重现性
30 流动相组分
5 样品配制问题
31 柱子污染
6 峰形拖尾原因
32 方法验证
7 正相色谱
33糖类分析中的双峰
8 系统体积，死体积，滞后体积
34 方法控制
9 梯度方法转移
35 流动相pH
10 系统堵塞
36 改善信噪比
11 色谱柱塔板数
37 过载
12 柱压
38 柱子的耐用性
13 峰面积变化
39 快速分析和柱压
14 鬼峰
40 反冲柱子
15 pH对保留时间的影响
41选择性的改变
16柱平衡
42 新方法
17柱改性
43 倒峰
18 复杂的样品
44 麻烦，冗长乏味，费时
19 疏水坍塌
45 快速分析
20 基线噪音
46 LC/MS的缓冲液
21 小孔柱
47 反相色谱中的碱性缓冲液
22 样品溶液
48 柱后衍生
23梯度比例
49 梯度滞留体积
24 柱子保存
50 缓冲能力
25 离子对色谱
51流速的变化与定量关系
26 反相填料的水解稳定性
52 极性物质的分析

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1 色谱柱使用寿命
问：我的色谱柱进样大概100针后峰形变差了，踏板数很低，怎么回事？
答：100针确实很少，一般情况下使用时间会长很多的。首先我们要确认你的使用条件是不是导致色谱柱寿命下降的原因。
两种基本情况：
1 在相同实验中以前使用的色谱柱寿命长很多
2 在本实验中用过的所有的色谱柱在使用相同次数后全部损坏
如果是第一种情况，应该检查一下实验是否保持一致。样品的组成改变了吗？样品中强吸收的污染物会破坏色谱柱的柱效。或者管路的密封圈是否完好？脱落的密封圈会堵塞色谱柱过滤器和填料的顶层，从而影响样品的分布。
如果可以确认色谱条件没有变化，那么可以推测是柱床松动的原因。在实验室和运输过程中色谱柱剧烈的震动都会导致柱床松动。（色谱柱有没有掉到地上？）或者也有可能使生产商的问题。而且这种问题标准色谱柱检测中心是检测不出来的，只有在用过一段时间后才会显露出来。这种情况生产商会免费替换色谱柱。

问：那些生产商真好，但是我的情况不是这样的。我的色谱柱总是用不了多长时间。有时候100针，有时候200针。200针还可以忍受，但是100针太差了。色谱柱开销太大了，我该怎么办？
答：我完全同意你所说的。我们必须要找到原因然后看看我们能做些什么。
最大可能是样品中的成分吸附在色谱柱的顶端。可能是在流动相中不溶的沉淀物或者是强吸收的物质。随着进样的增加这些污染物在色谱柱顶端累积，阻止样品正常吸附和扩散。从而导致峰形变差。通常这种问题和柱压升高同时出现。

问：嗯，可能就是这个原因。我应该怎么避免这种问题呢？
答：有几种方法可以采用。一，采用合适的样品准备技术处理样品。用和分析柱相似的固相萃取柱进行固相萃取（SPE：solid phase extraction）1效果很好。
另外一种非常有效的方法是使用保护柱。保护柱是作为牺牲柱装在色谱柱前使用的，出现问题的时候就会被替换掉。为了获得最好的分析效果，保护柱的填料和装填技术必须和分析柱一样。如果用不同品牌的填料就不能获得最佳的分析性能和保护作用。不要用大些的颗粒型号，大的颗粒或装填不好的预柱会因谱带扩展而导致分离效果变差。

问：使用预柱听起来不错，还有其他方法吗？
答：还有其他一些方法，但是他们都有缺陷。
我不提倡用那些可能溶解色谱柱顶端污染物的溶剂去冲洗柱子。很多情况下，这个方法是没有作用的。例如，如果沉积在色谱柱顶端的污染物是蛋白质，你冲洗的时候他们已经变性很久了，甚至可能交联在一起，变得难以溶解。此外，通常色谱柱是处于水解平衡状态，而每次冲洗都会除掉水解键合相。因此，重复的冲洗柱子会加速柱子的老化。而且，冲洗后还要用流动相平衡柱子，如果是做离子对色谱的话会消耗大量的时间。
另一个经常用的方法是反冲柱子。如果用和流动相不同的溶剂冲洗会产生和上面相同的问题。如果用流动相的话，需要很长的时间才能除去污染物，也有可能根本就没作用。同时，反冲柱子会削弱柱子。尽管现在的装填技术可以使柱子承受反冲，但是一般情况下不要采取这种做法。

问：那么最好的建议就是使用预柱了？
答：绝对是。预柱也没那么贵-一般随品牌和型号的不同价格在10$-50$之间，而他们所保护的柱子的价格是预柱的10倍左右啊。而且他们还可以避免其他来源的污染物的，这些污染物更加难以发现。这些来源包括比如流动相中的灰尘，泵脱落的密封圈的碎片，或者从流动相吸附的污染物等等。其中有些难以对付，而保护柱就可以阻挡这些。

问：还有其他缩短柱子使用寿命的原因吗？
答：有的，但是只要你按照生产商的说明使用柱子的话一般很少发生。
有一个可能就是流动相pH超出使用范围而导致的柱子坍塌。样品用强酸或强碱溶解的话也会发生
另外，一些特别的柱子有特别注意的地方
例如氨基柱可以和醛，酮反应。氨基柱在不含缓冲盐的水溶液中会显强碱性，分解部分硅胶。
暴露在错误溶剂中的柱子也会发生坍塌。因为这些柱子是基于非常松散的结构。他们是因颗粒之间的黏着而部分的结合在一起的。如果置于能破化这种黏着的流动相中，柱床很有可能会坍塌。氰基柱在中性溶液，苯基柱在THF中有时就会发生这种问题。这也是不要冲洗柱子的另一个理由。

2 保留时间变化

问：我的样品峰的保留时间不一致，什么原因？
答：首先我们要知道是什么样的变化，这有助于我们找到问题潜在的原因。如果在连续进样过程中出峰时间不规则的变化，那么首先查看一下泵和溶剂混合装置。可以用量筒和秒表来测定流速，从而确认泵是否在工作。在其中一种溶剂中加入示踪剂，通过观察基线确定流动相的比例是否发生变化。如果流动相的比例不变，基线就是平稳的。如果流动相的比例有变化，基线会发生相应的变化。比如你当你是使用紫外检测器的反相色谱法时，可以在有机溶剂中添加0.1%的丙酮，在254nm监测基线。另外，你也可以手动配制流动相而不用经过溶液混合装置。这样如果保留时间没有变化，那么问题就是在混合装置这里。

问：连续进样过程中保留时间还是相当一致的，但是隔天进样的话就不一样了。答：这种情况的话不大可能使仪器的问题。最大可能是流动相组成的问题。在反相色谱中，保留因子k和流动相中有机相的比例是成指数关系的。通常，有机相变化1%，保留时间会变化5%-15%，一般是10%。这就是说你要非常准确的配制溶液。最好是按重量而不是按体积来配制。
另外，脱气的方法也会导致保留时间变化。最好是真空超声1min。这种方法溶剂蒸发的最少，效果很好。另外还可以采用氦气脱气法。在流动相和氦气达到最初的平衡后，应该降低氦气的流速。否则氦气会带走溶液的蒸气，从而改变溶液的比例。
如果你的样品时离子型或者可以电离的化合物，控制流动相的pH就变得很重要了。pH变化0.1会导致保留时间变化10%。所以要准确的测量pH，并且要校正好pH计。在反相色谱中随着pH的增加，酸性化合物保留时间缩短，而碱性化合物延长。
顺便提一下，我的老师经常说：一个缓冲液之所以被称为缓冲液是应为他对pH有缓冲作用。如果没有缓冲作用，就不是一个缓冲液了。比如醋酸铵溶液就只是醋酸铵溶液，它不是缓冲液。一个醋酸盐缓冲液有醋酸离子和醋酸。如果两者在溶液中等量存在，溶液的pH就是就是该缓冲液的pK值，醋酸盐的pK值是4.75。缓冲液在pK值处有最大缓冲能力。

问：我以前都不知道到控制流动相的组分和结果的重现性有这么密切的关系。还有其它需要注意的变化吗？
答：另外一个重要的因素是温度。如果所有的峰的保留时间都朝同一个方向变动，可以推测是温度的影响。通常温度每变化1℃保留时间变化1%-2%。一般情况下影响没有那么大。但是有的地方在周末把取暖器或空调关掉了，发现在周末自动进样的结果和平常有差别。显然这种问题用柱温箱就可以避免。
在反相色谱中检测离子型或离子化的化合物时，保留时间会因缓冲液的离子化能力不同而变化。但是这种影响微乎其微，通常都可以忽略的。标准情况下缓冲液的摩尔数改变20%保留时间会改变1%。因为配制缓冲液经常是称量的，所以不大可能犯这么大的错误。

问：有没有其他一些特别的情况需要考虑一些额外的参数？
答：有的。在离子对色谱中，离子对试剂的浓度会影响离子型化合物组分的保留时间。带有和离子对试剂相反电荷的分析物的保留时间会缩短，带同样电荷的会延长。中性化合物几乎不受影响。在低浓度情况下，比如5mM/L，样品和离子对试剂相互作用（竞争吸附），保留时间随离子对试剂浓度的变化呈比例变化，在高浓度情况下，比如10mM/L左右，吸附剂的表面的离子对试剂呈饱和状态，此时离子对试剂浓度的变化不会导致分析物保留时间的改变。在开发方法的时候应该考虑到这点。如果想要你的方法对某一变量不敏感的话可以这样做。
正相色谱的保留时间对流动相中的极性成分非常敏感。任何情况下水都是一个麻烦。不同数量的水导致不同的保留时间。有一个窍门是使用半饱和水的非极性溶剂比如正己烷和二氯甲烷来避免这个问题。使用方法是这样，取一定体积的溶剂，加入一些水，搅拌使水呈饱和状态，混合该水饱和溶剂和等体积的不含水的溶剂。该过程可使含水的非极性溶剂得到非常好的重现性。同样也可以防止保留时间的漂移，下面将详细介绍。

3保留时间漂移

问：我的色谱峰保留时间发生漂移，会是什么原因呢？
答：这个问题很有意思。原因有很多，让我们一个一个来看。人们通常认为保留时间漂移是平衡的问题。如果你是做正像色谱用纯硅胶柱的话就很有可能是这个问题。正像色谱的保留时间对吸附在硅胶表面的水的含量是非常敏感的，所以流动相中溶有水的话，保留时间就会漂移。因为水在正己烷或二氯甲烷等溶剂中的溶解性非常低，所以柱子要很长时间才能平衡好。我曾碰到过一个例子，用非常纯的正己烷平衡一个星期后保留时间还是漂移。所以我建议避免使用非常纯的试剂。通常使硅胶达到水平衡的做法是使用半饱和水的试剂。制备方法是一体积的水饱和的疏水试剂：一体积的纯试剂混合。这个方法可以大大缩短平衡的时间。
在反相色谱中，通常很快就可以平衡的。只需要几个（5-10）柱体积的流动相就可以。当然并不是所有情况都这样。一个典型的例外就是含有离子对试剂的离子对色谱。离子对试剂的使用量一般是2-5mmol/L或更少。它们吸附在反相键和相表面，表面浓度在0.5-2μmol/m2。键和相的比表面积为330m2/g，一根4.6mm*250mm的柱子含有3g的键和相，其表面积达到1000m2。要1L的2mmol/L的离子对试剂才能平衡好柱子。当然这只是极限的情况，不过一般用几百mL平衡柱子也不少见的。不要把用过离子对试剂的柱子换成有机相保存过夜，因为换溶剂的过程中离子对试剂被洗脱下来，而再平衡又需要很长时间。

问：这些现象都有一个共同点：流动相中含有低浓度的强吸收的物质。这就是导致保留时间漂移的普遍原因吗？
答：是的。其他的没这么普遍。不过强吸收的物质也可能来自样品。这种情况下强吸收的物质会随着进样的增加而累积，从而导致色谱柱化学性质的改变。样品中赋形剂的吸收就是一个例子。
通过观察保留时间改变的比率可以判断污染物是来自于流动相还是样品中。
下面来做个实验：
1 重复进样几次，如：重复进4次，每次运行1小时。
2 不进样，泵入相同时间的流动相
3 重复第一步
4 将保留时间作图
A：相对于时间
B：相对于进样次数
如果第一张图谱呈平滑的曲线，就是流动相中携带有污染物。如果第二张图呈平滑的曲线，样品就是污染物的来源。

问：还有其他导致保留时间漂移的原因吗？
答：有的。也有可能流动向组分随着时间而变化的。你如果不是使用现在带有在线混合能力的仪器的话，将会发现流动相的组分在慢慢的挥发。特别是在用氦气脱气的时候更加明显，所以应该将氦气的流速控制到最小。
一个经常被低估的原因是键和相的水解。生产厂家通常规定一个pH范围，超过这个范围键和相救不稳定了。这个范围通常是2-8或9。尽管如此，还是要小心对待这些极限条件的，分界线不是非常明显的。水解通常还取决于其他条件的，比如温度和有机溶剂，在这个pH范围之类也有缓慢的水解的。
键和相在中等pH条件下是最稳定的，pH3-5，低温。等度色谱条件优于梯度。当然水解确实也在等度中发生，键和相通常会自身吸附，处于一个自身平衡的状态。但是在梯度或清洗柱子的时候，使用到高浓度的有机溶剂时，自身平衡被打破，水解的键和相就被冲出了柱子。

问：我会记住这些的。温度的改变会导致保留时间漂移吗？
答：是的，温度也通常被考虑到的。如果你让仪器自动进样过夜或过周末，就会发现保留时间随着实验室温度的改变而产生漂移。在许多地方，为了节能在晚上或周末室温会设置到不同的温度。按常理来说，室温每改变1℃，保留时间改变1%-2%。联系柱压的增加导致保留时间漂移的现象。柱压增加可能是因柱子污染物造成的，但是即使是过滤头堵塞都可能导致保留时间的改变。压力会推动流动相通过过滤头，该过程中的摩擦会加热流动相。这种温度的增加就会导致保留时间的变化。
另外还有一些导致保留时间漂移的原因，但是都非常少见。
使用高覆盖率的键和C18末端完全封口的色谱柱在少于一定比例有机溶剂的流动相中因不能完全润湿会导致平衡很慢。这将会使流动相和固定相失去接触而导致“疏水坍塌”，即固定相表面一些区域因键和相的自我吸收而导致与样品的交互作用减少。及时跑几个柱体积的有机溶剂就可以再生柱子了，最好是使用流动相中的有机修饰剂（？）。这种现象在不是末端键和的色谱柱中很少或几乎没有碰到。

4 不同色谱柱和不同批次之间的重现性

问：我要开始开发一个新的HPLC方法。验证之后，该方法将转道QC实验室并将使用许多年。我担心该方法的长期的重复性，特别是柱子的长期重复性。怎样才能确保好的重复性呢？
答：首先，我要表扬你在开始做这个方法的时候就能考虑到这个方面。如果可以预料到该方法将要使用好几年，在选择柱子方面就要做些功课。要想使柱子在该方法的可预见的适用期内可资使用，就要选择一些大的生产厂家。另外，要选择一种标准的表面化学物质-比如C18或C8-而不是那些新奇的或很少使用的。换句话说，柱子的选择要保守点。
下一个标准才是柱子的重复性，如果你或你的同事以前用一根柱子有很好的重复性，这是一个很好的起点。同时也要考虑生产商提供的信息。近来有的厂家开始印刷他们的说明和不同批次的重复性实验的结果。你可以从厂家得到这些信息然后细心对照。

问:我该从这些信息中寻找什么呢？
答：让我往后回一点，解释一下不同柱子和批次之间重复性的不同方面。下面，就说一下反相填料，因为他们更加普遍。
如果你用同一批填料的不同柱子，将会得到不同的踏板数（峰宽），不同的柱压，不同的保留时间。保留时间与填料密度和柱体积呈比例改变，而柱体积则取决于柱子的内径。这个改变对你的方法应该是没什么影响的，因为所有峰的保留时间都呈比列的改变，而分离度还是没变。这个原因导致的保留时间变化的RSD通常在3%左右，但是如果生产商对柱子的硬件有很好的控制，RSD也可以低到1%。柱子踏板数的变化会影响方法，特别是做双峰的时候，它们很少能达到基线分离的。尽管2-3%的踏板数的标准偏差已经可以达到，但通常还是在+/-10%，记住踏板数是个平方数，分离度仅仅取决于踏板数的根。所以踏板数2%的偏差相当于峰宽1%的偏差。你要确认一下柱子的厂家是有踏板数的上下限，还是只有一个下限，上下限都有比较让人满意。
同一装填程序的柱子其柱压的重复性是相当好的，同一批次变化应不超过+/-5%。

问：那么批次之间的重复性怎么样呢？
答：如果你注意一下批次间的色谱参数，你会发现同参数会不同，更重要的是批次间分离的选择性也会改变。就是说峰的相对保留会改变，比如他们在色谱图中的相对位置，这对你方法的确定性是不利的
这种改变是你要尽量避免的，所以你要从厂家那里得到一些消息，他们是怎么确保批次之间重复性的，这包括一些物理，化学，色谱方面的测试。在物理测试中，最重要的一项是装填的表面积，该项参数的变化会直接导致保留时间的变化。所以你要知道厂家认可的批次间表面积改变的幅度是多少。通常情况下幅度是+/-10%，但是+/-5%也是可以达到的。
化学方面的参数最重要的是键合相的表面覆盖率。通常用多少umol/m2表示。许多厂家并没有直接给出这个参数，而只说明了C的百分含量。我们希望看到的这个代替性的说明以及一个紧凑的幅度，通常是+/-10%，低于+/-4%的也可以达到。
最后你要知道厂家的色谱重复性测试。通常色谱柱会附带一张色谱图，检测的是一些简单的中性化合物的混合物，例如甲苯，萘和蒽等。但是这不是一个好的批次间重复性测试。因为这些中性疏水化合物的相对保留重复性相当好，对装填中表面覆盖率的改变是相当不敏感的。好的批次间重复性测试还应在混合物中添加强碱化合物。在精心设计的测试中，精选的碱性化合物主要与残余硅羟基作用，而中性化合物则主要与键合相作用。只有含有2种化合物的重复性测试才是让人信服的。如果一个厂家是这样测试的并且有好的重复性，那么他的柱子会更加让人放心。

问：我不知道厂家的测试与我的化合物的检测有什么联系，我应该怎样在我的检测中确保一个好的批次间重复性呢？
答：你说的很对：上面的消息只能让你有一个比较大的机会确保重复性。但最后必须用你自己的检测来做重复性测试。有些厂家提供一整套的设备包括不同装填批次的柱子来做这个测试，另外有的厂家则按要求提供不同批次的柱子，你要了解你所得到的东西。同一装填批次的色谱柱是没有用的，你需要的是用不同键和反应装填的柱子。如果同一批次是不同天内装填，然后色谱柱编号又不同的时候的时候，厂家可能自己也会迷糊的。所以你最好询问2次，确保厂家给你的是你要的。
你可能需要3根不同批次的色谱柱来为你的方法做重复性测试。如果批次间的改变不影响你的检测，那么接下来的时间你的方法应该有一个好的重复性。

5 样品配制问题

问：我在样品配制过程中碰到一些问题。我是用反向吸附剂（reversd-phase sorbent）进行固相萃取的。通常回收率都有80%或更多，但是有时候只有50%或更低。问题出在哪呢？
答：你的问题比较普遍。我发现回收率低通常是由处理方法造成的。80%的回收率对分析来说可能足够，但是对方法耐用性来说则不够。看来有一个原因导致样品不完全回收，损失20%-50%。我们要找到损失的20%-50%到哪里去了。

问：ok，我们怎么找？
答：有四个方案：
1 分析物在固相萃取前丢失
2 分析物在吸附过程中没有完全吸附
3 一部分分析物在清洗过程中被洗掉
4 部分分析物在洗脱过程中仍然留在固相萃取管中
要确认分析物是不是在吸附过程中穿过了SPE柱，我们只要在第一个SPE柱后面再接一个SPE柱就好了。如果在第二个SPE柱的洗脱液中含有相当数量的分析物，那么就知道吸附是不完全的。有几个原因可能导致不完全吸附。1 样品的浓度太高，如果这样要用水稀释样品（可电离的样品用缓冲液稀释）。2 确认SPE柱是否活化了。反相固相萃取管的活化先走有机相（甲醇，乙腈等）再用水或缓冲液平衡。然后样品才能吸附上去。很多人想省掉这些额外的麻烦步骤，但是为了保证方法的准确性这是必须的。

问：我已经按照厂家的建议活化管子了，所以应该不是这个问题。我喜欢你的加一个管子来核实吸附过程的完整性的建议。我应该怎么检查方法的其他步骤呢？
答：检查清洗过程，你要收集所有的清洗液，然后用HPLC分析。但是如果清洗过程中有干扰分析物的物质也被洗脱下来，那么就不好对清洗液中的分析物进行定量分析。这时我们可以通过下面的技术手段来解决这个问题。把清洗液蒸干，用样品的配制溶液溶解，再用同样的方法萃取一遍，如果在这个洗脱液中能检测到另一比例的分析物，那就知道了在清洗步骤中有一部分的分析物被洗脱了。另一个方法是把标准品按样品处理方法走一遍。但该方法不够严谨，因为基质会影响分析物的行为。

问：这些建议挺好的。我怎么分析残留在萃取管中的分析物呢？
答：在开始的洗脱步骤后你要用大量的洗脱液冲洗萃取管，这样可能洗脱更多的分析物。经常要用到洗脱能力更强的洗脱液。考虑一下这部分分析物为什么会有强残留。
是与残留硅羟基作用吗？--改变洗脱液的pH或缓冲能力。
是因疏水作用吗？--增加有机相的比例或改用洗脱能力更强的有机相（如用乙腈取代甲醇）。
是通过氢键与残留硅羟基作用吗？--在乙腈或四氢呋喃中添加甲醇或许有所帮助。

问：OK，如果我在所有的步骤中都没有发现丢失的比例，那么是否可以排除固相萃取过程的问题呢？
答：是的。我们就要探索是否在其他配置过程丢失的。可能是强烈吸附在样品瓶上。强疏水的分析物可能会吸附道聚乙烯瓶的壁上。强酸物质可能与玻璃瓶表面的硅羟基结合。分析物也可能吸附在基质的固定相上，或者与基质的其他组分结合（如蛋白质）。这些情况下更难分离。
综上，要使回收率尽量接近100%，建立方法的时候要有很好耐用性。尽管环境的影响可能导致回收率重复性不好，但是其几率要低于耐用性不好的方法。
如果你能在开始的时候就能达到好的回收率，那么洗脱液组分或装填物质的较小变化都不会影响你的方法。唯一可能改变回收率的是SPE柱基床的质量。如果基床上有个空隙，流速将不均匀。分析物可能较早的就冲出管子。你可以粗略的观察下你的设备避免这个问题。空隙对方法的影响是非常明显的。
6 峰形拖尾原因

Q：怎样才能避免拖尾?
A：首先要找到拖尾产生的原因，拖尾通常是由于柱外接口体积扩大，柱床污染以及被分析物与键合活性位点相互作用而产生的．显然要解决问题必须对症下药．

Q：怎样检查拖尾的原因？
A：首先要仔细观察色谱图，在不知道样品的性质和色谱条件的情况下，色谱图可以提供很多线索，再借助其余的条件可以验证基于色谱图的猜想．
第一检测峰高。如果你使用了紫外检测器并且峰高在1AUFS（Absorbance units, full scale？），可以猜测是柱子过载了．一般情况下,化合物的extinction coefficients是1000．为了确认是否真的过量,我们需要知道进样量是多少.通常孔径为100埃的全多孔填料的限度为100ug.
以上都是一般的经验方法，可以再进１／１０浓度的样品看看峰形是否有改善．

Q：好的，但是如果在低浓度情况下依然有拖尾怎么办？
A：同样要仔细观察色谱图．如果图谱中有很多峰，看各个峰形是保持一定的拖尾程度还是随着时间推移峰形有一致的变化趋势．如果图谱中前面的峰比后面的峰拖尾的更厉害，可以考虑柱外效应的影响．柱外效应对峰的影响与峰宽成反比，所以对前面的峰影响比后面的峰影响大。2种柱外效应值得考虑
1 柱外峰展宽
2 detector time-constant
在连接管路，进样器和检测器的峰展宽可导致色谱图中前面峰的拖尾。你有没有使用与柱子不配套的管路连接到仪器上？最近有没有更换系统的管路。如果换了你要查看下管路的类型。（进样器到检测器应使用内径为9/1000’’的管路，1ˊ=0.3048m 1〞= 25.4mm）另外要检查所有连接管路是否都合适。通常柱外效应产生的原因是不同厂家使用了不同长度的管路来连接箍头和柱子。在5um色谱柱中，15ul的柱外峰展宽的差别会导致峰形产生3ml的明显改变。
大的constant-time也能导致前面的峰比后面的峰更加拖尾。默认的时间是1s，如果用的是5um的色谱柱，可能有2-3min的失真。时间越长影响越大。
如果色谱图中所有峰的拖尾程度大概一致，那么有2个可能：
1 柱床损坏
2 图谱中所有样品组分化学结构类似，拖尾是因化学效应产生的
第一种情况，要检查柱子是否损坏，按标准条件最好是按厂家推荐的方法做。通常柱子可能是吸附了一些污染物或颗粒，用适当的溶剂可以洗脱掉（如反相柱用THF），但是如果是柱床改变了就不可能修复了。
第二种情况，化学作用可能是拖尾的原因。如果色谱图中只有一些峰是拖尾的而另外的峰形是好的，那么很有可能是化学效应导致的拖尾。

问：这些化学效应是什么东西？请帮我说明一下!
答：化学效应有好几种，最常见的就是分析物与不均一的活性表面的相互作用。典型的就是强碱在反相柱中的拖尾。这种类型的化合物能与填料表面的残留硅羟基和键合相发生强烈的作用。如果硅羟基基团在填料表面形成一个不均一的簇落，拖尾就发生了。

问：我怎么样才能排除由化学效应导致的拖尾呢？
答：首先，要考虑一根不会产生这种现象的柱子。一些新设计的反相填料可以尽量的减少碱基的拖尾。第二，调节流动相的pH或者在流动相中添加有机基团与分析物竞争结合活性位点都能改善拖尾。这是因为硅羟基亲和作用主要是离子交换反应。在酸性pH下，很少的硅羟基带负电，所以带正电的分析物就不怎么拖尾。三乙胺经常用作竞争基团。但是在所有的竞争基团中，疏水性越强作用越好，例如正辛烷和四丁基铵盐。
如果硅羟基亲和作用不是离子交换而是氢键结合，可以通过改变溶液的氢键结合性能来改善峰形。例如作为流动相的有机改善剂来说甲醇比乙腈的作用更好。
同样的情况也可以在正相色谱中遇到。可以采取同样的措施来抑制拖尾。在流动相中添加乙醇或乙腈作为极性改善剂能对拖尾产生明显的改变。
另外还有一些拖尾的原因，但遇到的比较少。样品污染物吸附在柱头筛板或进样器中也有遇到的。也有可能分析物在色谱分析过程中发生化学变化，如分析物降解或不同分子形式之间缓慢平衡等。

7 正相色谱

问：我总是用反相色谱而尽量避免正相色谱。因为我的同事和我说正相比反相难。是真的吗？
答：很不幸，这种说法确实有一定的正确性。但是只要掌握了正确的知识就可以解决一些困难了。
最常见的问题是保留时间的改变。这种改变通常是由于流动相中的一些强极性的物质造成的，特别是水分。也有可能是甲醇和乙腈，它们通常被加入到流动相中以控制保留和选择性。
水分总是或多或少的存在与所有的有机溶剂中，含量通常是ppm级。表1是正相使用的非极性溶剂中水的溶解性。所以如果没有经过特别的前处理的话，流动相中的水分含量就会差异很大。但是使用无水溶剂也不可取，因为要花费很长时间（报道说要数天）来使柱子达到平衡。含有饱和水的溶剂也不行，水分会聚集在填料孔中，色谱柱就变得不均一了。所以我们要的是一个水分含量适中而且可控的溶剂。一个在用的可重复的办法是制成水半饱和的溶剂。方法很简单。把溶剂两等分，一份制成水饱和的。大概是加1-2mL的水到500mL的流动相中，然后搅拌半小时，除去多余的水，两份再混合。这就把原来的无水溶剂变成水半饱和的溶剂了。
表1 溶剂中水的溶解性
溶剂
百分含量（%W/W）
温度（℃）
正己烷（Hexane）
0.0111
20
庚烷（Heptane）
0.0091
25
异辛烷（Isooctane）
0.0055
20
甲苯（Toluene）
0.0334
25
二氯甲烷（Dichloromethane）
0.1980
25
氯仿/三氯甲烷（Chloroform）
0.0720
23
四氯化碳（Carbon tetrachloride）
0.0100
24
邻二氯苯（o-Dichlorobenzene）
0.3090
25
乙酸乙酯（Ethyl acetate）
2.9400
25
乙酸丁酯（Butyl acetate）
1.8600
20
二乙醚（Diethyl ether）
1.4680
25
甲基叔丁基醚（Methyl-t-butyl ether）
1.5000

用半饱和流动相柱子能比无水流动相更快的平衡，但是仍然需要数小时。所以最好是一根柱子专用一种流动相，这样几分钟就可以平衡了。
显然流动相中极性改善剂也要好好控制。例如，如果用甲醇，那么只需要用很少的量（＜0.5%），并且稍微改变一点都会引起保留的很大变化。这种情况使用极性小点溶剂如异丙醇或乙醇会比较好，或者也可以不使用乙醇而采用低极性的醚类或酯类。这些都可以显著的影响分离的选择性。

问：我注意到你在正相色谱中更多的关注流动相的组分。能说说固定相吗？固定相之间有优劣之分吗？
答：确实是有分别的。纯硅胶和氧化铝是亲水性很强的，所以对流动相中的水分非常敏感。而接有极性键合相的，如CN-，二羟基-和氨基-等则不那么敏感。基于保留时间的重复性，开发方法的时候更多的是采用后者。这些键和相的有些特性必须了解。例如，在通常的正相条件下，氨基柱表面的初级氨基基团（α位？）很容易和醛基或酮基形成希弗碱/亚胺（Schiff-base/imine），所以氨基柱不能用来分析含有醛基或酮基的样品。
氰基柱在非极性溶液中非常耐用，但是一旦接触中性的溶剂如纯乙腈，THF或甲醇等就会发生柱床坍塌。这种情况可能在冲洗样品碎片堆积在柱子中产生的污染时遇到。按我们的经验，在冲洗的过程中最好保持恒定的高流速。低流速或用这些溶剂保存柱子更可能导致柱床坍塌。
氨基柱如果接触水溶液会有很大变化。填料空隙中高密度的氨基基团会相成一个强碱性环境，从而导致键合相水解。所以再用回正相流动相后，千万不要奇怪色谱柱性能的明显改变。
这些极性键和柱和纯硅胶柱，氧化铝柱一样都是非常通用的，所以不能说谁比谁好。
这些柱子都有特异的选择性，彼此都不同。纯硅胶柱对碱性物质有强保留，氨基柱对酸性物质有强保留，氰基柱和二羟基柱则适合中性物质。二羟基极性比氰基更强，所以通常保留更好。
同反相柱一样，不同品牌的同一键合相的柱子也有着明显的差异。除了硅胶不同，键和技术以及末端封尾技术都不一样。单官能基，双官能基或三官能基的硅烷都有采用的。如果采用了多官能团的硅烷，那么就要用不同的覆膜技术从而导致单层覆膜或多聚覆膜。氰基柱不一定是末端封尾的，氨基柱和二羟基柱通常没有末端封尾。所以和反相柱一样，品牌A和品牌B的分离表现是不一样的。

参考书籍：
1. Techniques of Chemistry,Vol.II,Organic Solvents,Physical Properties and Methods of Purification, Third Edition(1970), John A.Riddick and William B. Bunger,Wiley-Interscience
2. Merck Index,Eleventh Edition(1989), Merck&Co.,Inc.

8 系统体积，死体积，滞后体积（Dwell Volume）

问：我经常碰到一些名词如系统峰展宽，系统体积，死体积，滞后体积等等，能不能给我解释一下这些名词？
答：非常乐意。当我们说到这些名词的时候，我们要清楚的定义他们。我们将会看到，他们非常的不同而且能影响色谱分离的不同部分。
从死体积开始，也叫做柱外体积，这样叫可能清晰一点。他是色谱系统中进样点到检测点的体积，但是要除去色谱柱填料的体积。他包括进样体积，进样针体积（injection volume和the volume of injector的区别？），柱前和柱后连接管路的体积，柱头体积（包括滤片）和检测器的体积。精确点说，包括一半的进样体积和一半的检测器体积。
我们关注柱外体积是因为它会导致柱外峰展宽。峰展宽即峰在流过柱外体积的后变的更宽了。这可能会破坏柱子的分离。我们尽量减少柱外峰展宽。

问：我们怎么测量柱外体积和柱外峰展宽？
答：要完整的测量柱外体积和柱外峰展宽需要用到特殊的设备。这是因为它包含了柱头和滤片的体积，对用户来说这难以测量。我们只能信任柱子厂家做了充分的工作使柱外体积降到最小。我们容易测量的是色谱系统中的柱外体积。我们只要用一个0死体积的接头代替柱子，然后进小量样品记录图谱，就可以知道了。图1是一个例子。
在这张图中我们可以测定柱外体积和柱外峰展宽。柱外体积等于进样点到峰中线的距离，我们只要计算峰的起点就可以测定柱外体积了。但是我们的结果不是非常的精确，而且不能简单的把进样点到峰最高点的距离当作是系统的死时间。

图1

我们可以用峰的相对偏差来衡量系统峰展宽。峰的相对偏差可以通过峰尾（？second moment of the peak）时间计算出来。一个容易的方法是测量峰宽。由于峰是高度对称的，所以测量越靠近基线的峰宽结果越真实。例如4.4%峰高处的峰宽相当于5个相对偏差。

问：OK，我应该用什么样品和流动相来检测呢？
答：流动相用你平常分析的就可以，样品要用标准品。但是一般标准品浓度比较大，所以要稀释以获得小的柱外峰展宽。这样做你就能得到一个实际色谱条件下的柱外峰展宽。另外你也可以用一个通常的方法来标准化这个测量过程。这有个缺点就是你可能会错过一些你在实际分析过程中遇到的问题。我几年前碰到过一个例子，样品与进样器强烈的作用。尽管我们找遍了所有能导致峰展宽的原因，但是在标准化的测试中还是没有解决。后来用不同的样品和流动相才找到原因。

问：这些是关于柱外体积和柱外峰展宽的，那系统体积和滞后体积呢？
答：我不太喜欢“系统体积”这种说法，比较模糊。你可能会遇到系统死体积或系统滞后体积。我们要抛弃系统体积这种说法，代之以柱外体积和梯度滞后体积。后者也被叫做梯度延迟体积。它是指梯度混合点到柱头的体积（它也存在于等度色谱中，但在那里不重要）。
梯度滞后体积包括梯度混合器体积，接泵的管路体积，泵头（？pump head）和单向阀的体积，泵与进样器之间管路体积，进样器体积，进样器到柱子管路的体积。看，在这些组件中体积挺多的。
当你开始运行一个梯度时，需要花费一些时间把这些体积排掉再让梯度进入柱子。在这个时间内，色谱峰是在先前的流动相中做等度迁移。如果不同仪器之间的梯度滞后时间差别足够大，这个等度迁移将足以影响色谱图，特别是前部分。
另一个恼人的影响是你的实际分离可能会被明显推迟。如果系统有2mL的延迟体积，梯度流速为200uL/min，梯度将需要10min才能到达柱子。你的分析也因而推迟了10min。

问：我应该怎么测量滞后体积？
答：同样，卸掉柱子，接二通。用甲醇和10mg/L的对羟基苯甲酸丙酯甲醇溶液跑台阶梯度，接紫外检测器。你会得到一个S形的图。然后测量从梯度开始到台阶一半高的时间之差。把这个时间乘上流速就是梯度延迟或滞后体积。

问：有没有什么文献有这些定义的？
答：许多教科书都有一些章节定义这些色谱名词的。权威的是国际理论和应用化学联合会分析化学协会分析命名委员会。我确信在他们最新的正规命名出版在理论与应用化学中，Vol.65,No.4, pp.819-872,1993. 不幸的是不是所有的名词都有解释，比如滞后体积就没有收录，而有些定义还是比较模糊。

9 梯度方法转移

问：我开发的一个方法在我的系统上重复性非常好，但是在其他系统上就不一样了，怎么回事？
答：有时候换色谱系统时梯度方法会出现一些问题。除非系统完全一样，否则保留时间总有些变化。通常这个时间的变化都在分离度的范围之内，忽略它，方法还是可以用的。另外，如果适当了解潜在的原因，可以调节梯度在不同的色谱系统中得到相同的效果。
另一个涉及到这个问题的是梯度滞后体积。它是从梯度混合处到柱头的体积。当你进样开始分析后，梯度并没有到达柱头，还要等滞后体积排空后才到。这就是说样品在开始一段时间是等度迁移的。由于不同系统的滞后体积是不同的，所以保留时间就不一样了，有时候还是影响到分离度。
另一个原因是梯度本身，由系统与系统之间的组分差异导致。对于现在大部分的色谱厂家来说这个问题都不是很严重。但通常，在输送等比例的流动相（50%A和50%B）时