重点肠道传染病实.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,重点肠道传染病实验室检测方法 概述,襄阳市疾控中心 赵耀儒,2014/11/21,霍乱弧菌培养、分型操作方法。,伤寒、副伤寒培养操作方法。,细菌性痢疾（阿米巴痢疾）培养实验操作方法。、,手足口病实验操作方法。,细菌药敏试验,微生物标本的采集,通常有血液、脑脊液、尿液、伤口的脓液、胸水腹水、粪便、痰液及泌尿生殖系统的分泌物。,1,采集的一般原则：,a,早期采集,b,无菌采集,注意对局部及周围皮肤的消毒。,寄生部位采集的标本应明确目的菌，采用选择培养基。,C,不同菌不同采集方法,D,采集适量标本，量不应过少，注意采集不同时间不同部位标本，要全面。,E,安全采集,2,标本处理,2h,送到检验处，部分菌应保温于一定环境中保存。如尸检组织、支气管洗液、心包液、痰、尿等标本要保存于,4,环境中，脑脊液保存于,25,。注意安全尤其对烈性传染病。有时可以直接用抽取标本的注射器。,3,各部位标本的采集及注意事项,霍乱检验程序,标本的采集和送检,分离培养,鉴定,一、标本的采集和送检,1.,标本的采集：标本采集的好坏，对整个检验工作的质量影响很大。粪便标本的采集应争取在发病早期，服用抗菌药物之前并尽快送到检验室。,标本以病人粪便为主。采便方法可用棉拭采取自然排出的新鲜大便，亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内,3,5cm,处采取。采用后者应注意棉拭大小适宜，避免采便量过少。一般要求水样便采取,1,3ml,，成形便采取指甲大小的粪量。在某些情况下，病人的呕吐物、沾染粪便的衣物和尸体的肠内容物亦可作为检材。,2.,标本的送检：采得的标本应立即接种于培养基。剧烈腹泻病人的水样便含有大量病菌（,106,109/ml,），直接分离培养不难检出阳性。不能立即检查的，要接种于保存培养基内，尽快送往检验室。送检标本可放入,碱性蛋白胨水、文,腊二氏保存液或插入,Cary,Blair,二氏半固体保存培养基,中。后者不仅对霍乱弧菌，而且对其它肠道致病菌也有保存作用。标本与保存液的比例要适当，,8,10ml,保存液可加入,1,3ml,液体便或指甲大小的成形便，过多的大便量可降低保存液的,pH,值。,二、分离培养方法,1.,直接分离培养：急性期病人水样大便标本在增菌培养的同时，可取其粘液絮片或用棉拭标本直接作分离培养。这不仅能缩短检出时间，还可避免标本中其他杂菌特别是非,O1,群霍乱弧菌经增菌后大量繁殖而影响,O1,群霍乱弧菌的分离,分离培养基有选择性强、弱之不同。选择性强的培养基常用的,庆大霉素琼脂和,4,号琼脂,等；选择性弱的有,碱性琼脂和碱性胆盐琼脂,等。培养基的使用，可根据当地具体情况和各检验室的实践经验来选择。近年的趋势是使用碱性蛋白胨水增菌，再用强选择性培养基进行分离。琼脂平皿应新鲜配置，接种前培养基表面适当烘干。划线培养应掌握能分离出尽量多的单个菌落。一般每个标本接种一个平皿，必要时一个标本接种强和弱选择性培养基各一个。在庆大霉素琼脂平皿上，肠内细菌和革兰氏阳性菌的生长受到显著抑制。弧菌生长快、菌落大，培养,4,5,小时，原划线处有菌台生长，,8,10,小时可长出小菌落，,16,小时菌落直径可达,2mm,。菌落弱带灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑湿润，培养时间延长或室温放置后，菌落略带黄色，中心厚而周围透明，,培养基含亚碲酸钾时菌落呈灰色，中心形成黑色金属碲沉淀,。在碱性琼脂平皿上弧菌生长也较快，菌落较透明。在这些平皿上挑取菌落做玻片凝集容易形成悬液，凝集状态良好。,2.,增菌后分离培养：所有粪便标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗菌药物的病人标本含菌量少，单靠直接分离不易检出，须经增菌培养再作分离。碱胨水标本管放,37,增菌,6,8,小时后分离，夏天可将运送时间计算在内。标本如为保存液或半固体保存培养基，则取,1.0ml,或将棉拭转种至,8,10ml,碱胨水中，并将棉拭内容物在胨水管壁上挤出。,37,培养,6,8,小时后，平稳地从温箱中取出试管架，从霍乱弧菌生长最茂盛的菌膜下表层，取一接种环，划线接种于强选择性琼脂平皿。标本含菌量少时，为提高检出率，可实行,2,次增菌，取第一次碱胨水增菌,6,8,小时的培养物的表层液,0.1,0.2ml,，接种于,8,10ml,的碱胨水中，,37,培养,6,8,小时再做分离。,三、鉴定,鉴定标准以血清学性状为主，结合形态学和生化学性状作出判定。血清学性状以玻片凝集实验为主，可疑菌落先用,O1,群或,/,和,O139,群霍乱弧菌诊断血清作检查。,玻片凝集实验,：自分离培养基上挑取可疑菌落与,O1,群或,/,和,O139,群霍乱诊断血清做玻片凝集试验。因标本中可能存在,O1,群、,O139,群或非,O1,群,/,非,O139,群霍乱弧菌，为减少工作量及避免遗漏，推荐使用,O1,群和,O139,群霍乱两价诊断血清，检出阳性时再用单价血清进一步鉴定。玻片凝集用血清的效价，一般应为,1,：,40,1,：,50,（不低于,1,：,32,，不高于,1,：,64,）。即根据血清原效价作适当稀释，使其效价成为,1,：,40,1,：,50,，如原效价为,1,：,1280,，制成,1,：,50,效价的血清，即须稀释,1,：,25,（,12801/5025.6,）使用。将稀释血清滴加在洁净的玻片或平皿内，再以接种针或小接种环取可疑菌落放在血清液滴近旁，磨匀，然后混入血清内制成均匀悬液。很快（一般不超过,10,秒钟）出现肉眼可见的明显凝集者为阳性。凝集的菌落应以生理盐水作对照，检查有无自然凝集。将凝集的菌落接种普通琼脂斜面上，培养,6,8,小时后准备做进一步的鉴定，如菌落还有足够的 剩余，亦可用来做单价血清的玻片凝集，以确定血清型。,有的标本可能同时存在非,O1,群,/,非,O139,群霍乱弧菌，因此，可疑菌落较多时，应挑选,5,个以上的菌落逐个进行玻片凝集检查。必要时，取原划线菌苔边缘透明部分再做玻片凝集。这对一次流行的首批病人进行检查时尤应注意。此外，平皿分离未获分散的单个菌落，而在密集部位仍有可疑菌落时，应将该部分再做或经增菌后再做分离。,有时从恢复期病人分离出菌落典型但不凝集的弧菌，这时应以霍乱粗糙型血清作玻片凝集，检查是否为本菌的粗糙型。,伤寒杆菌检测程序,一、标本采集,用无菌方法采集新鲜标本，置于灭菌容器中，或直接接种于增菌培养基中，登记好标本号码填写送检单及时送检。运送途中严防污染及容器破损。如不能及时送检，可于,4,保存。为提高标本的阳性率，应根据病程的不同阶段采集不同的标本。,血：,血标本宜在伤寒发病早期和使用抗生素前采集。以无菌方法采血,5,毫升。第一周血培养阳性率可达,90%,。伤寒患者血液中有杀伤寒菌素，胆盐可以抑制这种杀菌素的作用，故可选用,葡萄胆盐肉汤增菌,培养基。如标本已凝固，可取出血清作肥达反应，将血块搅碎后做血培养。,粪便,：用棉拭采取患者新鲜粪便,1,一,2,克置于增菌液内，也可用缓冲,甘油盐水,或,Cary,Blair,运送培养基保存送检。最好在用抗菌药物治疗前,3,天后采样。,尿：,病程第,2,、,3,周起，可取尿培养。用无菌导尿法或取中段尿,50,毫升，离心取物增菌或直接分离。,骨髓,：培养阳性率高，特别对经过治疗的伤寒病人，可考虑作骨髓培养。,二、分离培养,1,、血标本,取病人静脉血,5,毫升加入约,10,倍量的葡萄糖胆盐肉汤中，,37,培养，逐日观察结果。如出现混浊即可用,血琼脂或,SS,、麦康凯琼脂,进行分离培养，,37,培养,18,一,24,小时，挑取疑菌落作进一步鉴定。,一般增菌,1,一,2,天阳性率高，如至第,7,天培养物仍清澈透明，经接种培养仍无菌生长，则可判为阴性。,2,、粪便标本,（,1,）直接分离培养将标本接种到,SS,和麦康凯琼脂,上，,37,培养,18,一,24,小时，挑取可疑菌落进行鉴定。,（,2,）增菌培养将标本乳化后接种在改良的,亚硒酸氢钠甘露醇,（,SFM,）增菌培养基中，,37,培养,15,一,18,小时后，再接种到,SS,和麦康凯琼脂,上，,37,培养,18,一,24,小时后，挑取可疑菌落。,3,、尿、胆汁、骨髓标本,取患者尿或胆汁经离心后的沉淀物或骨髓液，作直接分离或增菌分离培养，方法与粪便标本分离培养方法相同。,三、鉴定,1,、初步生化鉴定 挑取上述分离培养基上无色、透明或半透明的可疑菌落,2,一,3,个，分别接种双糖铁斜面（,KIA,）和动力靛基质尿素半固体（,MIU,）各一支，,37,培养,18,一,24,小时，观察生化反应。若符伤寒或副伤寒杆菌生化反时，则取,KIA,斜面上菌苔进行血清学鉴定。,2,、血清学分型（,1,）,0,血清群别判定初步生化反应符合伤寒或甲、乙、丙型副伤寒杆菌时，先用,A,F,群沙门氏,“,0,”,多价血清作玻片凝集，以判定其群别。（,2,）,H,抗原判定,0,抗原判定后，依次用相应的,H,因子血清检查第一相和第二相抗原与,Hd,因子血清凝集。（,3,）,Vi,抗原检查新分离的伤寒杆菌有,Vi,抗原，能与,Vi,血清凝集。,一、标本采集、运送、包装、保存、接收,可采用便盒留便、肛拭或采便管采便。便盒留便：留取粪便时应采集新鲜粪便的脓血部分、粘液部分、水样便或稀便。便量,1,5g,。集体腹泻或食源性暴发患者粪便采集的数额，应根据患者人数的多少，决定采取标本的数量。当怀疑患者为菌血症时，应以无菌操作，从静脉血管采取,10,15 mL,血液，放入加有,EDTA,抗凝剂瓶中送检。所采取的粪便标本应尽快送检，不得超过,2 h,送到化验室，否则标本应放入,Cary-Blair,运送培养基,中，运送时间超过,2h,者，应在冰浴条件下送检。送交分型分析菌株的接收要求：,1),经过分纯的没有污染的菌株,;2),分离菌株应该用甘油半固体保存；,3),与分离菌株相对应的患者的临床症状和流行病学资料；,4),经血清和生化证实为志贺菌。,痢疾检验程序,二、粪便标本志贺菌的分离方法,1,、分离方法（,1,）用接种环多点沾取标本病变部分，直接划线分离于,SS,、,EMB,（或,HE,、麦康凯）琼脂平板。,37,培养,24 h,。（,2,）血液培养 将采取的抗凝血液标本，放入葡萄糖肉汤，,37,培养，逐日观察结果。一般,1,3 d,内阳性较高。为提高阳性检出率，可以在标本中加入,0.5 mL OP,乳化剂（聚乙二醇辛基苯基醚），使血球溶解，以提高阳性检出率。（,3,）挑选可疑菌落 从,37,培养,16,24 h,的分离培养基上，观察挑选可疑菌落，其形态为无色，半透明，圆形，湿润、光滑、突起，大小为,1,2mm,；挑选可疑菌落，接种,TSI,和葡萄糖半固体或综合培养基，先划线后穿刺，做好标记，放,37,培养,16 h,以上，观察结果,2,、初步生化反应 志贺菌属在,TSI,上的生化反应为：斜面红色，底层产酸黄色，不产气。在葡萄糖半固体管内产酸为黄色，不产气，无动力。在综合培养基上为：斜面红色中立段产酸黄色，底层绿色，无动力，福氏志贺菌,6,型在上述三种培养基中，有时可产生少量气体。,3,、生化学鉴定（,1,）凡属志贺氏菌属的培养物，应符合表,Al,所列的生化特性。（,2,）志贺菌属分为四个生化群。血清学分型与生化反应不一致者，均为非志贺菌。（,3,）生化反应或血清学反应可疑的培养物，均应做革兰氏染色镜俭，并加做,V.P,、苯丙氨酸、西蒙氏柠檬酸盐、赖氨酸和葡萄糖,n,铵试验,与有关的细菌相鉴别。,肠出血性大肠杆菌,O157,：,H7,的检验程序,粪便或其它标本,增菌,6,小时左右,磁珠浓缩,山梨醇,麦康凯,培养基培养,18-24,小时,可疑菌落,革兰氏 生化 血清学 毒力因子,染色 反应 鉴定 鉴定*,根据结果判定,*有条件的单位可进行如用,PCR,检测,SLT1,、,SLT2,、,Hly,、,EAE,的基因,【,注,】,1,、培养及增菌均在,37,进行；,2,、山梨醇,-,麦康凯培养基中应加入适当的抑菌剂；,3,、“科玛嘉”培养基加入亚碲酸钾后选择效果更好；,4,、在,SMAC,中加入下列抑制剂的一种均可增加培养基的选择性；,1,）亚碲酸钾,2.5mg/l,和先锋霉素类抗生素,Cefixime 0.05mg/l,；,2,）新生霉素,10mg/l,；,3,）万古霉素,40mg/l,；,5,、在科玛嘉或,S-MAC,平板上挑选可疑菌落与,O157,诊断血清、,H7,血清或,O157,单克隆抗体作试探性凝集试验，若不凝集，但临床表现疑为,EHEC,感染，则应做如下处理。因为个别肠出血性大肠杆菌,O157,：,H7,具有,K,抗原，应在生化反应确定为大肠杆菌后用生理盐水制备菌悬液，并,100,水浴加热,10-15,分钟再与,O157,诊断血清或,O157,单克隆抗体做凝集试验。,6,、当生化反应和血清学反应结果均与肠出血性大肠杆菌,O157,：,H7,符合时，才能确认为肠出血性大肠杆菌,O157,：,H7,。,7,、目前许多国家使用的,O157,和,H7,特异性抗体与及少数细菌具有不同程度的交叉反应，如美国、法国还有我国自己生产的试剂都与弗劳地枸橼酸杆菌有交叉反应，因此，用生化试验确定为大肠杆菌是必须的,最为重要的是硫化氢试验。绝大多数肠出血性大肠杆菌菌株在,24,小时内不的发酵,D-,山梨醇。但是，也报道了一些能够快速发酵,D-,山梨醇的菌株。,8,、典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下：,1,）动力试验 葡萄糖 麦芽糖 甘露醇 蔗糖 硫化氢 尿素试验,+/,2,）靛基质 甲基红,V-P,试验 枸橼酸盐 苯丙氨酸脱氨酶,3,）赖氨酸脱羧酶 鸟氨酸脱羧酶 氧化酶 氰化钾,+/,+/,PCR,在感染性疾病病原体检测中的应用,病毒的检测,定量,定性,基因型及基因突变,细菌及其它微生物的检测,难培养菌,耐药基因,寄生虫的检测,手足口病的实验室检测方法,病毒分离,采集的样本经过相应处理后接种于相应细胞，进行肠道病毒的培养，通过观察细胞毒性变化来判断是否感染肠道病毒。,测定人双份血清标本的中和抗体滴度,用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较，抗体滴度,4,倍或,4,倍以上增高证明病毒感染。,核酸检测,主要是逆转录,-,聚合酶链反应（,RT-PCR,）,普通,PCR,和荧光定量,PCR,手足口病检测,待检标本类型及检测方法,编号,检测方法,标本类型,1,病毒分离,粪便、脑脊液、疱疹液和咽拭液,2,双份血清标本的中和抗体滴度,血清、脑脊液,3,核酸检测（,RT-PCR),血清、粪便、脑脊液、疱疹液和咽拭液,PCR,实验室布局,细菌药敏试验,纸片扩散法,稀释法,抗生素浓度梯度法,自动化仪器法,