细胞凋亡交流.doc

细胞凋亡（apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主死亡方式。1972年，英国教授Kerr首先提出凋亡的概念。近十余年来，细胞凋亡现象引起了广泛重视，有关的研究工作取得重要进展，并成为医学生物学各学科共同关注的极为活跃的研究领域。
细胞凋亡与组织器官的发育、肌体正常生理活动的维持、某些疾病的发生以及细胞恶变等过程均有密切的关系。

1． 形态学变化：
细胞凋亡的形态变化大致可分为三个阶段：
1） 胞体缩小，与周围细胞失去联系，细胞器变致密，核体积缩小，核仁消失，染色质浓集于核膜内表面下，形成新月形致密小斑块。
2） 染色体断裂，核膜与细胞膜均内陷，包裹胞内成分（胞浆、细胞器、碎裂的染色质及核膜）形成“泡”样结构，此为“凋亡小体”。最后，整个细胞均裂解成这种“小体”。
3） 凋亡小体被邻近的巨噬细胞、上皮细胞等识别、吞噬、消化。
上述三个阶段维持时间很短，通常在几分钟、十几分钟内即可完成。

2．细胞凋亡的生化改变：

1） 胞内Ca2+浓度增高
所有细胞凋亡过程中均出现胞内Ca2+浓度增高，这可能是Ca2+内流所致。

2） 内源性核酸内切酶激活
细胞发生凋亡时，由于内源性核酸内切酶被激活，DNA被从核小体连接处水解，形成180—200bp或其整倍数的片段。

3） 生物大分子的合成
凋亡过程的发生一般依赖于新的RNA和蛋白质的合成，如在激素、射线作用下，或由于去除生长因子等所引起的细胞凋亡中，情况均为如此。

常用的检测方法：

1．形态学方法
借助普通光学显微镜、荧光显微镜或透射电镜可对组织切片、切片涂片或细胞悬液进行形态学观察，凋亡细胞在组织中散在分布，表现为核致密浓染、核碎裂等。该方法简便、经济，可定性、定位。但在组织成分及细胞死亡类型复杂的情况下，难以判断结果，也无法定量。

2．电泳法
对凋亡细胞的基因组DNA进行琼脂凝胶电泳，由于存在180—200bp或其整倍数的片段，故电泳结果可见“梯状”（ladder）DNA条带。该法简便，可定性及定量，但无法显示组织细胞形态结构，也不能反映凋亡细胞与周围组织的关系。

3．免疫学方法
凋亡细胞内裂解的DNA片段含组蛋白，可用抗组蛋白抗体及抗DNA抗体的混合物与之反应，再经显色及比色判断结果。该法可定性、定量，但不能定位。

4．流式细胞术
增生状态的细胞处于不同的周期时相，其DNA 含量分布在2N—4N之间。凋亡的细胞由于发生DNA裂解，小分子量的DNA片段穿过细胞而丢失，大片段DNA可形成一个DNA含量小于2N的分布区，称“亚G1峰”。该法可对典型的凋亡进行定性和定量，可间接判断凋亡细胞所处的周期时相。

5．末端转移标记技术
DNA被切割后，其每个片段均含有3-OH末端，在末端转移酶或DNA多聚酶的作用下，加入已标记的核苷酸或核苷酸混合物，再经过酶显色或用荧光抗体，可使之显示出来。该法特异性强，可进行原位标记及定量检测。

细胞凋亡的诱导剂和抑制剂

多种因素可参与诱导和抑制细胞凋亡。常见的细胞凋亡诱导剂和抑制如下表1。

1.Ca2+、Mg2+ 内源性DNA内切酶为Ca2+/Mg2+依赖性，故胞内Ca2+/Mg2+浓度升高可诱导细胞凋亡。Ca2+不仅是细胞凋亡的诱导剂，在其他因素诱导凋亡的信号传导过程中，Ca2+也是重要的信号分子。Zn2+能拮抗Ca2+/Mg2+的作用。

2.糖皮质激素 糖皮质激素是常见的凋亡诱导剂。未成熟胸腺细胞对激素诱导的凋亡敏感，而成熟T细胞则不敏感。蛋白合成抑制剂（放线菌素D、放线菌素酮）可拮抗糖皮质激素诱导的凋亡与新蛋白质的合成有关。

3.细胞因子 TNF、TGF—β等可促进细胞凋亡，而IL—2 、IL—3、GM—CSF等则抑制凋亡。IFN—Υ、IL—10等对的发生有双重效应。例如IFN—Υ可使IFN—Υ受体的T细胞增生，而使高表达IFN—Υ受体的细胞发生凋亡。'

4.抗原刺激 抗原刺激可使B细胞表面IgM发生交联，导致蛋白酪氨酸磷酸化，激活蛋白激酶C（PKC），使内质网Ca2+释放，直至发生凋亡。

5.抗体 抗IgM、Fas、CD3/TCR、CD4、CD8、CD23等的抗体可诱导表达相应膜抗原的细胞发生凋亡。

6.胞内信号分子调节剂 某些胞内信号分子调节剂对不同靶细胞可分别具有诱导或抑制凋亡的作用。例如，PKC激活剂PMA可抑制鼠T、B细胞凋亡，但可诱导鼠胸腺细胞凋亡。

7.超抗原、丝裂原 超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素可诱导胸腺细胞内CD4+、CD8+细胞凋亡；丝裂原PWM可诱导成熟及未成熟T细胞凋亡。

细胞凋亡的几种检测方法
1、 形态学观察方法
（1）HE（苏木精 — 伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。
（2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
（3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
（4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
2、 DNA凝胶电泳
细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带
3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定
凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。
检测步骤
1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；
2、在微定量板上吸附组蛋白体’
3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘
4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’
4、加酶的底物，测光吸收制。
用途
该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。
3、 流式细胞仪定量分析（拟采用的方法）
细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。
应用价值
流式细胞仪检测具有以下特点：
1)、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确
2)、可以做许多相关性分析
3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期
（1）检测形态学及细胞膜完整性的Hoechst-PI双染色法
细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI)而呈强的红色荧光。
（2）DNA片断原位标记法 和DNA凝胶电泳法结合
凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3•的羟基（－OH）端结合，经显色反应后检测DNA裂解点的技术。
DNA片段原位标记法有二种：
1、原位缺口转移（in situ nick-translation,ISNT)技术，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3•－OH端
2、原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique,ISEL)，即TUNEL法，它是利用TdT将标记的DUPT接到3•-OH端。研究证明，TUNEL法的敏感性远高于ISNT，尤其对早期凋亡的检测，TUNEL更为合适。
（3）检测细胞膜成分变化的Annexin V-PI法
原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V，将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。
结果判断：正常活细胞Annexin V 、PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；坏死细胞Annexin V/PI均高染。
应用价值：细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此Annexin
V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又Annexin
V联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，Annexin
V联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。

方法及步骤
A. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：
(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。
(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。
(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。

B. 未标记抗体间接免疫荧光标记法：
（1）收集2×106个细胞，用冷的PBS 2ml 洗涤细胞一次，800rpm离心5min。
（2）用2ml 4%多聚甲醛室温固定细胞40min,800rpm离心5min；2ml PBS重悬细胞，800rpm离心5min；
（3）用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10min,800rpm离心5min。
（4）加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40min,800rpm离心5min，用2ml冷的PBS 重悬细胞，800rpm离心5min，洗去未结合一抗，重复一次。
（5）加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40min后，800rpm离心5min，去上清，PBS洗涤两次。
（6）加入0.5ml 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。
（7）流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。

C.细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品（PI染色）的制备：
（1）待测样本制成单细胞悬液，然后200g离心5分钟，弃上清。
（2）用4℃预冷的70%冷乙醇固定，4℃保存 ，至少固定18小时。
（3）调整细胞浓度为106细胞/毫升，取1毫升细胞悬液，用PBS洗三次，细胞重悬于1毫升PI染液中，37℃孵育30分钟即可进行流式分析。
（4）PI染液终浓度为50微克/毫升，RNase A终浓度为20微克/毫升。

培养细胞染色体显示法
（1） 传代培养细胞染色体显示法
培养细胞—加秋水仙素—采集分裂细胞—离心—低渗处理—预固定—固定—重复固定—制片—染色和封片
1．培养细胞：取处于指数生长期、用较大瓶皿培养的、80％～90％汇合单层培养细胞。
2．加秋水仙素：使用最终浓度为0.02～0.8微克/毫升营养液，温箱继续培养6～10小时； 或用低温封闭法：把培养细胞置于4℃条件下6～12小时后，再于37℃温箱继续培养6～10小时处理（加秋水仙素）。
3．采集分裂细胞：可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点，此时手持培养瓶，左右反复横向水平摇动，令培养液在培养细胞表面反复冲刷。应用此法可使90％的中期分裂细胞从瓶壁脱落，注意勿用力过猛，以防多量非分裂细胞脱落影响观察。
4．离心：收集培养液，1000转/分钟离心5～10分钟。
5．低渗处理：吸除上清液、加入预温至37℃的0.075M KCl溶液，在温箱中静置20～30分钟。
6．预固定：向悬液中加新鲜1：3醋酸、甲醇固定液1ml，用吸管吹打调匀，此措施能起到先使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成块。
7．固定：离心，同4，吸除上清液，加新鲜固定剂5～10ml；加固定剂时要用一手微斜持离心管，另手用吸管吸取固定剂，把固定剂逐滴滴在离心管壁上，使之慢慢流入离心管中，然后轻轻吹打均匀，置15～20分钟。
8．重复7，末次离心后，小心吸除大部分上清，据悬液中细胞密度大小，余下固定液0.5～ 1ml。
9．制片：用滴片法制片，按如下步骤：彻底洗净载物片，勿留任何油脂，置冰箱中储备备用。滴片前现从冰箱中取出冷载物片1片，在载物片表面出现细微水气时，立即向片的一侧滴2～3滴细胞悬液，滴片时的距离能保持半米高度才好。滴片后置室温中令其自然干燥，或用吹风机热风吹干亦可。如此制备好的标本可置盒中备用或立即进行染色观察。
10． 染色和封片：一般常用Giemsa染色：取干液Giemsa 1份加pH6.8磷酸缓冲液9份混合，染色10分钟后，水洗、晾干、可直接观察。如标本需要保存或做长时间观察，可过二甲苯两次后，用中性树胶封片后，再过二甲苯，然后封片亦可。
（2）人末梢血微量全血培养染色体显示法
1．培养液准备：取15ml培养瓶数个，每瓶内分别充入5ml培养液（pH 7.2），内含：1640培养液（含10％～15％小牛血清），PHA 0.1ml，青霉素100单位和链霉素100微克/毫升 培养液
2．抽血针管准备：取2～5ml针管一支，在消毒后的无菌操作台或无菌操作箱中安装好注射器，无菌抽肝素（100 U/ml BBS）少许湿润针管，如动作迅速不用肝素亦可。
3．采血：用棉签75％酒精给患者或献血者的皮肤消毒两次，缚止血带，静脉取血1～2ml。无菌操作迅速向每一瓶培养中加血0.4～0.5ml，如系外出采血，安装针管及分装血液两步骤亦可在无菌条件略差的环境内操作，但动作要迅速，以减少污染；在采血量不多或不应抽血的情况下，亦可在耳垂、手指肚（无名指）用刺血针采血。
4．培养和加秋水仙素：37℃温箱中培养到60～72小时之间，此时细胞分裂相最多，向每培养瓶内加秋水仙素，最终浓度0.02～0.08微克/毫升营养液，再培养4～6小时。
5．低渗：1000转/分钟离心10分钟，吸除上清液，加入预温过的0.075M KCl溶液10ml，置温箱中低渗处理15～20分钟。
6．其余步骤与处理传代细胞法相同。
（3）羊水细胞培养
1.抽取羊水：无菌抽取羊水10-20ml，立即注入无菌离心管
2.离心分离：1000转/分离心10分钟，弃去上清，留0.5ml.
3.培养：加培养液4ml（含小牛血清1ml），用NaHCO3调PH至6.8，置37度培养，在温箱培养7-10天，可见大量成纤维细胞或上皮样细胞生长；加秋水仙素0.02-0.8微克每毫升营养液，作用10-12小时。
4.其余步骤与传代细胞染色体制备方法相同。
一般染色体制片程序
1、 取对数生长期细胞一个T75或T25瓶。
2、 将培养基换成10ml DMEM(H)+10%FBS+0.1ug/ml秋水仙素的培养基，处理1~2小时。
3、 将细胞培养液倒掉，马上加入3~4ml 0.1%胰蛋白酶，并立即摇晃0.5~1min。当在显微镜下看到分裂相细胞脱壁后，马上加入终止液终止消化，并将分裂相细胞收集在一个15ml的离心管中，并在1200r/min离心4min。
4、 将上清液倒掉，剩余50ul左右的液在管中，并轻微震动，使细胞沉淀重新悬浮。
5、 加入10ml的低渗液（0.075M KCL），第一毫升要逐滴加入，并边加边摇晃。
6、 37℃水浴中低渗30min。
7、 再加入1ml冰冷的固定液（甲醇：乙酸=3：1 的混合液），并马上摇匀，离心，1000r/min、10min。
8、 同步骤4。
9、 加入10ml冰冷的固定液，第一毫升要逐滴加入，边加边摇晃。
10、 室温下固定30min，然后离心，1000r/min、10min。
11、 同步骤4。
12、 加入10ml冰冷的固定液，第一毫升要逐滴加入，边加边摇晃。
13、 室温下固定15min，然后离心，1000r/min、10min。
14、 重复步骤11~13一次。
15、 将离心后的上清液倒掉，并加入50~100ul的新鲜固定液重悬细胞。
16、 滴片（玻片要求是湿冷的干净的，滴片高度要大于30cm。玻片倾斜角度15~30度左右）
17、 镜检。

（六）细胞的冷冻保存与复苏（慢冻速溶）
• 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
• 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
• 在细胞冻存时加入保护剂，能大大提高冻存效果。
• 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
细胞冻存方法
（1）、冷冻前一日提前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
（2）、配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为 5-10％，混合 均匀，置于室温下待用。（预先配制冻存液： 含20%血清培养基，10% DMSO加基础培养基 ）
（3）、按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数；
(4)、将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜；
(5)、向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml；
(6)、按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；
(7)、再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。
冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 ℃ 40 分钟→ -20 ℃ 30 分钟→ -80 ℃16～18 小时(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 长期储存。
注意点：
（1） 细胞在-20度冰箱不能超过1h，以免冰晶过大破坏细胞，可跳过-20直接到-80，这样细胞活率低点。
（2） DMSO稀释时会放出大量热，不可直接加到细胞液中要提前配制。
（3） DMSO必须时细胞培养级别的，新买的本身是无菌的，第一次开瓶后立即少量分装于无菌瓶中，4度保存，避免反复冻容产生有毒物质。
细胞复苏（要点动作要快，轻）
（1）、调配37℃～40℃的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至37℃～40℃；
（2）、从液氮中取出冻存管，立即投入37℃～40℃ 温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解；
（3）、将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀；
（4）、将细胞悬液经800～1000r/min离心5min，弃上清夜；
（5）、向细胞沉淀内加入完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。
注意点：
（1）注意安全，以防冷冻管爆炸，带手套用镊子将冷冻管取出，不可用手。
（2）解冻时，液面不可超过冻存管面，以防污染。