爱媛类芽孢杆菌抗菌肽对扩展青霉孢子的抑制作用机制.pdf

基础研究 食品科学 2023,Vol.44,No.15 19收稿日期：2022-06-28基金项目：河北省自然科学基金资助项目（C2020208014）；河北省省级科技计划资助项目（22327107D）第一作者简介：王志新（1980）（ORCID:0000-0001-8576-7048），女，教授，博士，研究方向为生物工程。E-mail:*通信作者简介：贾英民（1961）（ORCID:0000-0002-1930-603X），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术与安全。E-mail:爱媛类芽孢杆菌抗菌肽对扩展青霉孢子的 抑制作用机制王志新1，刘丹丹1，贾紫伟1，黄玉清1，宁亚维1，贾英民2,*（1.河北科技大学食品与生物学院，河北 石家庄 050018；2.北京工商大学食品与健康学院，北京 100048）摘 要：扩展青霉（Penicillium expansum）会导致水果腐烂变质，危害消费者身体健康，是采后水果常见的腐败菌，研究爱媛类芽孢杆菌（Paenibacillus ehimensis）抗菌肽对扩展青霉孢子的抑制作用机制具有重要意义。本实验采用微量二倍稀释法和时间-杀菌曲线测定抗菌肽对扩展青霉孢子的抑菌活性，采用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察抗菌肽对扩展青霉孢子超微结构的影响，采用荧光探针分析抗菌肽对扩展青霉细胞膜和活性氧累积的影响，以探究爱媛类芽孢杆菌抗菌肽对扩展青霉孢子的抑制作用机制。结果显示，抗菌肽对扩展青霉孢子的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）为3.5 AU/mL。经0.5、1 MIC和2 MIC抗菌肽处理的扩展青霉孢子萌发率降低显著（P0.05），与空白对照组相比，分别降低了28.30%、84.57%和100%。抗菌肽作用后，导致扩展青霉孢子凹陷严重、内容物泄漏、形态和结构发生改变，且抗菌肽使扩展青霉的细胞壁受到损伤，导致碱性磷酸酶外泄。抗菌肽作用扩展青霉后，消散了细胞膜电势，且消散程度呈浓度依赖性；增加了细胞膜渗透性，导致K外泄；增加了细胞膜的流动性，使DPH荧光强度显著降低（P0.05）；破坏了细胞膜完整性，使SYTOX-Green荧光强度和PI沾染率升高。同时，经1、2 MIC抗菌肽处理的扩展青霉孢子DCFH-DA荧光强度显著增大（P0.05），细胞内出现活性氧累积，影响了扩展青霉孢子正常的生理代谢。综上，抗菌肽对扩展青霉孢子抑制作用的靶位点主要为细胞膜和活性氧代谢。关键词：爱媛类芽孢杆菌；抗菌肽；扩展青霉；孢子；抑菌机制Antimicrobial Mechanism of Antimicrobial Peptide from Paenibacillus ehimensis against Penicillium expansum SporesWANG Zhixin1,LIU Dandan1,JIA Ziwei1,HUANG Yuqing1,NING Yawei1,JIA Yingmin2,*(1.College of Food Science and Biology,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China;2.School of Food and Health,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China）Abstract:Penicillium expansum,a common spoilage organism in postharvest fruits,can cause fruit decay and deterioration and endanger human health.It is of great significance to investigate the antimicrobial mechanism of the antimicrobial peptide from Paenibacillus ehimensis on P.expansum spores.The antimicrobial activity of the antimicrobial peptide against P.expansum spores was determined by using the two-fold dilution method as well as measuring the time-killing curve.Scanning electron microscopy(SEM)and transmission electron microscopy(TEM)were used to evaluate the effect of the antimicrobial peptide on the ultrastructure of P.expansum spores.The effects of the antimicrobial peptide on the cell membrane and reactive oxygen species(ROS)accumulation of P.expansum were analyzed by fluorescence probes.The results showed that the minimum inhibitory concentration(MIC)of the antimicrobial peptide against P.expansum spores was 3.5 AU/mL.The spore germination rate was significantly decreased by 28.30%,84.57%and 100%by the antimicrobial peptide at concentrations of 0.5 MIC,1 MIC and 2 MIC compared with the blank control(P 0.05).After treatment with the antimicrobial peptide,the spores appeared seriously sunken,the intracellular contents were leaked out,and the morphology and structure were changed.The antimicrobial peptide damaged the cell wall of P.expansum,resulting in the leakage of alkaline phosphatase.The antimicrobial peptide depolarized the cell membrane potential in a dose-dependent manner,and increased the cell membrane permeability,leading to K+leakage.The fluidity of the cell membrane was increased,which 20 2023,Vol.44,No.15 食品科学 基础研究in turn resulted in a significant decrease in DPH fluorescence intensity(P 0.05).The integrity of the cell membrane was damaged by the antimicrobial peptide,so the fluorescence intensity of SYTOX-Green and the contamination rate of PI were increased.Moreover,the antimicrobial peptide at 1 MIC and 2 MIC increased the fluorescence intensity of DCFH-DA significantly(P 0.05)and resulted in ROS accumulation,which affected the physiology and metabolism of P.expansum spores.This study indicated that the target sites of the antimicrobial peptide against P.expansum spores were mainly the cell membrane and ROS metabolism.Keywords:Paenibacillus ehimensis;antimicrobial peptide;Penicillium expansum;spore;antimicrobial mechanismDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220628-316中图分类号：TS255.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）15-0019-09引文格式：王志新,刘丹丹,贾紫伟,等.爱媛类芽孢杆菌抗菌肽对扩展青霉孢子的抑制作用机制J.食品科学,2023,44(15):19-27.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220628-316.http:/WANG Zhixin,LIU Dandan,JIA Ziwei,et al.Antimicrobial mechanism of antimicrobial peptide from Paenibacillus ehimensis against Penicillium expansum sporesJ.Food Science,2023,44(15):19-27.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220628-316.http:/苹果、梨、桃等日常食用的水果营养丰富，但是水果在采收、包装、运输和贮藏过程中容易出现机械 损伤1，加速病原真菌侵染果实2，导致水果腐烂变质，采后阶段新鲜水果腐烂造成的巨大经济损失已成为全球性问题3-5。其中，由扩展青霉引发的青霉病不但能导致果实腐烂，还会产生展青霉素、棒曲霉素、桔青霉素等致病毒素从而危害人类健康6-8。因此，防止水果被青霉菌侵染已成为果蔬贮藏中亟需解决的问题。目前，对水果采后青霉菌侵染的防治方法主要包括化学防治（噻菌灵、嘧霉胺和咯菌腈等）、物理防治（低温贮藏、热处理、微波处理和臭氧法等）和生物防治（拮抗微生物）。化学防治和物理防治会影响水果风味，并会使病原菌产生耐药性，同时还存在费用高、耗能大、不环保、不安全等问题。因此，亟需寻找安全、有效的防治措施来控制水果采后青霉菌的侵染。生物防治作为一种现代新兴技术，受到社会各界的广泛欢迎。抗菌肽是广泛存在于自然界中具有抗菌活性的小分子生物活性肽，一般由1060 个氨基酸残基组成，对细菌、真菌、癌细胞等具有较好的杀伤作用，其广谱性、无耐药性、高效性等优势使其成为炙手可热的潜在替代抗生素的抑菌物质9-11。基于此，许多学者开展了对抗菌肽抑菌机理的深入研究，这些研究推动了抗菌肽在食品、医药、农业、畜牧业等领域的发展12。类芽孢杆菌是一种能产生抗性芽孢的好氧或兼性厌氧的杆状细菌，可以用于植物和动物疾病的生物防治13。类芽孢杆菌广泛分布于自然环境中，可以产生如多肽、环状脂肽、细菌素和挥发物等多种抑菌化合物以及细胞壁降解酶14-15。现已报道了多种具有抗性的类芽孢杆菌，如多粘类芽孢杆菌、爱媛类芽孢杆菌等，其中以多粘类芽孢杆菌居多。研究发现，类芽孢杆菌产生的抗菌肽对原生动物、酵母、真菌、病毒、癌细胞等具有杀伤作用16，且天然抗菌肽具有稳定、无毒、耐药、高效等优点，已成为具有研究潜力的抑菌剂17。爱媛类芽孢杆菌（Paenibacillus ehimensis）是一种具有拮抗作用的抗性菌株，其具有广谱抑菌性，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和病原真菌具有较好的抑制作用。Hong等18研究发现P.ehimensis RS820对引起番茄根部病害的植物病原线虫具有显著的生长抑制作用。Naing等19从土壤中分离得到一株P.ehimensis KWN38，其产生的挥发性抑菌物质以及几丁质酶、纤维素酶、葡聚糖酶、蛋白酶能够较好地抑制立枯丝核菌AG-1、尖孢镰刀菌等植物病原真菌。Seo等20研究发现P.ehimensis MA2012分泌的几丁质酶对赤霉病菌孢子萌发具有较好的抑制作用。相比研究较多的粘类芽孢杆菌抗菌肽，对爱媛类芽孢杆菌抗菌肽的研究较少。Huang Zhaohui等21从P.ehimensis B7中分离出两种阳离子脂肽抗菌肽PE1和PE2，其分子质量分别为1 114 Da和1 100 Da，对病原细菌具有较好的抑制作用，如对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等致病菌均具有抑菌活性。Aktuganov等22从P.ehimensis IB-X-b代谢产物中分离纯化出具有抗真菌活性的杆菌霉素L和fengycin、plipastatin、agrastatin家族的环状脂肽。但目前鲜有关于爱媛类芽孢杆菌抗菌肽对扩展青霉抑制的研究报道。本课题组前期从爱媛类芽孢杆菌HD中分离纯化出具有广谱抑菌性的抗菌肽，其对真菌抑制效果较好，且抑制作用高效、稳定23。爱媛类芽孢杆菌经过发酵后收集其发酵上清液，采用大孔树脂吸附-解吸附法获得抗菌肽的粗提液，进一步利用半制备高效液相色谱法进行抗菌肽的纯化，获得纯度不低于98%的抗菌肽，命名为爱媛类芽孢杆菌抗菌肽ehimensin。本研究以采后水果 基础研究 食品科学 2023,Vol.44,No.15 21常见的腐败菌扩展青霉作为指示菌，考察爱媛类芽孢杆菌抗菌肽对其抑菌活性，之后分别从孢子萌发、形态结构、细胞壁、细胞膜、活性氧累积等方面探讨抗菌肽对扩展青霉孢子的抑制机理，以期为水果采后防腐提供理论依据，并为新型天然果蔬保鲜剂的开发提供参考。1 材料与方法1.1 材料与试剂扩展青霉（Penicillium expansum）CICC 40658由河北科技大学酶工程实验室保存。爱媛类芽孢杆菌抗菌肽ehimensin由本课题组制备，抗菌肽呈粉末状，1 mg/mL抗菌肽溶液效价为22.5 AU/mL。PDA、PDB培养基 北京奥博星生物技术有限公司；钾结合性苯并呋喃间苯二甲酸（potassium-binding benzofuran isophthalate，PBFI）、3,3-二丙基硫杂羰花青碘化物（3,3-dipropylthiadicarbocyanine iodide，DiSC3(5)）、2,7-二氯荧光素二乙酸酯（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene，DPH）美国Sigma 公司；SYTOX-Green、碘化丙啶（propidium iodide，PI）美国Thermo Fisher公司。1.2 仪器与设备ZSD-A1160恒温培养箱 上海智诚分析仪器制造 公司；CX31显微镜 日本奥林巴斯株式会社；S-4800-I扫描电子显微镜、H-7650透射电子显微镜、F-7000荧光分光光度计 日本日立公司；Accuri C6 Plus流式细胞仪 美国Becton Dickinson公司；Spectramax Plus 384酶标仪 美谷分子仪器有限公司；3-18K高速冷冻离心机 德国Sigma公司。1.3 方法1.3.1 扩展青霉孢子悬液的制备挑取12 环保藏的扩展青霉孢子，接种至PDA平板上，（251）培养7 d左右，轻轻刮取孢子，生理盐水洗脱，无菌脱脂棉过滤，血球计数板计数，生理盐水稀释备用。1.3.2 抗菌肽对扩展青霉最小抑菌浓度的测定 参照Park等24的方法，采用微量二倍稀释法测定抗菌肽的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。使用PDB培养基在96 孔板中对抗菌肽进行二倍梯度稀释，使其形成不同质量浓度的抗菌肽，再加入等体积扩展青霉孢子悬液（终浓度1104 CFU/mL），并设置真菌生长孔和空白对照孔。置于25 下培养2448 h，以孔底无可见孢子生长的最低抗菌肽活力为MIC。实验重复3 次。1.3.3 抗菌肽对扩展青霉孢子的时间-杀菌曲线测定分别向PDB培养基中添加抗菌肽，使其终质量浓度分别为0.5、1、2 MIC，以不加抗菌肽的培养基作为空白对照，标记为0 MIC，接种扩展青霉孢子悬液使其终浓度为1104 CFU/mL。25、150 r/min摇床培养，分别于0、1、2、3、4、6、8、10、12 h取样，稀释涂布，计算活菌数。以时间为横坐标、菌落总数（lg（CFU/mL）为纵坐标绘制时间-杀菌曲线。1.3.4 扩展青霉孢子萌发率的测定参照韩玉竹等25的方法，取扩展青霉孢子悬液，离心、收集菌体，并用PDB培养基重悬至1107 CFU/mL，等体积添加至用PDB培养基稀释的抗菌肽溶液中，使抗菌肽终质量浓度分别为0、0.5、1、2 MIC，混匀，将每个实验组添加至单个凹形滑槽中，置于有湿棉绒的培养皿中，25 下培养。10 h后用光学显微镜观察，对不少于3 个视野和不少于200 个萌发和未萌发孢子进行计数，按照下式计算孢子萌发率。?100?/%?1.3.5 扩展青霉孢子超微结构观察取扩展青霉孢子悬液，收集菌体，用0.1 mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤，重悬至孢子浓度为1107 CFU/mL，等体积加入PBS稀释的抗菌肽使其终质量浓度分别为0、0.5、1、2 MIC，作用12 h后用PBS洗涤3 次，制备扫描电子显微镜（5.0 kV、1 000）和透射电子显微镜（80 kV、4 000）样品，进行超微结构观察。1.3.6 扩展青霉孢子细胞壁完整性的测定参照王辉等26的方法，取扩展青霉孢子悬液离心收集菌体，并用PDB培养基重悬至1107 CFU/mL，添加抗菌肽使其终质量浓度分别为0、0.5、1、2 MIC，25、150 r/min振荡培养，于0、2、4、8、10、24、36、48 h取样，1 500 r/min离心10 min，取上清液，按照碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）试剂盒测其AKP活力。1.3.7 扩展青霉孢子细胞膜跨膜电势的测定参照Wang Zichao等27的方法，取孢子悬液，离心弃上清液，用含有10 mmol/L葡萄糖的Hepes缓冲液（5 mmol/L、pH 7.2）清洗并重悬。加入荧光探针DiSC3(5)（终浓度为2 mol/L），30 避光孵育15 min，离心弃上清液，用Hepes缓冲液清洗并重悬，加入KCl溶液（终浓度100 mmol/L）。1107 CFU/mL孢子悬液与等体积抗菌肽溶液混匀使其质量浓度分别为0、0.5、1、2 MIC，使用荧光分光光度计进行时间扫描（ex650 nm、em672 nm），扫描时间为180 s。1.3.8 扩展青霉孢子细胞膜渗透性的测定取扩展青霉孢子悬液收集菌体，用Hepes缓冲液22 2023,Vol.44,No.15 食品科学 基础研究（5 mmol/L、pH 7.2）清洗并重悬，调整孢子悬液浓度为1107 CFU/mL，加入PBFI探针。孢子悬液与不同终质量浓度（0、0.5、1、2 MIC）的抗菌肽溶液等体积混合作用30 min。在ex346 nm和em505 nm条件下，使用荧光分光光度计测定荧光强度。1.3.9 扩展青霉孢子细胞膜流动性的测定取扩展青霉孢子悬液收集菌体，用生理盐水清洗并重悬，制备浓度为1107 CFU/mL的扩展青霉孢子悬液，分别等体积加入含有不同质量浓度抗菌肽的0.5%葡萄糖溶液，使抗菌肽的终质量浓度分别为0、0.5、1、2 MIC，25、150 r/min作用12 h。作用完成后4 条件下离心并收集菌体，体积分数0.37%的甲醛溶液固定30 min后用50 mmol/L PBS（pH 7.0）洗涤两次。菌体在40 冰箱中冷冻5 min，加入0.6 mmol/L DPH溶液解冻并重悬，28 孵育45 min，用PBS（50 mmol/L、pH 7.0）洗涤重悬，使用荧光分光光度计测定荧光强度（ex350 nm、em425 nm）。1.3.10 扩展青霉孢子细胞膜完整性的测定扩展青霉孢子悬液与抗菌肽作用处理同1.3.9节，之后6 000 r/min离心10 min，用生理盐水洗涤，重悬。分别加入SYTOX-Green荧光染液和PI荧光染液，避光孵育30 min，再用生理盐水洗涤重悬。前者使用荧光分光光度计测定荧光强度并用荧光显微镜观察，后者使用流式细胞仪进行定量分析。1.3.11 扩展青霉孢子活性氧的测定扩展青霉孢子悬液与抗菌肽作用处理同1.3.9节，之后加入荧光染料DCFH-DA，30 黑暗孵育20 min，PBS 洗涤重悬，在ex485 nm、em530 nm条件下用荧光分光光度计测定荧光强度。1.4 数据处理与分析所有实验均进行3 次平行，结果以平均值标准差表示。数据用SPSS 17.0软件通过单因素方差分析法进行统计分析，利用Origin 8.0、Excel软件绘图。2 结果与分析2.1 抗菌肽对扩展青霉孢子的抑菌活性采用微量二倍稀释法测定抗菌肽对扩展青霉孢子的抑制作用。其MIC为3.5 AU/mL。通过时间-杀菌曲线进一步探究抗菌肽对扩展青霉的抑菌活性。由图1可知，空白对照组（0 MIC）的孢子生长正常，菌体量稳定在初始浓度；处理组随着抗菌肽质量浓度的增加，扩展青霉孢子数量减少。2 MIC处理组在作用1 h后对孢子开始表现出抑制作用，作用12 h后可以完全抑制孢子的生长，将孢子全部杀灭。024681012012340 MIC0.5 MIC1 MIC2 MIC?lg?CFU/mL?/h图 1 抗菌肽对扩展青霉孢子的时间-杀菌曲线Fig.1 Time-killing curves of the antimicrobial peptide on P.expansum spores2.2 抗菌肽对扩展青霉孢子萌发的影响如图2、3所示，空白对照组（0 MIC）孢子的萌发率为100%，孢子全部萌发，且长出了较长的芽管。0.5 MIC抗菌肽对孢子产生了一定程度的抑制，萌发率为71.7%，与空白对照组相比降低28.3%（P0.05），且芽管长度变短。当抗菌肽质量浓度为1 MIC时，孢子萌发率发生了较大的变化，下降到15.43%，与空白对照组相比降低84.57%，且芽管生长长度较短；2 MIC处理组孢子萌发 率为0%。0 MIC0.5 MIC1 MIC2 MIC012020406080100acdb?/%?小写字母不同表示差异显著（P0.05）。图810、13同。图 2 抗菌肽处理后扩展青霉的孢子萌发率Fig.2 Spore germination rate of P.expansum treated with the antimicrobial peptideABCDA.0 MIC；B.0.5 MIC；C.1 MIC；D.2 MIC。图4、12同。图 3 抗菌肽处理后扩展青霉孢子的生长状态Fig.3 Growth state of P.expansum spores treated with the antimicrobial peptide基础研究 食品科学 2023,Vol.44,No.15 23Zhu Congyi等28的研究表明，质量浓度为0、400 g/mL 和600 g/mL的单宁酸对指状青霉孢子作用12 h后孢子萌发率分别为90%、61.4%、12.4%。单从孢子萌发率看，本研究中抗菌肽对扩展青霉孢子萌发率的影响趋势与Zhu Congyi等28的研究结果一致，但Zhu Congyi等28发现被抑制萌发的指状青霉孢子会出现肿胀，而本研究发现被抑制萌发的扩展青霉孢子会发生皱缩。孢子萌发过程中会先吸水膨胀然后长出芽管，本研究中抗菌肽对孢子萌发的抑制效果较强，2 MIC处理组能够完全抑制孢子萌发，因此孢子未出现肿胀现象；同时结合后续扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察结果可知，抗菌肽会使孢子出现凹陷、内容物泄漏等现象。这些原因均导致本研究的结果不同于Zhu Congyi等28的研究。2.3 抗菌肽对扩展青霉孢子超微结构的影响扫描电子显微镜观察结果如图4所示。空白对照组（0 MIC）孢子表面较为饱满、完整，且轮廓清晰，呈椭圆形。随着抗菌肽质量浓度的增加，孢子凹陷程度逐渐加剧，高质量浓度处理组甚至出现破裂现象，内容物的泄漏量也在逐渐增多。此结果与其他研究者观察到的抑菌现象相似，如鞠健29发现丁香酚和柠檬醛可以使娄地青霉和黑曲霉孢子表面发生褶皱、破裂、干瘪。5 m5 kV 9.1 mm 10k5 m5 kV 12.1 mm 10kAB5 m5 kV 12.1 mm 10k5 m5 kV 12.3 mm 10kCD图 4 扫描电子显微镜观察抗菌肽对扩展青霉孢子形态结构的影响Fig.4 Effect of the antimicrobial peptide on the morphological structure of P.expansum spores examined by SEM透射电子显微镜观察结果如图5所示。空白对照组（0 MIC）孢子的细胞壁和细胞膜较完整且表面轮廓清晰，细胞质分布均匀。与空白对照组相比，1 MIC抗菌肽处理后的孢子表面形态发生了变化，细胞质稀薄且内容物出现泄漏。2 MIC抗菌肽处理的扩展青霉孢子细胞变形严重，质壁分离现象明显，细胞质密度严重降低。da Rocha Neto等30研究发现水杨酸作用扩展青霉孢子后其质膜产生内陷，细胞质紊乱，与本研究结果相似。综上，对孢子超微结构的观察结果表明抗菌肽会使扩展青霉孢子发生形态和结构变化。500 m80 kV 40k500 m80 kV 40k500 m80 kV 40kABCA.0 MIC；B.1 MIC；C.2 MIC。图 5 透射电子显微镜观察抗菌肽对扩展青霉孢子形态结构的影响Fig.5 Effect of the antimicrobial peptide on the morphological structure of P.expansum spores examined by TEM2.4 抗菌肽对扩展青霉孢子细胞壁完整性的影响 AKP位于细胞壁和细胞膜之间，当菌体细胞壁完整性被破坏，AKP会从菌体中释放到体外，故可通过测定AKP的活力来判断抗菌肽对细胞壁通透性的影响。由图6可知，与空白对照组（0 MIC）比较，处理组的AKP活力高于空白对照组，可见，抗菌肽对扩展青霉孢子细胞壁具有一定的破坏作用。王辉等26发现柠檬苦素作用黑曲霉后，处理组AKP含量高于空白对照组，表明柠檬苦素破坏了细胞壁的完整性。0 MIC0.5 MIC1 MIC2 MICAKP?/?/100 mL?/h010203040500.30.40.50.60.70.80.91.0?图 6 抗菌肽对扩展青霉孢子AKP活力的影响Fig.6 Effect of the antimicrobial peptide on alkaline phosphatase activity of P.expansum spores2.5 抗菌肽对扩展青霉孢子细胞膜跨膜电势的影响DiSC3(5)是一种亲脂性荧光探针，进入细胞内质膜中会发生荧光猝灭，结构完好的细胞中存在一定的跨膜电势，当细胞膜的通透性发生变化或离子通道受到影响时，膜电势会消失，荧光染料会从细胞膜中释放出来，导致荧光信号增强。如图7所示，随着抗菌肽质量浓度的增加，荧光强度逐渐增加。处理180 s时，空白对照组（0 MIC）荧光强度为70.91，0.5、1、2 MIC处理组抗菌肽的荧光强度分别增加至119.4、138.2、163.3。由此说明该抗菌肽会造成扩展青霉孢子细胞膜跨膜电势降低，引起细胞膜去极化。0 MIC0.5 MIC1 MIC2 MIC?/s020406080100 120 140 160 180406080100120140160180DiSC3(5)?图 7 抗菌肽对扩展青霉孢子细胞膜跨膜电势的影响Fig.7 Effect of the antimicrobial peptide on the transmembrane potential of P.expansum spores24 2023,Vol.44,No.15 食品科学 基础研究2.6 抗菌肽对扩展青霉孢子细胞膜渗透性的影响K对于平衡质膜上的电荷至关重要，有助于维持细胞内pH值和膜电位。当扩展青霉细胞发生膜去极化时，K的连续流失会导致细胞死亡31。通过不具备膜渗透性的PBFI探针考察不同质量浓度抗菌肽对扩展青霉钾离子泄漏的影响，结果如图8所示。抗菌肽与扩展青霉孢子作用30 min后，处理组荧光强度显著增加（P0.05），K泄漏量与抗菌肽的质量浓度呈正相关。由此推测，抗菌肽能够使扩展青霉孢子细胞膜的渗透性发生改变，导致 K泄漏，膜功能受到破坏，加速细胞死亡。0 MIC0.5 MIC1 MIC2 MIC0700100200300400500600acdbPBFI?图 8 抗菌肽对扩展青霉孢子细胞膜K泄漏的影响Fig.8 Effect of the antimicrobial peptide on K+leakage from P.expansum spores2.7 抗菌肽对扩展青霉孢子细胞膜流动性的影响DPH是一种用于研究膜脂流动性的荧光探针，可以与扩展青霉孢子的疏水区结合，而不会干扰脂质双层结构，DPH的荧光强度可以用来衡量细胞膜磷脂双分子层损伤的程度。如图9所示，经过0、0.5、1、2 MIC抗菌肽处理后，DPH的荧光强度分别为1 547.67、1 110.00、612.07和388.80；随着抗菌肽质量浓度的增加，DPH荧光强度显著降低（P0.05），说明抗菌肽破坏了扩展青霉孢子细胞膜的流动性。Lee等32的研究表明，合成的杂合肽作用于白色念珠菌后，DPH的荧光强度显著降低，说明杂合肽影响了白色念珠菌细胞膜的结构功能。0 MIC0.5 MIC1 MIC2 MIC01 8002004006008001 0001 2001 4001 600acdbDPH?图 9 抗菌肽对扩展青霉孢子细胞膜流动性的影响Fig.9 Effect of the antimicrobial peptide on the cell membrane fluidity of P.expansum spores2.8 抗菌肽对扩展青霉孢子细胞膜完整性的影响SYTOX-Green荧光染料不具有膜渗透性，只有在膜完整性受损或者形成孔洞时，其可以与细胞核结合，在一定条件下发出绿色荧光。结合图10和图11可见，抗菌肽作用后的孢子荧光强度显著增加，说明该抗菌肽会使扩展青霉孢子细胞膜的完整性受损。空白对照组（0 MIC）荧光强度在130左右，在荧光显微镜下看不到绿色。0.5、1、2 MIC处理组孢子荧光强度分别为373、437和527。随着抗菌肽质量浓度的增加，呈绿色荧光的孢子比例增加，荧光强度逐渐增大，说明孢子的膜受损率增加。Han Yuzhu等33研究发现P852肽作用尖孢镰刀菌时，随着P852剂量增加，细胞内SYTOX-Green的绿色荧光信号强度也相应增加。0 MIC0.5 MIC1 MIC2 MIC0600100200300400500acdbSYTOX-Green?图 10 荧光分光光度计分析抗菌肽对扩展青霉孢子细胞膜完整性的影响Fig.10 Effect of the antimicrobial peptide on the integrity of spore cell membrane of P.expansum analyzed by fluorescence spectrophotometry0 MIC0.5 MIC1 MIC2 MIC50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m?图 11 荧光显微镜观察抗菌肽对扩展青霉孢子细胞膜完整性的影响Fig.11 Effect of the antimicrobial peptide on the integrity of spore cell membrane of P.expansum analyzed by fluorescence microscopy如图12所示，空白对照组（0 MIC）的PI沾染率为3.3%，0.5、1、2 MIC处理组PI沾染率分别为7.7%，26.7%和73.3%。随着抗菌肽质量浓度的增加，PI的沾染基础研究 食品科学 2023,Vol.44,No.15 25率增加，说明抗菌肽对扩展青霉孢子细胞膜具有破坏作用，且与抗菌肽质量浓度呈正相关性。该结果与SYTOX-Green荧光染色结果趋势一致，进一步验证了抗菌肽会破坏扩展青霉孢子的细胞完整性。0100101102103104105106107.21 000V1-L96.7%V1-R3.3%1 500A500?PI-A01001011021031041051061 000V1-L92.3%V1-R7.7%1 500B500107.2?PI-A0100101102103104105106V1-L73.3%V1-R26.7%800C200400600107.2?PI-A0100101102103104105106V1-L26.7%V1-R73.3%800D200400600107.2?PI-A图 12 流式细胞术分析抗菌肽对扩展青霉孢子细胞膜的影响Fig.12 Flow cytometry analysis of the effect of the antimicrobial peptide on the cell membrane of P.expansum spores2.9 抗菌肽对扩展青霉孢子胞内活性氧的作用如图13所示，随着抗菌肽质量浓度的升高，DCFH-DA 荧光强度逐渐增大。空白对照组（0 MIC）与0.5 MIC抗菌肽处理组DCFH-DA荧光强度差异不显著，但与1 MIC和2 MIC处理组之间有显著性差异（P0.05）。说明抗菌肽影响了扩展青霉孢子中活性氧的积累，从而抑制了扩展青霉孢子正常的生长繁殖。0 MIC0.5 MIC1 MIC2 MIC01 000200400600800abcaDCFH-DA?图 13 抗菌肽对扩展青霉孢子胞内活性氧的影响Fig.13 Effect of the antimicrobial peptide on intracellular ROS accumulation in P.expansum spores3 讨 论新鲜水果在每年采后阶段的腐烂是全球性的问题，真菌是导致水果腐烂最大的微生物群体。大量化学试剂的 使用让许多腐败真菌产生了耐药性。因此，自然界中无毒害且高效的新型生物抗真菌剂成为了热点研究方向，其中抗菌肽在应对真菌防治方面受到了极大关注。抗菌肽作为新型抑菌物质，其对细菌的抑菌机理报道较多，而对青霉菌的抑制机理报道较少。扩展青霉作为常见的采后水果腐败菌，其生长会导致水果腐烂变质，产生的展青霉素会危害人体健康，而且被展青霉素侵染的果制品难以根除其污染，因此要从根本上避免采后水果被青霉菌侵染。本研究以新型的抑菌物质抗菌肽作为抑菌剂，探究其对引起水果腐败的常见病原菌扩展青霉的抑菌作用。结果表