不同脂肪含量对牛奶中氯霉素残留检测影响的探究.pdf

10 2023.12试验研究0 引言氯霉素是一种广谱抗生素，于1947年从委内瑞拉链霉菌中分离出来，并在全球范围内用于治疗人类和动物的传染病，对许多致病菌、立克次体和支原体都有效，并且能够通过与原核细胞中的50S核糖体亚基结合来发挥作用，抑制蛋白质的合成1。氯霉素在兽医临床应用中主要是治疗动物伤寒和其他全身性沙门氏菌感染，但氯霉素使用后存在再生障碍性贫血、骨髓抑郁、过敏反应和胃肠道紊乱的风险2，在动物食品中残留还有引起耐药菌产生的可能性，会对人类健康造成威胁，特别是婴幼儿身体健康。因此1994年来，欧盟（EU）一直禁止在食用动物中使氯霉素，而且在动物源性食品中没有确定最大残留限度（MRL），因为其毒性作用不是剂量依赖性的。为达到监测氯霉素方法的统一分析标准，欧盟在收稿日期：2023-10-31基金项目：宁夏职业技术学院（或宁夏开放大学）科研发展基金资助（XJ202125）作者简介：贺林芝（1987-），女，硕士，讲师，研究方向：畜禽遗传育种与繁殖。贺林芝，李永琴不同脂肪含量对牛奶中氯霉素残留检测影响的探究J现代畜牧科技，2023，103（12）：10-14doi：10.19369/ki.2095-9737.2023.12.003HE Linzhi，LI YongqinStudy on the Effect of Different Fat Content on the Detection of Chloramphenicol Residues in MilkJModern Animal Husbandry Science&Technology，2023，103（12）：10-14不同脂肪含量对牛奶中氯霉素残留检测影响的探究贺林芝1，李永琴2（1.宁夏职业技术学院，宁夏 银川 750021；2.宁夏兽药饲料监察所，宁夏 银川 750011）摘要：选取市售7种类型的21份牛奶产品，进行氯霉素残留检验，通过基质加标试验，探究不同牛奶基质对检验结果的影响。结果表明，在市售的21份牛奶中脂肪指标是影响氯霉素检测回收率的主要因素，该研究通过尝试3种不同的方式降低在提取过程中脂肪与乙酸乙酯的乳化反应，最终确定低温高速离心的方式能够在不降低检验工作效率的基础上较为有效的提升高脂肪含量牛奶基质中氯霉素检测的回收率。方法优化结果显示，高脂肪牛奶平均回收率由65%提升至93%，批间相对标准偏差为6%，说明前处理提取方法优化后，牛奶基质中脂肪对检测结果的影响下降，方法准确度高，能够用于牛奶中氯霉素残留的检验。关键词：牛奶；氯霉素；脂肪；乳化反应中图分类号：TS252.7文献标识码：Adoi：10.19369/ki.2095-9737.2023.12.003Study on the Effect of Different Fat Content on the Detection of Chloramphenicol Residues in MilkHE Linzhi1，LI Yongqin2（1.Ningxia Polytechnic，Yinchuan Ningxia 750021，China；2.Ningxia Veterinary Medicine and Feed Supervision Institute，Yinchuan Ningxia 750011，China）Abstract：Select 21 milk products of 7 types available on the market for chloramphenicol residue detection，through matrix spiking tests，exploring the impact of different milk matrices on test resultsThe results showed that fat index was the main factor affecting the recovery rate of chloramphenicol detection in the 21 milk products sold on the marketThis study attempted three different methods to reduce the emulsification reaction between fat and ethyl acetate during the extraction processFinally，it was determined that the low-temperature high-speed centrifugation method can effectively improve the recovery rate of chloramphenicol detection in high fat milk matrix without reducing the efficiency of the inspection workThe method optimization results showed that the average recovery rate of high fat milk increased from 65%to 93%，with an inter batch standard deviation of 6%This indicates that after the optimization of the pre-treatment extraction method，the impact of fat in the milk matrix on the results decreased，and the method accuracy is highIt can be used for the detection of chloramphenicol residues in milkKeywords：milk，chloramphenicol，fat，emulsification reaction112023.12试验研究2002年定义的最低要求性能极限（MRPL）为0.3 g/kg，该极限对应于样品中分析物的最低含量，至少必须进行检测和确认。我国农业农村部第250号公告持续将氯霉素列入食品动物中禁止检出的药物清单。氯霉素通过奶牛临床用药残留到牛奶中会造成生鲜乳的质量问题，有抗奶无论是从抑制乳制品生产方面，还是造成耐药菌产生方面都会影响牛奶的质量安全3，因此提升牛奶中氯霉素的检测水平对保障食品安全有重要意义。1 国内外研究进展目前，对水产、畜禽产品中氯霉素残留的检测方法国内外报道很多，而牛奶中氯霉素残留的检测方法国内报道较少。国外研究主要集中在利用新技术开展氯霉素残留检测，2015年，Taranova N A等4建立了一种基于免疫层析方法的牛奶中多种抗生素的同时检测方法，根据抗体峰值波长的不同设计了“红绿灯”式的检测系统，从检测系统的变化判断不同抗生素的残留情况，氧氟沙星、氯霉素和链霉素的检测限分别为0.3、0.12 ng/mL和0.2 ng/mL，该方法无需预处理牛奶，可快速地检测牛奶中的抗生素残留；2022年，Src B等5建立了一种基于高效液相色谱的牛奶中氯霉素和阿莫西林的检测方法，该方法将浊点萃取法与高效液相色谱结合，实现了牛奶中氯霉素和阿莫西林的灵敏检测，检测限分别为2.98 ng/mL和7.46 ng/mL；Barveen N R等6提出了一种新型的表面增强拉曼散射（SERS）基底，该基底具有银纳米颗粒（Ag-NPs）在钒酸银纳米棒（-AgVO3-NRs）上的异质结合，可用于超灵敏检测氯霉素（CAP），Ag-NPs在-AgVO3-NRs上的CAP分子的SERS测量显示出痕量水平的检测极限在10 ng/mL；Amiripour F等7研究了一种基于纳米结构分子印迹聚合物（MIP）的光学传感器，该聚合物涂覆在发光的锆金属有机骨架（MIP/Zr-LMOF）上，可在荧光检测氯霉素残留。该方法线性范围可检测的CAP浓度为（0.16161.56 g/L），检出限为0.013 g/L。国外研究多集中于利用新型方法进行氯霉素的快筛检测，在定性定量确证方面精确度劣与当前常用的质谱检测技术。国内研究中，那文志等8采用冷冻高速离心分离脂肪和沉淀部分蛋白，用乙酸乙醋提取，正己烷脱脂，外标法定量，建立了一种牛奶和奶粉中氯霉素残留量的超高效液相色谱质谱检测方法；李琴等9采用液质联用的方法直接分析牛奶中氯霉素的残留量，无需衍生化，采用内标法二级质谱定性定量建立了牛奶中氯霉素残留量LC-MS/MS快速测定方法；董保磊等10研究拟合成绿色环保的碳点无机纳米复合物，提高碳点与抗体的偶联效率，通过构建新型的荧光免疫分析方法，建立牛奶样本中氯霉素检测的磁性荧光免疫分析方法，实现对氯霉素的高灵敏、快速检测。国内外研究中氯霉素的检测主要有酶联免疫吸附反应、气相色谱质谱联用、免疫胶体金法11和高效液相色谱串联质谱法8等检测方法，牛奶中氯霉素有使用快速检测试剂盒进行分析的，如化学发光免疫分析检测和ELISA检测。这些快速检测试剂盒的结果还需要进一步评估，因为结果显示，试剂盒检测所产生的假阳性结果不可忽视。也有采用高效薄层色谱（HPTLC）和高压液相色谱结合紫外检测（HPLC-UV）分析的，但是后一种技术很少使用，主要是因为这种检测器不够强大，无法有效地测定复杂基质中微量水平的氯霉素残基。随着技术的不断提升，目前应用最多的是高效液相色谱串联质谱法，超高效液相色谱串联质谱法具有分析速度快、分离度好、灵敏度高，可有效避免酶联免疫法出现假阳性现象，降低液相色谱法的检出限，避免基质干扰，可同时测定多种氯霉素类药物的优点，因而得到普遍应用12。从食品等复杂的基质中选择性地提取目标分析物的主要技术难点和瓶颈是复杂的样品制备和处理步骤。经典的方法包括各种溶剂的混合，然后进行离心和随后的固相萃取和（或）液液萃取步骤。传统的固相萃取技术中的吸附剂或液液萃取步骤良好的保留了目标分析物，但也有其他可能干扰目标化合物检测的化学物质。此外，在利用电喷雾离子源质谱进行检测时，这些干扰化学物质也可能导致离子抑制或增强现象。在牛奶检测应用过程中，氯霉素检测还存在前处理过程易乳化，影响检测提取率和回收率等技术瓶颈，本研究通过对比超高温灭菌奶、巴氏灭菌奶、调制乳等牛奶产品中氯霉素检测的回收率，探究影响氯霉素检测准确度的影响因素，有针对性的优化牛奶前处理方法，避免在前处理过程中因乳化造成的检测准确度下降的问题。2 试验仪器与材料2.1 仪器ACQUITY UPLC-Xevo TQ-S micro型超高效液相色谱串联质谱联用仪，美国Waters公司；CT15RT型高速冷冻离心机，日本HITACHI公司；AE-205型电子天平，瑞士Mettler Toledo公司；RV10数显型立式旋转蒸发仪，德国IKA公司；氮吹仪，美国Organomation Associates公司；SUPELCO固相萃取装置，默克公司。2.2 试剂与材料C18固相萃取柱（200 mg，6 mL），美国Waters公司；0.22 m微孔亲水性聚丙烯滤膜，美国Waters公司；乙酸乙酯、乙腈、甲醇、正己烷均为色谱纯，美国Fisher公司；氯化钠为分析纯，西陇科学；所用水均为超纯水。2.3 标准品氯霉素和氘代氯霉素（来源于德国DrEhrenstorfer GmbH公司）。12 2023.12试验研究2.4 样品从超市采集市售的7种不同类型的液体纯牛奶各3份，共21份。样品种类及各项指标情况，见表1。表1 样品种类及各项指标情况 单位：g/100 mL序号产品种类脂肪蛋白质碳水化合物1类全脂灭菌纯牛乳3.83.04.82类脱脂灭菌纯牛乳03.25.03类超高温灭菌乳1.43.65.04类超高温灭菌乳3.53.04.75类调制乳3.73.25.06类全脂调制乳4.63.35.07类全脂灭菌乳3.73.04.83 试验方法应用GB 296882013食品安全国家标准牛奶中氯霉素残留量的测定液相色谱串联质谱法对样品进行氯霉素含量测定，确定均为无氯霉素残留样品后进行后续试验。3.1 仪器条件3.1.1 液相色谱条件色谱柱：Waters BEH C18（50 mm2.1 mm 1.7 mm）；流动相：A：乙腈，B：水溶液；梯度洗脱：3%A保持0.5 min，0.53 min，3%A线性变化至50%A；33.1 min，50%A线性变化至3%A；保持1.9 min；进样量：2 L；柱温：40；流速：0.25 mL/min，运行时间：5 min。3.1.2 质谱条件采用ESI正离子多反应监测（MRM）模式；毛细管电压1.0 kV；源温150；脱溶剂气温度500；雾化气流速1 000 L/h；锥孔气流速50 L/h。定性、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量，见表2。表2 氯霉素定性、定量离子对和锥孔电压及碰撞电压药物定性离子对（m/z）定量离子对（m/z）锥孔电压（V）碰撞电压（V）氯霉素321/151.6321/151.63015321/256.813氘代氯霉素（CAP-D5）325.8/156.6325.8/156.630153.2 样品提取与净化取试料10 g（精确到0.01 g）与50 mL离心管中，加氘代氯霉素内标工作液0.01 g，加氯霉素标准工作液0.01 g，再加乙酸乙酯20 mL，振荡15 min，8 000 r/min离心10 min，取乙酸乙酯层液于鸡心瓶中，再加乙酸乙酯20 mL重复提取1次，合并两次提取液于鸡心瓶中，于45 水浴旋转蒸发至干。用4%氯化钠溶液5 mL溶解残留物，加正己烷5 mL振荡混合1 min，静置分层，弃正己烷液。再加正己烷5 mL，重复提取1次。取下层液备用。C18柱依次用甲醇5 mL和水5 mL活化，取备用液过柱，用水5 mL淋洗，抽干，用甲醇5 mL洗脱，收集洗脱液，于50 氮气吹干。用50%乙腈1.0 mL溶解残余物，涡旋混匀，滤膜过滤，供液相色谱串联质谱测定。4 结果与讨论4.1 氯霉素加标回收检测结果利用国标检测方法对市售的21份牛奶产品进行氯霉素残留测定，结果显示均为无氯霉素残留产品，之后将21份产品样品确定为7种类型的空白试料进行后续的氯霉素标准工作液基质加标回收检测试验。每份样品中分别进行氯霉素和氘代氯霉素0.01 g/kg的标准工作液添加，之后利用GB 296882013 食品安全国家标准 牛奶中氯霉素残留量的测定液相色谱串联质谱法进行回收率测定，结果发现不同类型牛奶氯霉素检测回收率存在差别，具体结果见表3。7种类型的牛奶基质加标平均回收率在64%104%，表明试验结果准确可靠，但不同类型的牛奶基质对应的回收率存在差别。表3 7类牛奶产品氯霉素检测回收率结果样品 编号氯霉素测定浓度（ng/g）平均值（ng/g）相对标准偏差（%）回收率（%）1类0.590.644640.660.672类0.991.0461041.021.113类0.770.734730.690.724类0.620.653650.680.665类0.810.833830.820.866类0.880.844840.820.817类0.830.852850.850.874.2 讨论此次通过基质加标试验验证不同类型牛奶基质对氯霉素残留检测的影响，通过试验结果发现，不同类型商品牛奶基质对氯霉素检测的回收率存在差别。在提取过程中，发现牛奶在加入提取剂乙酸乙酯后混匀过程特别容易发生乳化现象，见图1、图2，后续离心后回收的乙酸乙酯的剂量也因此减少，见图3。在试验中，不同类型牛奶乳化反应严重程度由重及轻依次为4类1类3132023.12试验研究类5类6类7类2类，结合王亦琳等13对GB 296882013标准提取不充分会引起结果偏低的结论，以及脂肪和乙酸乙酯结合容易发生乳化反应的现象，研究认为脂肪成分的不同是造成7种类型牛奶氯霉素检测回收率差别的主要原因之一，在前处理其他操作没有误差影响的情况下，脂肪因素占主要部分。脂肪与牛奶的螯合作用使得前处理时提取试剂被损失，导致后续氯霉素的检测值相应受到损失。本研究采取措施降低乳化反应后，提取剂损失减少，回收率升高。因此本研究通过降低脂肪对试验的影响提升了试验检测的精确度。图1 2类牛奶与乙酸乙酯 图2 4类牛奶与乙酸乙酯 混匀后未发生乳化现象 混匀后乳化现象较为明显 图3 发生不同程度乳化反应后1类、2类、3类、4类 牛奶离心后状态为探究乳化现象是否为影响试样氯霉素检测回收率的主要原因，本研究尝试用3种破乳化反应的方法去验证脂肪与提取效率的关系。方法1，在提取步骤中加入乙酸乙酯的同时加入5 g氯化钠，涡旋混匀后中速振荡10 min，后按照国标GB 296882013方法进行后续的提取与净化处理；方法2，在提取步骤中加入乙酸乙酯，涡旋混匀后在-2 下15 000 r/min低温高速离心10 min，后按照国标GB 296882013方法进行后续的提取与净化处理；方法3，在提取步骤中加入乙酸乙酯的同时加入500 L水14，后按照国标GB 296882013方法进行后续的提取与净化处理。通过试验对比发现3种方法都能够起到不同程度破除乳化反应的效果，但是方法1中加入氯化钠需要多次称量操作，影响提取的时间效率，方法3加入水后在旋蒸时残留的水分容易引起暴沸现象，影响提取效率，最终本研究选择通过低温配合高速离心的方法去除脂肪对氯霉素提取效率的影响，前处理方法经优化后7种类型氯霉素加标回收率均保持在88%120%，高脂肪产品回收率从65%提升至93%，具体结果，见表4。结果表明，通过前处理去乳化操作能够避免不同类型牛奶基质对检测结果的影响，并且通过优化能够较为精准的检测牛奶产品中氯霉素药物残留，对保障牛奶产品质量安全有技术支撑意义。表4 方法优化后7类牛奶产品氯霉素检测回收率结果样品编号氯霉素测定浓度（ng/g）平均值（ng/g）相对标准偏差（%）回收率（%）1类0.880.914910.950.912类0.991.0661061.081.113类0.920.902900.910.884类0.990.936930.870.925类0.950.994991.021.016类1.031.0351030.991.087类0.960.924920.920.885 小结牛奶作为人民日常生活中非常普遍的营养品，其质量安全的保障非常重要，因此规避牛奶本身基质效应，提升牛奶中氯霉素残留的监测能力和水平能够为保障牛奶质量安全提供技术支撑，本研究在国标GB 296882013方法的基础上对前处理步骤进行了优化和验证，通过对比3种不同的破乳化反应方法，最终通过检测数据确定低温高速离心能够在保证检验效率的基础上提高检验精确度，有效去除牛奶中脂肪因子与提取试剂乙酸乙酯之间的乳化反应，降低了乳化反应对氯霉素残留检测的影响。该方法准确度和精密度均符合欧盟2002/657/EC和我国农牧发20031号文对残留量测定的要求，非常适合在牛奶中氯霉素残留检测工作中应用。参考文献1高林氯霉素的不良反应及其残留检测方法研究进展J动物医学进展，2010，31（4）：90-952李桂伟，花丽茹禁用兽药氯霉素J黑龙江水产，201514 2023.12试验研究（3）：23-253陈晓燕，周静峰，施家威基质分散固相萃取-高效液相色谱-可变波长检测法测定新鲜牛奶中8种抗生素J食品安全质量检测学报，2021，12（12）：4 437-4 4464Taranova N A，Berlina A N，Zherdev A V，et alTraffic lightimmunochromatographic test based on multicolor quantum dots for the simultaneous detection of several antibiotics in milkJBiosensors and Bioelectronics，2015，63：255-2615Src B，Ulusoy H I，Ulusoy S，et alApplication of cloud point extraction for residues of chloramphenicol and amoxicillin in milk samples by HPLCDADJEuropean Food Research and Technology，2022，248（2）：437-4456Barveen N R，Wang T J，Chang Y HRetraction：Synergistic action of star-shaped Au/Ag nanoparticles decorated on AgFeO2 for ultrasensitive SERS detection of a chemical warfare agent on real samplesJAnal Methods，2022，4（9）：9627Amiripour F，Ghasemi S，Azizi S NDesign of turn-on luminescent sensor based on nanostructured molecularly imprinted polymer-coated zirconium metal-organic framework for selective detection of chloramphenicol residues in milk and honeyJFood Chem，2021，347：129 0348那文志，段文超，姜源超高效液相色谱串联质谱法检测牛奶及奶粉中氯霉素残留J生命科学仪器，2013，11（Z1）：23-269李琴，王宇坤，仵军红牛奶中氯霉素残留量LC-MS/MS快速测定方法J食品工程，2019（4）：60-6210 董保磊，李红芳，于雪芝，等基于碳点-磷酸钙纳米复合物的“绿色”荧光免疫分析法检测牛奶中氯霉素残留研究C中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十五次学术讨论会论文集，2019：296-29711 李周敏，方惠群，许丹科牛奶中残留抗生素免疫检测方法研究进展J生物技术通用，2012（11）：6712 王浩，赵丽，杨红梅，等液相色谱串联质谱法测定牛奶中35种四环素类、磺胺类、青霉素类、大环内酯类、氯霉素类抗生素残留J色谱，2015，33（9）：995-1 00113 王亦琳，孙雷，尹晖，等牛奶中氯霉素残留量测定能力验证结果分析J食品安全质量检测学报，2021，12（2）：685-68914 马辉，温花，赵绪永，等牛奶中氯霉素残留检测及四种前处理方法效果的比较J现代牧业，2022，6（1）：11-12编辑：方雅琪