环境样品前处理.docx

硅胶的活化：

DCM（CH2CL2清洗硅胶）(进口的不需要清洗，国产的要清洗)：

将硅胶装于玻璃柱中

3倍于硅胶体积的甲醇清洗（大约800－1000mL的甲醇）

同体积的DCM清洗（大约500ML的DCM）

将硅胶置于铝箔纸上，通风厨过夜让溶剂挥发干净（或者N2吹干）

马福炉中550℃烘烤至少12hrs,然后降温到180℃停留至少1hr

取出在干燥器中降温后，转制烧瓶中加塞密闭，于干燥器中备用。

Note: 在玻璃柱中清洗时防止硅胶有断层出现

酸性硅胶的配制
30％酸性硅胶的配制

于烧瓶中称取100g活化硅胶

于硅胶上逐滴滴入浓H2SO4共40g(硫酸密度为1.84g/mL)
计算公式为 x/(x+100)=30％， x=42.86g, 42.86/1.84=23.3mL
Note 边加边摇，以防结块，或置于摇床上至硅胶为均匀流动状态

置于干燥器中保存

若配制时用50g硅胶，那么H2SO4取11.65mL(大约为21.4g)
22%酸性硅胶：8mL浓H2SO4加50g活化硅胶
44%酸性硅胶：43mL浓H2SO4加100g活化硅胶
44%酸性硅胶：21.5mL浓H2SO4加50g活化硅胶
43×1.84/(100+43×1.84)= 44%

Note: 楼上的方法不能用于楼下，因为所用的硅胶不同，色谱行为就不同，即使柱形一样。因为楼上用的硅胶与楼下的不同，所以不能方法混用。楼上硅胶是国产，楼下的是进口的。

碱性硅胶的配制（1.2%）
100g活化硅胶

滴入30g 1 N的NaOH(1N NaOH: 1.2gNaOH溶于30mL水)

注意：不要使硅胶沾到烧瓶的内磨口上，否则盖子关上后容易粘住打不开

楼上用的是33%的碱性硅胶 （水＋NaOH）/(水＋NaOH+硅胶)＝33%
1g NaOH 加到25mL水里，即配制成了1mol/L的溶液，然后加入到50g活化硅胶中。

氧化铝：
酸性氧化铝的活化

酸性氧化铝装于烧瓶中（体积不超过一半）

用铝箔纸疏松的盖住瓶口

在干燥烘箱中130℃过夜（至少12hrs）

干燥器中加塞密闭

干燥器中备用

碱性氧化铝：（最好在两周内使用，后者最好在5天内用完，否则易失活，可能需要重新活化）

碱性氧化铝盛于蒸发皿中

马福炉中600℃烘至少24hrs

降温到130℃停留至少3hrs

干燥器中降温后转至烧瓶中，于干燥器中备用

弗罗里土：Florisil(硅酸镁)

150mm×5mmID小柱底部用玻璃棉轻轻塞住

取1g 弗罗里土装于柱子中，并且轻轻拍动柱子让填料均匀沉降

上层再装约1cm的无水Na2SO4

50mL DCM清洗小柱

卸去四氟阀，放于通风橱中过夜，让溶剂挥发干

整个柱子置于干燥烘箱中，140℃至少24hrs

如不使用则在140℃下存放

Note：使用时将柱取出降至室温，90分钟内使用，否则重新活化。

AgNO3 硅胶（10%）的配制

5.6g AgNO3溶于21mL超纯水中

逐滴加入到50g活化硅胶中（或者11.2g AgNO3+35mL水+100g硅胶）

用铝箔纸将装AgNO3硅胶的烧瓶全部包裹住，烧瓶口用铝箔纸疏松地盖住，置于干燥烘箱中

烘箱中30℃烘5hrs(至少5hrs)

升温到60℃停留3hrs

中间慢点升温
升温到180℃至少12hrs

干燥器中降温后加塞密闭（保存在棕色干燥器中备用）

Note:如果在制作过程中发现AgNO3硅胶颜色加深或者局部变为灰黑色，应该弃去此次配制。变色原因：升温过快。

Note:装AgNO3的小烧杯要尽快用超纯水洗净，否则AgNO3会粘到烧杯上，不容易洗干净。

Na2SO4： 660℃下马福炉中烘至少6 hrs（优级纯）
注意：提取筒洗过后要在马福炉里420℃烘一段时间

纯化注意事项：

1 所有纯化柱均采用干法装制；
2 装好填料后轻拍柱子至填料表层平整；
3 一旦加上洗脱液后，则不要再拍动柱子；
4 一定量的hexane预淋洗进行稳定，并且除去部分污染杂质；
5 预淋洗时流速控制在2滴/S;
6 填料若出现断层则不能再使用；
7上柱样品后，用1mL正己烷清洗烧瓶；
8 要等上一组分液面约1mm时再上样；
9 若是做流出曲线，对体积要求就会严格一些，接流出物的量筒用铝箔包上，防止溶剂挥发。

酸洗or酸性硅胶柱：1.5cm内径（15mmID）
结构式 －Si－O－

玻璃毛填充

5g 44%酸性硅胶

5g 22%酸性硅胶（这个是为了防止44%硅胶发生炭化）

2g活化硅胶

2 cm无水Na2SO4

50mL---70mL的Hexane淋洗

样品上样

70mL---100mLHexane洗脱

旋转蒸发至2---3mL

2 cm无水Na2SO4
2g活化硅胶
5g 22%酸性硅胶
5g 44%酸性硅胶

淋洗用的Hexane量由所加的硅胶量决定，若酸性硅胶（22%+44%）一共才10克，就不用100mLHexane洗脱，70mL足够，太多反而将杂质洗脱下来了。预淋洗用溶剂量也不一定要50mL—70mL,由硅胶量决定。
酸洗前一定要记住：一定要将溶剂置换为Hexane再酸洗。
硫酸硅胶柱净化容量不足，杂质易与dioxin 及PCBs竞争氧化铝及florisil的活性基位（Active sites），使dioxin 及PCBs在流洗过程中损失，降低了回收率。故acid silica要不能被穿透为止（由管柱的颜色外观可以判定是否被穿透）
Note：酸洗前，若样品溶剂为DCM，要将DCM置换成Hexane，CH2CL2不能与H2SO4混合，过酸性柱前将甲苯溶剂也要置换为Hexane,甲苯剩下的越少越好。

酸洗：（注意酸洗最多次数不要超过3次，否则影响回收率）

在溶液中加入15g酸性硅胶和搅拌磁子，在磁力搅拌器上搅拌30mins

取上清液过无水Na2SO4小柱

剩下的硫酸硅胶用10－20 ML的Hexane清洗两次（于磁力搅拌器上搅拌各10分钟）

每次清洗后过无水Na2SO4小柱，一并收集

合并后收集浓缩

酸性硅胶柱可以吸附许多离子或者非离子性官能基化合物，包括生物碱，糖脂，配糖物（醣），染料，碱金属离子，脂质，甘油，类固醇，可塑剂，多环芳香族化合物及酚类衍生物等。

酸碱硅胶柱纯化（复合硅胶柱）30cm×15mmID
底部有200目玻璃砂芯和四氟磨口阀

1g活化硅胶 1g活化硅胶

4g碱性硅胶 4g碱性硅胶

1g活化硅胶 1g活化硅胶

8g酸性硅胶 8g酸性硅胶

2g活化硅胶 1g活化硅胶

1cm无水Na2SO4
2gAgNO3硅胶

100mLHexane预淋洗

2cm无水Na2SO4
75mLHexane洗脱

100mLHexane预淋洗

上样后用150mL (DCM/Hexane=5/95)洗脱

2 cm无水Na2SO4
2cm无水Na2SO4
1g活化硅胶
2 g AgNO3硅胶
8g 44%酸性硅胶
1g活化硅胶
8g酸性硅胶
1g活化硅胶
3g碱性硅胶
1g活化硅胶
1g活化硅胶
4g碱性硅胶
1.5g－2 g AgNO3硅胶
1g活化硅胶
1g活化硅胶

楼下的方法 ：先用100mLHexane
预淋洗，上样后用150mL洗脱。
DCM/Hexane＝5/95
楼上的方法 ：先用70mL---90mLHexane预淋洗，上样后，用100mLHexane洗脱。

注意：AgNO3硅胶不要加得太多，它对PCBs有吸附作用，AgNO3硅胶尽量称得准确些，它对流出曲线影响较大些（AgNO3有一定的极性）
分析PBDE时，要用铝箔纸将层析柱包上，防光（PBDE与AgNO3都要防光）
分析PBDE时是一样的柱子，一样的填料，洗脱是先100mLHexane预淋洗，上样后先用70mLHexane洗，弃去，再用70mL 1：1（DCM/Hexane）洗，这时洗下的就是含有PBDE的成分。

1cm无水Na2SO4

6 g 酸性or 碱性氧化铝

氧化铝纯化柱： 30cm×15mmID玻璃柱

6 g 酸性or 碱性氧化铝

1cm无水Na2SO4

100mL Hexane 预淋洗

酸性氧化铝 碱性氧化铝
DCM : Hexane (1:1,V:V) DCM:Hexane(1:1, V:V)
40mL洗脱 30mL－40mL洗脱

旋蒸时留1mL左右，因为弗罗里土纯化柱太细，要减小上样的高度，洗脱时注意控制流速，不能太快，塞子不要垂直，倾斜既可

弗罗里土纯化柱： 柱型 150mm×5mmID

玻璃棉

1g弗罗里土

1cm无水Na2SO4

50mL DCM清洗

溶剂挥发（要卸下塞子）

140℃下至少烘24hrs

冷却后90min内使用（装上塞子）

50mLHexane预淋洗

35mL收集PCBs（30mL-35mL洗脱）DCM:Hexane(5:95,V:V)

DCM（二氯甲烷）40mL-45mL收集dioxins

生物组织脂肪含量测定和去除：
提取脂肪前烧瓶称重

提取液转移至此烧瓶旋转浓缩近干后移至N2流下将多余溶剂吹走，直至天平称重无变化（百分位天平）

称量提取后烧瓶重

两次重量差即为脂肪含量

脂肪含量＝【（提取后烧瓶重－提取前烧瓶重）/提取样】×（1－组织水分百分含量）

称脂后加50mLHexane溶解提取物
15g酸性硅胶，搅拌磁子
搅拌30mins
过无水Na2SO4小柱
5mLHexane清洗两次
合并收集后浓缩

楼上氧化铝0.8 cmID,细柱，半湿法装柱
若是1.0cmID,则Al2O3用10g

柱中加30mLHexane

8g Al2O3

1cm Na2SO4

预淋洗（30mL-40mLHexane洗脱）

上样

DCM/Hexane＝5：95 100mL洗脱PCBs
DCM/Hexane＝1:1 50mL洗脱dioxins
凝胶渗透色谱 GPC
填料： Bio-Beads SX3
GPC 柱型 30cm×25mmID(柱子下面有砂芯)

填料 30g于烧杯中

加入DCM:Hexane（1：1，V：V）全部盖住

铝箔纸盖住烧杯置于通风橱过夜，至少12hrs,填料充分溶胀

搅动填料，并用吸管逐步将填料转移到柱中，中间打开四氟阀放去多余的溶剂

全部转移后，上部留有10cm溶剂

上端加塞，底部关阀

整个柱子倒置后打开阀门

振荡柱体，使填料逐渐整体均匀倒置

关闭阀门，将柱子缓慢扶正，并且打开上面的磨口塞，可以看到填料均匀沉降直至完全

应该无断层，无气泡，无沉降分界层

500mL DCM：Hexane（1:1 ,V:V）淋洗，（注意要将溶剂混合均匀）
滴速 2－3滴/S

不用时关阀加塞密闭，上层留有5CM以上的溶剂，GPC使用溶剂均为DCM：Hexane（1：1，V:V）若长时间没用，纯化前用100mL溶剂预淋洗

GPC洗脱

DCM：Hexane(1:1,V:V)

100mL 预淋洗（量筒接）量筒1

上样后，先用50 mL DCM：Hexane(1:1,V:V)去掉大分子（量筒接）量筒2

另外量筒接70mL(DCM/Hexane=1/1)为PCB 量筒3

另外量筒接50mL,量筒4

量筒4与量筒2 50mL合并保存，以防重复实验时回收再分析

注意：
1若GPC柱中物料层有气泡，则上面用塞子堵上，稍微晃一下柱子可以去除。若溶剂干了会造成断层。
2GPC柱用前由于重心作用，上层发胀，所以需要释放一段洗脱溶剂，将发胀部分压下去，再上样。

N2吹

纯化后样品旋转蒸发

转移入KD管后N2吹

剩下0.2-0.3mL左右

进样小瓶瓶芯中加15uL的壬烷

Kd管中样品转移至瓶芯

N2吹（温度不要太高30℃－60℃，太高有损失）

洗KD管用DCM or Hexane至少洗2次，合并到进样小瓶瓶芯中
N2吹至瓶芯拐弯处上1mm－2mm处

加入回收标保证进样小瓶中最后溶液约为20µL左右

涡轮

注意 进样小瓶与瓶芯大小要搭配
加标前标准溶液需要提前从冰箱中拿出来平衡大约10几分钟

配制标准溶液： 举例

PBB标样转移到棕色小瓶A

小瓶A用DCM清洗3次（涡轮）

贴标签纸（标签纸不要贴太大，用透明胶贴一下）

称空瓶重量W0

将装标样的安培小瓶B按划线掰开

DCM清洗一下滴管，晾干，用滴管将标样安培瓶里的标准溶液吸出转移入小瓶A

称量装标后的小瓶与标的重量W1

那么W1-W0即为取的标的重量

C18柱结构式： －Si－C18H37
目的：清除极性物质，ex: 蛋白，脂质

铜粉去S前铜粉的准备

铜粉置于烧瓶中

6MHCL倒入清洗，不锈钢药勺搅拌

倒掉HCL，超纯水清洗数次，洗净HCL为止

倒入丙酮清洗数次，将水洗净

将铜粉晾干备用（晾干的方法可以用N2吹干）

分析PBDE时所用的方法

1.5 g AgNO3装到柱子里（30cm×15mmID玻璃柱）

50mL or 30 mL Hexane预淋洗

100mL Hex洗PCB+dioxin

50mL 10%DCM+90% Hexane洗PBDE