不同酵母发酵对蓝莓酒风味影响的研究.pdf

188现代食品XIANDAISHIPIN分析检测 Analysis and Testing酒是人类生活中重要的饮品之一。中国酒文化历史悠久，博大精深，早在几千年前，中国人就创造出独特的酒曲复式发酵法并用于大量酿造黄酒。如今，酒对于中国人来说，已不仅仅是食物，更是一种融合物质生产和精神创作的饮食文化1-3。现代酒类产业快速发展，酒类的产量销量与市场规模不断扩大。目前，市场上受欢迎的酒类主要有白酒、啤酒、果酒。在果酒领域内，蓝莓酒虽属小众品类，但也拥有悠久的酿造历史，早在明代就有了蓝莓酒可美容养颜、抵御湿寒、活血化瘀、强身健体等功效的文献记录。因此，自古以来，蓝莓酒就被认为具有美容的神奇功效，并一直流传至今。现代科学已经确定，经过发酵后的蓝莓酒可以刺激更多活性成分的产生，蓝莓酒不仅味道比蓝莓和蓝莓汁更吸引人，而且其含有的花青素和其他营养物质更易被身体吸收。相较于其他的酒类，饮用蓝莓酒更有利于身体健康。在欧洲，蓝莓酒被誉为“给人类寿命带来第三次飞跃”的神奇之物。不同于在欧洲的知名度，蓝莓酒在中国是个鲜为人知的小众酒类，远不如葡萄酒的市场知名度。由于最近几年酒类市场迎来消费升级转型，使得市场更doi:10.16736/41-1434/ts.2023.18.057基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目（202210876011）。作者简介：徐子雯（2002），女，本科在读，研究方向为食品科学与工程。不同酵母发酵对蓝莓酒风味影响的研究Research on the Impact of Different Yeast Fermentation on the Flavor of Blueberry Wine徐子雯，陈舒悦，罗怡婕，周钰雯，张慧恩（浙江万里学院，浙江 宁波 315100）XU Ziwen,CHEN Shuyue,LUO Yijie,ZHOU Yuwen,ZHANG Huien(College of Biological and Environmental Sciences,Ningbo 315100,China)摘 要：为了探究 AU、DE、RA3 种酵母对蓝莓酒挥发性风味物质的影响，本研究采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用（HS-SPME-GCMS)、主成分分析（PCA)、偏最小二乘法判别分析（PLS-DA)、感官评价等方法，分析 3 组蓝莓酒中风味物质的差异，以选出最适宜酿造蓝莓酒的酵母。关键词：蓝莓酒；风味物质；代谢组学；PCA；PLS-DAAbstract：In order to investigate the effects of AU,DE,and RA yeast on the volatile flavor compounds of blueberry wine,this study used methods such as headspace solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry(HS-SPME-GCMS),principal component analysis(PCA),partial least squares discriminant analysis(PLS-DA),and sensory evaluation to analyze the differences in flavor compounds in the three groups of blueberry wine,in order to select the most suitable yeast for brewing blueberry wine.Keywords：blueberry wine;flavor compounds;metabolomics;PCA;PLS-DA中图分类号：TS261Analysis and Testing189XIANDAISHIPIN现代食品分析检测偏年轻化，更易接受新奇酒类，消费者更加注重酒类风味多样化、低酒精度数及健康饮酒，蓝莓酒因此打开了中国市场4。当 前，顶 空 固 相 微 萃 取-气 质 谱 联 用（HS-SPME-GC/MS）技术已应用于各种类型酒样（如葡萄酒、红酒和白酒等）中挥发性香气成分的分析5。此外，主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（PLS-DA），都是利用原始数据呈现组间及组内差异的可视化技术，可从不同维度反映不同样本间的代谢组成的差异6。虽然近几年酒类风味物质的研究受到学者的高度关注，但是相较于其他酒类，蓝莓酒的相关研究还比较少。尽管近几年蓝莓酒越来越受到消费者的青睐，但是少有聚焦于蓝莓酒中挥发性风味物质和蓝莓酒的主要香气特征的研究。基于此，本文利用气相色谱质谱联用仪结合代谢组学对不同酵母发酵蓝莓酒风味物质的影响进行研究，旨在全面了解和认识不同酵母对于蓝莓酒风味物质的基础差异，从而选择最适合酿造蓝莓酒的酿酒酵母，为以后有关蓝莓酒香气物质的研究提供理论依据。1 材料与方法1.1仪器设备气相色谱质谱联用仪8890-5977B（安捷伦公司）；50/30 m DVB/CAR/PDMS 固相萃取头及萃取手柄（美国 Supelco 公司）；电子天平 B124S（赛多利斯有限公司）；磁力加热搅拌器 RT2（赛默飞公司）。1.2材料与试剂蓝莓：购于奉化蓝莓基地，充分成熟，采摘后立即于-18 保存；酵母 AU、DE、RA 购自烟台帝伯仕自酿机有限公司；氯化钠（分析纯）购于国药集团。1.3试验方法1.3.1 蓝莓酒的发酵工艺流程基本工艺流程：蓝莓果挑选解冻打浆调整成分（添加偏重亚硫酸钾、蔗糖、碳酸钙）接种酵母装罐主发酵倒罐陈酿成品酒。1.3.2挥发性风味物质的测定萃取条件：取 5.0 mL 蓝莓酒样，加入 20.0 mL 顶空瓶中，加入 1 g NaCl，在水浴锅中 50 平衡 10 min，将SPME 手动进样柄（萃取头型号：50/30 m PDMS/DVB/CAR）插入进样瓶中，50 萃取 30 min，取出萃取头插入气相色谱仪进样口，解析 5 min 后取出7-8。GC 条 件：HP-5MS 色 谱 柱（30 m0.25 mm0.25 m），不分流进样，柱温采用程序升温，50 保持 1 min，以 5 /min 升至 90 保持1 min，再以 1 /min 升至 100 保持 3 min，再以 2 /min 升至 120 保持 1 min，最后以 6 /min升至 250。进样口温度 250，载气为氦气，流速 1.0 mL/min9-10。MS 条件：电离方式 EI，电离电压 70 eV，离子源和四极杆的温度分别为 230 和 150 灯丝电流 0.25 mA，电子倍增器电压为 1 500 V，扫描范围40550 m/z11。1.3.3数据处理定性分析。通过检索与 NIST17 标准谱库进行比对，选择匹配度 70%的物质为有效物质。定量分析。采用峰面积归一法计算。主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），由 MetaboAnalyst网站进行分析。2 结果与分析2.1不同酵母蓝莓酒风味物质分析（1）利用 GC-MS 对 3 组不同酵母发酵的蓝莓酒中的风味物质进行采集和数据分析。经 NIST 17.0 数据库检索后，共鉴定出 76 个化合物（见表 1）。按照其化学结构性质可分为5类，包括有机酸类、酯类、醇类、萜烯类、酚类。其中，醇类 26 种，酯类 15 种，酸类15 种，萜烯类 13 种，酚类 7 种。3 种酒中醇类和酸类物质占比最多，其次是酯类。醇类物质是果酒香气的主要成分，醇类物质能够促进酯类物质香气成分的散发，使酒体更加饱满12-13。（2）3 种酒样含量较高的主要香气成分为异戊醇、苯乙醇、异丁醇、芳樟醇、-松油醇。异戊醇具有酒精味和特殊的指甲油的味道14；芳樟醇和苯乙醇具有玫瑰花香15。RA 酵母酿造蓝莓酒中醇类占比最高，对感官风味影响较大；DE 酿造的蓝莓酒醇类物质含量最低，这是由于酿酒所用酵母不同导致的。（3）酯类是赋予果酒丰富果香、花香的物质，与果酒整体风味的呈现具有重要关系。蓝莓酒中主要酯类物质有丁二酸二乙酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯等，这些酯类物质增加了酒体的果香与花香。结果显示，AU 酵母酿造蓝莓酒中酯190现代食品XIANDAISHIPIN分析检测 Analysis and Testing类占比最高，其次是 DE。（4）蓝莓酒中含有较多的有机酸，主要来自蓝莓鲜果。有机酸能够影响蓝莓酒的酸甜比，对酒的口感具有较大影响。当酸类含量过高时，会大大降低果酒的香味，口感舒适度降低；当酸类含量较低时，能够带来清爽的口感，增加酒体的复杂性。相比较 DE 酿造的蓝莓酒有机酸含量最低，AU 酿造的蓝莓酒有机酸含量有所增加。表 13种蓝莓酒挥发性成分及含量表化合物Compound保留时间/min序号 CAS化合物名称Compound name匹配度Degree ofmatching相对含量Relative contentAU（%）DE（%）RA（%）有机酸类37.2804536-23-62-甲基己酸85.990.180.090.1351.935142-62-1己酸96.460.310.5259.331111-14-8庚酸93.120.090.0566.780124-07-2辛酸98.191.030.520.8273.961112-05-0壬酸95.981.041.241.0376.476334-48-5正癸酸90.510.740.740.8978.135112-37-8十一烷酸91.320.300.600.7279.435143-07-7月桂酸91.890.711.0780.561638-53-9十三酸82.310.070.2344.28188-09-5 2-乙基丁酸71.180.8059.318149-57-5异辛酸92.540.020.020.0275.4945963-14-48-甲基壬酸79.180.030.0277.524459-80-33,7-二甲基-2,6-辛二烯酸70.670.030.030.1559.318149-57-52-乙基己酸92.540.020.020.617541-48-03-氨基丁酸70.810.380.180.58酯类0.905108-64-5异戊酸乙酯91.040.220.260.203.234123-92-2乙酸异戊酯98.001.661.281.309.948123-66-0正己酸乙酯98.380.740.370.5932.124105-53-3丙二酸二乙酯95.300.050.030.0423.051106-32-1辛酸乙酯92.740.890.620.8036.24493-89-0苯甲酸乙酯96.360.310.160.2237.777123-25-1丁二酸二乙酯98.460.831.381.7940.831140-11-4乙酸苄酯93.360.170.200.1243.700119-36-8柳酸甲酯87.270.150.170.1845.940101-97-3苯乙酸乙酯88.460.110.060.0623.9172705-87-5环己基丙酸烯丙酯71.900.110.080.0620.983103-45-7乙酸苯乙酯94.230.670.400.4026.7506846-50-02,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯87.810.070.040.0522.783103-36-6肉桂酸乙酯87.840.050.0422.867134-20-3邻氨基苯甲酸甲酯94.920.210.270.00醇类2.00078-83-1异丁醇93.222.453.565.884.65971-36-3正丁醇88.500.080.180.1018.050111-27-3正己醇96.850.250.380.388.582123-51-3异戊醇98.7219.3823.0238.3615.535626-89-14-甲基-1-戊醇84.180.030.04Analysis and Testing191XIANDAISHIPIN现代食品分析检测（续表）化合物Compound保留时间/min序号 CAS化合物名称Compound name匹配度Degree ofmatching相对含量Relative contentAU（%）DE（%）RA（%）15.966543-49-72-庚醇92.710.050.0616.28942072-39-9(S)-(+)-3-甲基-1-戊醇95.750.140.350.1126.788104-76-72-乙基己醇76.850.140.1736.909143-08-8正壬醇95.420.050.0613.634116-02-93,3,5-三甲基环己醇78.460.050.0755.95360-12-8苯乙醇96.8514.2825.7028.5659.9353293-47-8二氢-紫罗兰醇84.070.030.1074.368112-53-8十二醇70.280.040.1072.320126-86-32,4,7,9-四甲基-5-癸炔-4,7-二醇91.460.060.0924.93734995-77-2反-,-5-三甲基-5-乙烯基四氢化-2-呋喃甲醇78.470.120.140.1617.16798982-97-91，2-二甲基-4-庚醇85.610.020.0223.60022607-13-21-苯基-1,2-丁二醇85.210.040.0419.3506812-78-8(S)-3,7-二甲基-7-辛烯-2-醇94.020.210.1011.61771-41-0正戊醇95.490.020.0117.3174457-71-03-甲基-1,5-戊二醇87.990.030.0214.467928-96-1叶醇87.500.030.0217.650111-87-5正辛醇86.210.080.0416.4174048-32-23-甲基-6-庚烯-1-醇71.460.020.0318.7174442-79-92-环己基乙醇74.580.0513.26742072-39-93-甲基-1-戊醇97.230.210.3420.5006627-74-31，2，2-三甲基-6-环己烯-6-甲醇73.590.080.12萜烯类35.2201490-04-6薄荷脑93.670.350.280.5335.22615356-70-4(+/-)-薄荷醇90.110.240.220.296.9475989-27-5右旋萜二烯92.650.080.060.1030.33978-70-6芳樟醇97.966.552.102.627.480470-82-6桉叶油醇96.290.130.1032.723562-74-34-萜烯醇85.620.030.0238.66910482-56-1-松油醇96.978.372.324.7045.359106-22-9香茅醇94.240.220.180.2048.221106-25-2橙花醇88.660.070.060.2252.384106-24-1香叶醇94.620.230.160.5832.72920126-76-54-萜品醇98.060.370.300.5634.669138-87-4-松油醇96.170.290.260.2945.3651117-61-9(R)-(+)-香茅醇94.620.170.120.15192现代食品XIANDAISHIPIN分析检测 Analysis and Testing2.2 蓝莓酒风味物质 PCA 和 PLS-DA 分析（1）PCA 分析是无监督的，即 PCA 分析并不考虑样品的分组信息。PCA 的目标是选择几个相互独立的因子代表所有代谢物，这些因子保留了关于原始代谢物变异的最大信息量。对此，本研究选择保留最多信息的 2 个因子，并构建一个散点图，显示一组代谢物的样本之间的结构差异16。（2）进行 PCA 主成分分析利用之前提取到的化合物，了解三组蓝莓酒之间的总体化合物表型差异。结果表明，3 种不同酵母的蓝莓酒前 2 个主成分 PC1和 PC2 的累计方差贡献率达 69.7%（如图 1），这说明主成分很好地概括了样品的原始数据信息。其中，PC1 占 48.5%，PC2 占 21.2%。PCA 模型包含 4 个主成分，拟合参数为R2X=0.924、Q2=0.860，图中 3 组样品明显分布在不同区域，区分显著，说明 3 种蓝莓酒的风味物质组成结构差异。（3）除了无监督模式的主成分分析 PCA 以外，本试验还使用 Metaboanalyst 对所有样本建立偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。判别最小二乘分析是受控的，即分析时需要聚类信息，PLS-DA 可用于寻找样本组间最大可能差异的因子。判别分析将要预测的连续分类变量编码为潜变量，在解释变量和潜变量之间建立回归，并使用最小二乘回归理论求解。PLS-DA 通过将预测变量和观测变量分别投射到一个新的空间来寻找线性回归模型，这表明 PLS-DA 模型的判别能力更强17。其中，变量重要性因子（VIP）可以量化每个变量对分类的贡献。当 VIP 值 1 时，对应变量可定义为判别模型的关键变量，VIP 值越大，对模型的重要性越大18。PLS-DA 的得分图（见图 2）表明 3 组蓝莓酒有明显的分离，PC1 和 PC2 分别解释了总方差的 46.3%和23.0%，3 组蓝莓酒的点云分布在不同的区域，PLS-DA 模型包含 2 个主成分，拟合参数为R2X=0.825、Q2=0.629。R2X 越接近 1 表明模型越稳定，Q20.5 表明预测率较高19。根据 VIP 值（VIP1）和P值（P1）和P值（P0.05）筛选出关键挥发性成分存在一定的内在联系，其中，-松油醇 VIP 值最大，在 AU 蓝莓酒中含量最高，可能是影响感官评价得分的关键物质。1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0V I P s c o r e sC A S1 0 4 8 2-5 6-16 0-1 2-89 6-7 6-41 2 3-5 1-31 2 3-2 5-11 1 3 8-5 2-97 8-8 3-17 8-7 0-61 1 2-0 5-01 2 4-0 7-21 4 2-6 2-11 2 3-9 2-25 4 1-4 8-01 5 3 5 6-7 0-42 0 1 2 6-7 6-5194现代食品XIANDAISHIPIN分析检测 Analysis and TestingTS.20230217.1022.008.html.5 王培璇，毛健，李晓钟，等.不同地区黄酒挥发性物质差异分析 J.食品科学，2014，35（6）：83-89.6 李俊星，吴海滨，罗剑宁，等.三种不同类型的丝瓜果实香气物质解析与比较 J.现代食品科技，2021，37（7）：228-237.7 王文治，陈璐，米艳华，等.基于顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法鉴别 3 种葡萄香气特征成分 J.食品安全质量检测学报，2022，13（24）：8075-8082.8 詹思佳，苏蔚莹，王道梁，等.顶空-固相微萃取和同时蒸馏萃取法提取肉桂的挥发性成分 J.中国食品学报，2022，22（12）：181-190.9 桂江平，于化泓，余勃，等.基于 GC-MS 江西米酒风味物质的分析及品质比较 J.中国酿造，2023，42（1）：231-237.10 袁文艳，胡佳星，张璐瑶，等.3 种不同酵母产蓝莓酒风味物质的研究 J.中国酿造，2020，39（7）：173-177.11 糜川清，郭安鹊，王华.感官分析及仪器分析在葡萄酒香气研究中的应用 J.食品科学，2012，33（23）：351-355.12 王鸿艳.蓝莓开发利用研究现状及发展前景 J.山西农经，2018（11）：58-61.13 吴艳艳，王辉，邢凯，等.发酵过程中添加酵母助剂对葡萄酒感官品质的影响 J.中国食品学报，2018，18（5）：280-287.14 曹雪丹，李二虎，方修贵，等.蓝莓酒主发酵前后挥发性成分变化的 GC-MS 分析 J.食品与发酵工业，2015，41（3）：179-184.15 鲁榕榕，马腾臻，张波，等.大豆蛋白澄清剂对赤霞珠干红葡萄酒品质的影响 J.食品与发酵工业，2018，44（3）：135-145.16 刘彬球，陈孝权，吴晓刚，等.PCA 和 PLS-DA 用于晒青毛茶级别分类研究J.茶叶科学，2015，35（2）：179-184.17 周佳，苏丹，王志霞，等.基于 HS-SPME-GC-MS 和多元统计分析三种红茶特征挥发性成分 J.食品工业科技，2023，44（17）：342-350.18TRIBA M N，LE MOYEC L，AMATHIEU R，et al.PLS/OPLS Models in metabolomics:the impact of permutation of dataset rows on the K-fold cross-validation quality parametersJ.Molecular biosystems，2015，11（1）：13-19.19 程超，夏兰欣，杜芬妮，等.基于 9 种风味物质的利川红 SPME 优化及 PLS-DA 风味识别 J.食品科学，2021，42（6）：215-222.20 郭营营，韩焱，张彦聪，等.基于 HS-SPME-GC-MS 和 PCA 分析陈酿条件对蓝莓酒品质的影响 J.食品与发酵工业，2021，47（20）：271-277.培养食品安全公德心培养食品安全公德心争做和谐社会文明人争做和谐社会文明人