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山东医药2023 年第 63 卷第 26 期不同氧浓度微环境中脑胶质瘤细胞生物学行为变化观察冯鹏程，曹奕强，汤荡，宋海，龙江，王永刚昆明医科大学第一附属医院神经外一科，昆明650000摘要：目的观察高氧、低氧、极低氧微环境中胶质瘤细胞生物学行为变化，并探讨其可能的机制。方法取人胶质瘤U251细胞进行体外培养，将细胞分为极低氧组、低氧组、常氧组、高氧组，分别置于5%极低氧条件（37，5%CO2，5%O2）、10.5%低氧条件（37，5%CO2，10.5%O2）、21%常氧条件（37，5%CO2，21%O2）、42%高氧条件（37，5%CO2，42%O2）中培养96 h。采用CCK-8检测各组细胞在0、24、48、72、96 h时的增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡情况，Transwell实验检测细胞侵袭能力，实时定量qPCR法检测细胞HIF-1 mRNA表达，DCFH-DA荧光探针染色法检测细胞ROS水平。结果与常氧组比较，极低氧组、低氧组、高氧组在24、48、72、96 h的增殖能力均降低；低氧组在48、72、96 h的增殖能力高于极低氧组和高氧组（P0.05或0.01）。与常氧组比较，极低氧组、低氧组、高氧组细胞凋亡率升高、细胞侵袭数量减少；与低氧组比较，极低氧组和高氧组细胞凋亡率升高、细胞侵袭数量减少（P均0.05）。与常氧组比较，较极低氧组、低氧组、高氧组细胞HIF-1 mRNA表达水平升高（P均0.01）；与低氧组比较，极低氧组HIF-1 mRNA表达水平升高、高氧组表达水平降低（P0.05或0.01）。与常氧组比较，低氧组、极低氧组、高氧组中细胞ROS水平均升高（P均0.01）；与低氧组比较，极低氧组和高氧组细胞ROS水平升高，且极低氧组高于高氧组（P均0.01）。结论U251细胞在正常氧微环境中生长状态最佳，低氧和高氧微环境均不利于其增殖和侵袭并能促进其凋亡；这些差异可能与氧浓度改变引发ROS/HIF-1信号通路调节有关。关键词：胶质瘤细胞；氧浓度；肿瘤微环境；细胞凋亡；细胞增殖doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.26.010 中图分类号：R739.4 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）26-0044-05Changes of biological behavior of glioma cells under different oxygen microenvironmentFENG Pengcheng，CAO Yiqiang，TANG Dang，SONG Hai，LONG Jiang，WANG YonggangFirst Department of Neurosurgery，The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650000，ChinaAbstract：Objective To observe the changes of biological behavior of glioma cells under different oxygen microenvironment，and to explore its possible mechanism.Methods Human glioma U251 cells were cultured in vitro.The cells were divided into the very hypoxia group，hypoxia group，normoxia group，and hyperoxia group，respectively.The cells were exposed to 5%very hypoxia（37，5%CO2，5%O2），10.5%hypoxia（37，5%CO2，10.5%O2），and 21%normoxia（37，5%CO2，10.5%O2），and 42%hyperoxia conditions（37，5%CO2，42%O2）for 96 h.CCK-8 was used to detect the proliferation of cells at 0，24，48，72，and 96 h.Flow cytometry was used to detect the apoptosis.Transwell assay was used to detect the invasion ability of cells.HIF-1 mRNA expression was detected by real-time quantitative qPCR.The level of ROS was detected by DCFH-DA fluorescent probe staining.Results Compared with the normoxia group，the proliferation abilities of the very hypoxia group，the hypoxia group and the hyperoxia group decreased at 24，48，72 and 96 h.The proliferation ability of the hypoxia group at 48，72 and 96 h was higher than that of the very hypoxia group and the hyperoxia group（P0.05 or P0.01）.Compared with the normoxia group，the apoptosis rates of the very hypoxia group，the hypoxia group and the hyperoxia group increased，and the numbers of invasion cells decreased；compared with the hypoxia group，the apoptosis rates increased and the numbers of invasion cell decreased in the very hypoxia group and the hyperoxia group（all P0.05）.Compared with the normoxia group，the expression levels of HIF-1 mRNA in the cells increased in the very hypoxia group，hypoxia group and hyperoxia group（all P0.01）.Compared with the hypoxia group，the expression levels of HIF-1 mRNA increased in the very hypoxia group and decreased in the hyperoxia 通信作者：王永刚（E-mail：）开放科学（资源服务）标识码（OSID）44山东医药2023 年第 63 卷第 26 期group（P0.05 or P0.01）.Compared with the normoxia group，the ROS levels in the hypoxia group，the very hypoxia group and the hyperoxia group increased（all P0.01）.Compared with the hypoxia group，the levels of ROS in the very hypoxia group and the hyperoxia group increased，and that in the very hypoxia group was higher than that in the hyperoxia group（all P0.01）.Conclusions U251 cells grow best under normal oxygen concentration.Both hypoxia and hyperoxia microenvironment are not conducive to their proliferation and invasion and promote their apoptosis.These differences may be related to the regulation of ROS/HIF-1 signaling pathway induced by the change of oxygen concentration in the microenvironment.Key words：glioma cells；oxygen concentration；tumor microenvironment；apoptosis；cell proliferation肿瘤微环境具有低氧、低pH、高压等特点，在肿瘤的自我更新、分化、转移过程中发挥重要作用。现有研究表明，在胶质瘤细胞的生物进程中，缺氧微环境的形成具有显著影响，酸性代谢产物堆积可导致细胞间质中各种细胞因子、炎症细胞浸润，增强胶质瘤干细胞的增殖能力和侵袭能力，并引起治疗耐受，导致患者预后不良1-2。了解胶质瘤与其所处微环境的关系对于改善胶质瘤的治疗前景具有重要意义。我们的前期研究显示，在颅内移植神经胶质瘤小鼠中，高压氧能够促进颅内胶质瘤细胞增殖和血管生成，抑制细胞凋亡3。既往多数研究通过建立低氧或高氧微环境，认为胶质瘤生长、侵袭与氧微环境密切相关4-7，但缺少低氧与高氧微环境中胶质瘤细胞生物学行为变化的对比。2022年3月7月，我们通过模拟细胞生长所处的氧微环境，观察高氧、低氧、极低氧浓度中U251脑胶质瘤细胞生物学行为的变化。1 材料与方法 1.1细胞、试剂与仪器人胶质瘤U251细胞购于昆明动物研究所。胎牛血清（美国Gibco）；青霉素/链霉素、胰酶、DMEM无糖培养基（大连美伦生物）；CCK-8试剂盒（日本同仁研究所）；结晶紫（北京索莱宝）；细胞凋亡检测试剂盒（美国BD）；活性氧（ROS）检测试剂盒（江苏碧云天）；Cell Staining Buffer购于（美国Biolegend）；488标记山羊抗兔IgG（武汉赛维尔）；TRIzol试剂盒（美国 Ambion）。CO2培养箱（美国Thermo），酶标板自动读数仪（美国BIO-RAD），倒置荧光显微镜（德国Motic），流式细胞仪（美国BD），实时定量荧光PCR仪（美国Bio-Rad）。1.2细胞培养取U251细胞，加入含10%胎牛血清和1%青链霉素的高糖DMEM培养基，置于5%CO2、37 培养箱中培养。当细胞密度接近80%，进行1 3胰酶消化传代，取第3代细胞用于后续实验。1.3细胞分组与干预处理取对数生长期细胞，加入胰蛋白酶消化，以3103/孔接种到96孔板，分为极低氧组、低氧组、常氧组、高氧组，分别置于5%极低氧条件（37，5%CO2，5%O2）、10.5%低氧条件（37 ，5%CO2，10.5%O2）、21%常 氧 条 件（37，5%CO2，21%O2）、42%高氧条件（37，5%CO2，42%O2）中培养观察细胞形态变化，每组设6 个复孔。1.4细胞增殖能力观察采用CCK-8法。各组分别于第0、24、48、72、96 h取出1块孔板，弃上清液，每孔加入10 L CCK-8，置于37、5%CO2培养箱孵育2 h，于450 nm处测定OD值。1.5细胞凋亡率检测采用流式细胞术。取各组培养72 h的贴壁细胞，加入0.25%EDTA胰酶消化细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS漂洗，用1 Binding Buffer将细胞重悬至1106/mL；转移100 L 细胞悬液（105个）至离心管，加入 5 L Annexin V-FITC和5 L PI混匀，室温避光孵育15 min。加入300 L 1 Binding Buffer，1 h 内上机检测。使用Flowjo软件分析流式结果，FITC为横坐标，PI为纵坐标。总凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。1.6细胞侵袭能力观察采用Transwell实验。取各组培养72 h的细胞，加入含10%FBS的完全培养基中。将 Matrigel胶预先用培养基稀释，取 200 L平铺于Transwell小室底部多聚碳酸膜上，37 干燥过夜。取 5104/孔细胞悬液 200 L 接种于 Transwell上室，500 L无血清培养基加入Transwell小室下室。置于培养箱中培养5 h，待细胞贴壁更换培养基，上室用PBS清洗后添加无血清培养基，下室添加含10%FBS完全培养基培养24 h。取出用甲醇固定10 min，0.4%结晶紫溶液染色20 min，PBS漂洗。封片，倒置相差显微镜（100）下观察，分别选取上下左右及中间5个视野计数，取平均值。1.7细胞 HIF-1 mRNA检测采用 qPCR法。取各组培养 72 h的细胞，用 TRIzol法提取总 RNA，逆转录合成cDNA。使用CFX96实时定量荧光PCR仪进行 qPCR 反应。引物序列：HIF-1 上游 5-AAACAGAGCAGGAAAAGGAG-3，下 游 5-TCAAAGCGACAGATAACACG-3；GAPDH 上 游 5-CCCAT45山东医药2023 年第 63 卷第 26 期CACCATCTTCCAGG-3，下 游 5-CATCACGCCACAGTTTCCC-3。反应条件：95 预变性 1 min；95 变性20 s，55 退火20 s，72 延伸30 s；共40个循环。以GAPDH为内参，采用2Ct法计算目的基因的相对表达量。1.8细胞 ROS 水平检测采用 DCFH-DA 荧光探针染色。用无血清培养液按照1 1 000稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 mol/L。取各组培养72 h的细胞，加入稀释的DCFH-DA，37 孵育20 min。用无血清细胞培养液洗涤3次，去除未进入细胞内的DCFH-DA。收集细胞后上流式细胞仪检测。1.9统计学方法采用SPSS22.0统计软件。计量资料采用 Shaprio-Wilk 法进行正态性检验，呈正态分布的数据以-x s 表示，多组间比较采用方差分析，重复测量资料采用重复测量方差分析，组间两两比较采用两独立样本t检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1各组细胞增殖情况比较随培养时间延长，各组 细 胞 均 有 不 同 程 度 的 增 殖 趋 势（F=18.651，P0.01）。与常氧组比较，极低氧组、低氧组、高氧组在 24、48、72、96 h 的增殖能力均降低（P 均0.05）；低氧组在48、72、96 h的增殖能力高于极低氧组和高氧组（P均0.05）。见表1。2.2各组细胞凋亡情况比较与常氧组比较，极低氧组、低氧组、高氧组细胞总凋亡率均升高；与低氧组比较，极低氧组和高氧组细胞总凋亡率升高（P均0.01）。见表2。2.3各组细胞侵袭能力比较极低氧组、低氧组、常氧组、高氧组细胞侵袭数量分别为（180 24）、（282 24）、（451 31）、（257 30）个。与常氧组比较，极低氧组、低氧组、高氧组细胞侵袭数量均减少（P均0.01）；与低氧组比较，极低氧组和高氧组细胞侵袭数量减少（P均0.05）。2.4各组细胞HIF-1 mRNA表达水平比较极低氧组、低氧组、常氧组、高氧组细胞HIF-1 mRNA表达水平分别为1.002 0.073、0.500 0.028、0.209 0.001、0.367 0.017。与常氧组比较，极低氧组、低氧组、高氧组细胞HIF-1 mRNA表达水平均升高（P均0.01）；与低氧组比较，极低氧组表达水平升高、高氧组表达水平降低（P0.05或0.01）。2.5各组细胞ROS水平比较极低氧组、低氧组、常氧组、高氧组DCF荧光强度分别为91.17 0.32、9.07 0.28、6.25 0.22、82.33 0.73。与常氧组比较，低氧组、极低氧组、高氧组中细胞ROS水平均升高（P均0.01）；与低氧组比较，极低氧组和高氧组细胞ROS水平升高，且极低氧组高于高氧组（P均0.01）。3 讨论 脑神经胶质瘤是人类中枢神经系统最常见的恶性肿瘤之一，目前其治疗以手术切除为主，辅以化疗和放疗等治疗。由于大脑对化疗分子耐药或敏感性差，脑神经胶质瘤预后不良，中位总生存期为14.4个月8。通过改变肿瘤细胞氧微环境，以HIF及其下游信号通路为治疗靶点，具有潜在的临床应用前景。氧是包括脑胶质瘤在内的各种细胞生长微环境的重要因素。研究发现，高压氧可抑制裸鼠皮下胶质瘤组织生长9；另有研究表明，高压氧可促进小鼠颅内移植神经胶质瘤模型中胶质瘤细胞的生长10。而微环境中氧浓度对胶质瘤细胞生长的影响尚缺乏深入研究。在胶质瘤生长和转移过程中，由于肿瘤细胞过度增殖，无法及时建立血管网，造成胶质瘤细胞生长处于缺氧且酸性物质积聚的微环境中11。低氧微环境下的肿瘤细胞可以通过改变代谢、增强侵袭和转移、激活耐药基因来提高适应性。缺氧微环境中细胞的增殖和凋亡与缺氧程度有一定的关联。涂芸琥等4研究表明，适度低氧微环表1各组不同时间点细胞增殖情况比较（-x s）组别极低氧组低氧组常氧组高氧组细胞OD值0 h0.372 0.3410.356 0.0200.367 0.0150.364 0.01724 h0.592 0.058*0.592 0.037*0.930 0.0530.612 0.033*48 h0.804 0.053*1.206 0.120*1.603 0.0970.938 0.046*72 h1.119 0.110*1.420 0.043*2.031 0.1641.169 0.117*96 h1.307 0.087*1.637 0.092*2.666 0.0631.390 0.097*注：与常氧组比较，*P0.01；与低氧组比较，P0.05。表2不同氧浓度下各组细胞的凋亡情况（%，-x s）组别极低氧组低氧组常氧组高氧组晚期凋亡率14.10 1.141.74 0.051.00 0.121.78 0.23早期凋亡率16.77 0.751.75 0.151.45 0.2120.37 1.26总凋亡率30.87 0.50*3.49 0.20*2.44 0.3122.15 1.17*注：与常氧组比较，*P0.01；与低氧组比较，P0.01。46山东医药2023 年第 63 卷第 26 期境可促进U251细胞体外生长。而严重低氧环境可诱导相关基因突变，细胞为了更好地适应环境，会启动相关的级联反应来诱导细胞凋亡12。本研究通过建立不同氧浓度微环境下的体外细胞培养模型，发现细胞在常氧下增殖能力最强，凋亡率最低，侵袭能力最强；而低氧（10.5%氧浓度）条件下较高氧、极低氧细胞生长状态更好、凋亡率更低、侵袭力更强；极低氧环境较低氧环境细胞凋亡率升高。这种低氧调控机制可能与HIF-1调控胶质瘤细胞生长相关性基因的表达有关。在缺氧条件下，HIF-1被激活并调控VEGF等转录因子诱导细胞增殖并刺激细胞发生侵袭，还负责维持未分化表型的肿瘤细胞13。研究发现，反复暴露于高压氧环境中可促进颅内神经胶质瘤细胞的增殖和血管生成，抑制细胞凋亡14。本研究结果显示，随着时间推移，高氧组细胞增殖能力较常氧组减弱；高氧组的总凋亡率、早期凋亡率和晚期凋亡率均升高，细胞更易凋亡；高氧组细胞侵袭数量较常氧组减少。以上结果提示，高氧处理胶质瘤细胞可以促进细胞凋亡并抑制其增殖和侵袭。胶质瘤组织内微血管密度的增加、微血管形态的改变往往在病理评估上表示恶性侵袭程度增加。STUHR等9报道，高氧环境能够抑制大鼠移植胶质瘤的生长，经高氧干预后，肿瘤中心平均血管密度明显降低，肿瘤血管直径显著减少，随之肿瘤的侵袭性也降低。LEE等15发现，胶质瘤细胞给予高氧处理后，细胞外调节蛋白激酶磷酸化水平下降，c-Jun氨基末端激酶（JNK）磷酸化水平上升，提示高氧可能通过JNK/ERK信号通路促进肿瘤细胞凋亡。有研究表明，高氧联合化疗可有效抑制胶质瘤干细胞增殖并促进凋亡，从而诱导其对化疗再敏感16，通过抑制胶质瘤干细胞中 ATP结合盒转运蛋白 G2、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶等化疗抗性相关蛋白的表达，提高胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性。YAHARA等17报道，对胶质母细胞瘤患者给予增强放疗+高氧治疗后，其2年平均生存率高于采取常规疗法的患者，提示高氧能够提高放疗对肿瘤的杀伤作用，从而改善患者预后。HIF-1是一种异二聚体蛋白，由亚基和氧调节的亚基组成。在常氧条件下，特定的脯氨酸羟化酶结构域蛋白以氧和-酮戊二酸为底物，合成HIF-1亚基。而在低氧环境下，缺氧通过激活 PI3K/AKT通路，抑制HIF-1翻译后羟基化反应或增加ROS的线粒体产生，从而提高HIF-1的稳定性，促进其与HIF-1的二聚化。这种二聚化决定了复合物的激活和与缺氧反应元件序列5-（A/G）CGTG-3的连续结合，从而增加转录，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡和耐药性等过程18-19。本研究结果显示，低氧组细胞ROS水平较极低氧组和高氧组明显降低；与低氧组比较，呈现极低氧组表达水平升高、高氧组表达水平降低两种变化趋势。这是由于高氧暴露往往改善微环境缺氧，通常增加HIF-1蛋白降解，导致HIF-1蛋白水平下降所导致。低氧肿瘤微环境可能与适度的ROS生成有关，而高水平的ROS可以干扰HIF-1调节过程。YOKOE等20研究表明，在缺氧时，HIF-1可以逃避pVHL的识别，从而稳定存在于缺氧环境中，并通过 PI3K 信号通路和缺氧激活的 PI3K/Akt/mTOR信号通路调节VEGF蛋白合成。也有研究认为，HIF-1磷酸化后也可诱导VEGF靶基因转录。VEGF过表达与其受体结合后激活信号转导，导致内皮细胞增殖、迁移和新生血管形成。新生血管可以为胶质瘤提供营养、氧气，排出代谢废物，并刺激胶质瘤生长，加速胶质瘤转移21。综上所述，胶质瘤细胞适合生存在正常氧浓度微环境中，极低氧和高氧微环境均不适合胶质瘤细胞生长；微环境氧浓度的改变可以引发ROS/HIF-1信号通路明显变化，从而影响胶质瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭能力。未来我们将进一步通过动物实验研究这些信号通路变化及其相互影响，为基于HIF的分子靶向治疗策略的研发提供依据。参考文献：1GOROJOD R M，PORTE ALCON S，DITTLER M L，et al.Nanohydroxyapatite exerts cytotoxic effects and prevents cellular proliferation and migration in glioma cells J.Toxicol Sci，2019，169（1）：34-42.2ALBERT I，HEFTI M，LUGINBUEHL V.Physiological oxygen concentration alters glioma cell malignancy and responsiveness to photodynamic therapy in 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