不同制备工艺的海带提取物对黄瓜幼苗促生长作用研究.pdf

doi:10.16446/j.fsti.20220300115 收稿日期:2022-03-15 作者简介:王鹏远(2001),女,本科在读,主要研究方向为海洋应用微生物。E-mail:wz110601 通信作者:王鹏(1980),男,教授,主要研究方向为海洋应用微生物。E-mail:pengwang 项目资助:山东省科技型中小企业创新能力提升工程项目(2021TSGC1298)。不同制备工艺的海带提取物对黄瓜幼苗促生长作用研究王鹏远1 赵帅2 李飞雨1 杜春影1 迟永洲1 沈照鹏1 王鹏1(1 中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003;2 青岛市生物药肥工程研究中心,山东青岛 266717)摘 要:为探究海藻源生物刺激剂的开发和生产,采用化学酸解法和生物酶解法制备海带提取物,探讨了不同制备工艺的海带提取物(质量浓度分别为 0.08、0.12、0.12、0.24 g/L)对黄瓜幼苗的促生长效果。试验结果显示,酸解海带提取物中的海藻酸、总蛋白、甘露醇和多酚含量均显著高于酶解海带提取物(P0.05)。与对照组相比,0.12、0.24 g/L 的酸解和酶解海带提取液对黄瓜幼苗的株高均有显著促进作用(P0.05),0.12 g/L 的酸解海带提取液和0.08 g/L 的酶解海带提取液可显著提高黄瓜幼苗的地上鲜质量(P0.05),0.08、0.12 g/L 的酸解提取物对根的鲜质量有显著促进作用(P0.05),0.12 g/L 的酸解和酶解海带提取液对根长均有显著促进作用(P0.05);0.24 g/L 和 0.12 g/L 的酸解和酶解海带提取液可显著提高黄瓜幼苗叶绿素、可溶性蛋白质、可溶性糖的含量(P0.05);酶解海带提取液能够显著提升黄瓜幼苗赤霉素(GA)和吲哚乙酸(IAA)的含量(P0.05),其中 0.08 g/L 酶解海带提取液处理组黄瓜幼苗的 IAA 和 GA含量分别提升了 69.6%和 75.8%。研究表明,两种制备工艺的海带提取物对黄瓜幼苗的促生长作用在不同指标方面各有差异。关键词:海带提取物;黄瓜;生物刺激;促生长 随着我国农业生产的发展,过度施用化肥带来的土壤板结退化、肥料利用率低和作物质量下降等问题逐渐凸显,严重制约着我国绿色农业和高质量农业的发展。探寻减肥提质的方法已成为当前趋势,环境友好型生物刺激剂已成为新的热点1,其中海藻源生物刺激剂约占全球生物刺激剂市场份额的三分之一2,受到广泛关注。褐藻是商业生产海藻提取物最常用的原料,包括海带、泡叶藻、马尾藻、巨藻等,其中海带在我国藻类养殖业中占有重要地位,2020 年我国海带总产量为165 万 t,占我国藻类总产量的 63%3,因此,是生物刺激剂的理想来源。对海带的高值化应用的研究表明,海带提取物的活性物质种类丰富,包括多糖、蛋白质、酚类化合物、植物激素等,这些物质通过单独或协同作用影响植物的生理生化反应,如促进植物生长和养分吸收,增强植物的抗胁迫能力,刺激叶绿素和植物激素的生物合成4,还可以重塑根系微生物群落结构、提高土壤的保水能力5。多糖是海带中最重要的成分之一,约占海带提取物干质量的 10%30%6。多糖能够促进植物生长,有研究表明,在黄瓜幼苗叶片喷施褐藻寡糖可有效促进幼苗的光合作用,提高其抗氧化酶的活力,进而提高黄瓜产量7。目前,在工业上广泛应用的海带提取物的制7632023,50(6)水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)备工艺有化学酸解法和生物酶解法。不同制备方法会影响提取物的成分和其生物刺激效果8。化学酸解法工艺简单,反应较彻底;生物酶解法工艺要求高,但产物活性高,二者各有优势9。本研究采用化学酸解法(简称酸法)和生物酶解法(简称酶法)分别制备海带提取物,分析其成分与结构表征,并比较和评价不同制备工艺的海带提取物对黄瓜幼苗生长参数和生化指标的影响,以期为海藻源生物刺激剂的开发和生产提供参考。1 材料和方法1.1 试验材料干海带购自山东寻山集团有限公司;黄瓜种子购自江苏南京金丰种苗有限公司;无水乙醇、磷酸氢二钠、氢氧化钾、苯酚、葡萄糖、氯化钾、浓硫酸等化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司,均为分析纯;褐藻胶裂解酶(1104 U/g)由中国海洋大学食品科学与工程学院应用微生物实验室提供;酶联免疫吸附试验试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司。1.2 试验方法1.2.1 海带提取物的制备酸解海带提取物(ALE):将干海带磨碎,称取150 g 海带粉添加到 1 L 硫酸溶液(体积分数为2%)中,室温下在 5 L 发酵罐中搅拌 20 min,然后迅速升温至 121,在 121、0.12 MPa 条件下持续反应 30 min,4 000 r/min 离心 10 min,用KOH 将所得上清液的 pH 调至 7.0,即获得酸解海带提取液10。酶解海带提取物(ELE):将干海带磨碎,称取150 g 海带粉溶于 2.25 L 超纯水中,缓慢加入缓冲溶液(柠檬酸-磷酸氢二钠)将 pH 调至 6.0,加入 0.03 g 褐藻胶裂解酶(1104 U/g),在 30 条件下在 5 L 发酵罐中保温酶解 3 h,4 000 r/min 离心 10 min 后 取 上 清 液,即 获 得 酶 解 海 带 提取液11。根据不同倍数梯度稀释的预试验结果的规律性和典型性,最终确定将两种海带提取物稀释至可溶性固形物含量分别为 0.08、0.12、0.24 g/L(即低、中、高浓度),用于后续试验。1.2.2 酸解和酶解海带提取物的组分分析将样品在马弗炉中 550 C 下煅烧 6 h,根据AOAC 法测定灰分含量12。以葡萄糖和牛血清白蛋白为标准品,分别用苯酚-硫酸法和福林酚法测定总糖和总蛋白质含量13。采用福林酚法测定总多酚含量14。采用间羟基联苯法测定海藻酸 含 量15。根 据 Chi 等12的 方 法,使 用TSK-GEL G4000 PWxl 色谱柱(7.8 mm30 cm,Tosoh,Shiba,Tokyo,JP)测定样品中多糖的分子量及其分布。1.2.3 植物培养将7 组(每组21 粒)黄瓜种子在25 无菌水中萌发 2 d 后,将其移入装有土壤的 21 孔穴盘中,并在光周期 16 8(即光照时长 16 h,黑暗时长 8 h)、温度为 25、相对湿度为 60%、照度为400 mol/(m2s)的环境中培养。8 d 后,对照组(CK)用 1 L 蒸馏水进行灌根处理。试验组中,3 组分别用 0.08 g/L(L-ALE)、0.12 g/L(M-ALE)、0.24 g/L(H-ALE)的酸解海带提取液各 1 L 进行灌根处理;另外 3 组分别用 0.08 g/L(L-ELE)、0.12 g/L(M-ELE)、0.24 g/L(H-ELE)的酶解海带提取液各 1 L 进行灌根处理。培养 16 d后(黄瓜幼苗展开第 3 功能叶),收集样品,用于评价指标的测定。1.2.4 黄瓜幼苗生长参数的测定测量每组黄瓜幼苗的表观生长参数,包括株高、根长、地上部分鲜质量和根部鲜质量。1.2.5 叶绿素含量的测定根据 Liu 等8的方法提取并测定叶绿素,取0.3 g 叶片在 5 mL 95%乙醇中匀浆,然后在室温下以 4 000 r/min 离心 10 min,上清液用 95%乙醇定容至 25 mL,并测量 649 nm 和 665 nm 处的吸光度。叶绿素 a 和叶绿素 b 含量的计算公式如下:叶绿素 a 含量=12.71A665-2.59A649(1)叶绿素 b 含量=22.88A649-4.67A665(2)式(1)(2)中:A649表示样品在 649 nm 处的吸光值,A665表示样品在 665 nm 处的吸光值。1.2.6 可溶性糖含量的测定根据 Zou 等16的方法提取叶片中的可溶性糖。取 0.3 g 叶片在 5 mL 蒸馏水中匀浆,然后在100 下加热 30 min,过滤后的滤液用蒸馏水定容至 25 mL,通过苯酚-硫酸法测定可溶性糖含量13。863水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)2023,50(6)1.2.7 可溶性蛋白含量的测定按照 He 等17的方法提取叶片中的可溶性蛋白质。取 0.3 g 叶片在 5 mL 水中匀浆,然后在室温下以 4 000 r/min 离心 10 min,所得上清液用磷酸盐缓冲液定容至 10 mL。以牛血清白蛋白为标准,用考马斯蓝在 595 nm 处测定上清液中的可溶性蛋白质含量13。1.2.8 植物激素含量的测定取 0.1 g 幼苗第 3 功能叶,在 0.9 mL 提取液(pH 为 7.4)中匀浆。在 4 下以 12 000g 离心15 min 后,通过酶联免疫吸附试验试剂盒测定上清液中的吲哚乙酸(IAA)和赤霉素(GA)的水平,相应 的 检 测 范 围 为 2 48 pmol/L 和 20 480 ng/L18。1.3 数据处理使用 Minitab 19 软件进行数据分析处理,采用单因素方差分析方法(one-way ANOVA)对处理组与对照组的数据进行显著性分析,设显著性水平为 0.05。采用 GraphPad 8.0.1 软件进行绘图制作。2 结果2.1 海带提取物组分分析酸解海带提取物(ALE)和酶解海带提取物(ELE)的化学组分见表 1。两种工艺获得的海带提取液中,以海藻酸为代表的多糖含量较高,不同工艺在有效物质的提取率方面有显著性差异,ALE 的海藻酸、总蛋白质、多酚和甘露醇的含量均显著高于 ELE(P0.05)。在多糖分子量方面,通过标准曲线计算得出,ALE 中多糖的重均分子量为4 209 Da,ELE 中多糖重均分子量为2 420 Da(见图 1)。表 1 酸解海带提取物(ALE)和酶解海带提取物(ELE)的组分分析成分/(mg mL-1)ALEELE可溶性固形物122.02.4a143.62.7a总糖14.150.30a15.911.67a海藻酸12.920.12a12.230.13b总蛋白质1.380.14a0.480.03b多酚1.390.03a0.170.01b甘露醇14.300.45a12.330.77b 注:同行数据上标字母不同表示处理间差异显著(P0.05)。图 1 多糖分子量标准曲线以及 ALE 和ELE 中多糖分子量分布2.2 不同工艺海带提取物对黄瓜幼苗生长指标的影响由表 2 可见,与对照组相比,中、高剂量的ALE 和 ELE 对黄瓜幼苗的株高均有显著增效(P0.05),分别提高了 35.0%、32.5%、15.0%和32.5%,其中,高剂量 ALE(H-ALE 组)作用效果最好;中剂量 ALE 和 ELE 对根系生长均有显著促进作用(P0.05);在鲜质量方面,中剂量 ALE 和低剂量 ELE 处理的黄瓜幼苗地上部分鲜质量显著增加,分别增加了 66.6%和 36.8%,低、中剂量ALE 对根部鲜质量有显著促进作用(P0.05)。表 2 ALE 和 ELE 对黄瓜幼苗表观生长指标的影响组别株高/cm根长/cm地上部分鲜质量/g根部鲜质量/gCK4.00.5c4.70.7c0.9270.260c0.0600.013cL-ALE4.20.8bc5.00.8bc1.0770.274bc0.0840.057abM-ALE5.31.0a5.41.0ab1.5440.408a0.0920.051aH-ALE5.40.7a5.10.8abc0.9100.213c0.0590.014cL-ELE4.10.8bc5.21.0abc1.2680.458b0.0590.015cM-ELE5.31.0a5.70.8a0.9210.274c0.0560.013cH-ELE4.61.0b5.10.7abc1.0310.297bc0.0640.014bc 注:同列数据上标字母不同表示处理间差异显著(P0.05)。2.3 不同工艺海带提取物对黄瓜幼苗叶绿素含量的影响由图 2 可见,与对照组相比,不同 ALE 和ELE 处理组黄瓜幼苗的叶片叶绿素 a 和叶绿素 b含量均显著增加(P0.05)。其中 ALE 3 个处理组黄瓜幼苗的叶绿素 a 含量分别提高了 20.3%、9.5%、22.5%,叶绿素 b 含量分别提高了 49.1%、31.5%、44.3%。9632023,50(6)水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)注:相同系列数据上标字母不同表示组间差异显著(P0.05)。图 2 ALE 和 ELE 对黄瓜幼苗叶绿素含量的影响2.4 不同工艺海带提取物对黄瓜幼苗可溶性糖含量的影响由图 3 可见,与对照组(CK)相比,中、高剂量ALE 和 ELE 组可溶性糖的含量均有显著提高(P0.05),其中,中剂量 ALE 处理组的可溶性糖含量最高,与对照组相比提高了 83.7%。注:数据上标字母不同表示有显著差异(P0.05)。图 3 ALE 和 ELE 对黄瓜幼苗可溶性糖含量的影响2.5 不同工艺海带提取物对黄瓜幼苗可溶性蛋白质含量的影响由图 4 可见,与对照组相比,ALE 和 ELE 均显著提高了黄瓜幼苗中的可溶性蛋白质含量(P0.05),其中,低剂量 ALE 的效果最好,可溶性蛋白质含量提高了 74.2%。中、高剂量的 ELE 比同剂量的 ALE 作用效果更为明显(P0.05)。注:数据上标无相同字母表示有显著差异(P0.05)。图4 ALE 和 ELE 对黄瓜幼苗可溶性蛋白质含量的影响2.6 不同工艺海带提取物对黄瓜幼苗植物激素含量的影响由图5可见,与对照组相比,各ELE处理组注:数据上标字母不同表示有显著差异(P0.05)。图 5 ALE 和 ELE 对黄瓜幼苗 GA 和 IAA 含量的影响073水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)2023,50(6)显著提升了黄瓜幼苗 GA 和 IAA 的含量(P 0.05),且作用效果均随着剂量的增大而减弱。低剂量 ELE 处理组对黄瓜幼苗 IAA 和 GA 含量的提升效果最佳,分别提升了 69.6%和 75.8%。3 讨论ALE 中降解多糖的分子量分布较宽,这可能是由于在酸解时糖苷键会随机断裂,共轭酸质子作用于环糖苷键,使碳氧离子键断裂并形成非还原基端,因此获得不均匀的多糖碎片9。ELE 中降解多糖的分子量呈现正态分布,所用的褐藻胶裂解酶能通过 消除作用于海带中褐藻胶的-1,4-糖苷键,并在产物非还原端 C4 和 C5 之间形成不饱和双键19,采用这种专一性酶解方式能够获得较为均一的多糖降解片段。整体来看,ALE 对黄瓜幼苗的促生长作用更为明显,这可能与褐藻多酚的作用有关。相关研究证明,将海藻多酚物质应用于玉米叶片的表面和根系,可显著改善玉米的生长指标参数,同时促进植株根、茎、叶的生长,增大叶片面积并提高叶片数及生物量20。本试验中,ALE 中的多酚含量显著高于 ELE,说明 ALE 的作用效果更优。叶绿素在光能吸收、转移和光化学电荷分离等方面发挥作用,叶绿素 a 和叶绿素 b 的含量、比例、分布可调控叶片的光合作用21。其中,ALE的作用效果优于 ELE,这可能与 ALE 中海藻酸和多酚含量更高有关。海藻酸和褐藻多酚已被证实对光合色素合成有积极影响。经海藻酸和多酚处理的烟草和甘蓝叶具有较高的叶绿素以及其他色素含量,为捕光色素蛋白复合物(LHCS)和光系统反应中心(PSRC)的合成提供了原料22。可溶性糖在植物体内可以作为能量物质提供植物生长所需的能量,可以作为信号分子调节内源酶的表达。糖信号与激素信号转导有一定的相互作用,是植物生长评价的重要指标23。研究发现,海藻酸通过上调部分光合作用的基因,增强作物光合作用或刺激酶合成等途径,促进了可溶性糖的积累23-24。据报道,植物光系统 PS反应中心只有叶绿素 a 的存在,因而光合作用与叶绿素a 含量关系非常密切,但过量的叶绿素积累会引起光氧化损伤25-27。本试验中,黄瓜幼苗中的叶绿素含量与可溶性糖含量有一定的相关性,ALE和 ELE 通过提升叶绿素含量促进了可溶性糖的积累,这种效应已在樱桃、葡萄、番茄、玉米等多种作物中得到证实20。可溶性蛋白质是植物中氮的主要形式,它在植物的生长发育中起着重要作用,是反映植物整体代谢状态的多种酶的重要组成部分28。已有研究表明,海藻提取物能够提高甜玉米对氮素的利用率,促进可溶性蛋白质积累,提高玉米产量29。据报道,海藻寡糖可提高植物体内硝酸还原酶、谷氨酸脱氢酶的活性,使更多的 NH4+转化成有机氮进入氮代谢循环,有利于蛋白质的积累10。GA 和 IAA 是调控植物生长发育的重要激素,对细胞的分裂、伸长和分化都有一定的作用,同时,IAA 有诱导调控维管束分化、调控根的分化形成、促进果实发育等功能30。褐藻提取物已经被证明用于植物中可以调节参与细胞分裂素、脱落酸和赤霉素生物合成的基因的表达,通过调节植物激素活性影响植物生长31。相关研究发现,富含分子量为 1.8 kDa 和 2.7 kDa 多糖的褐藻提取物能够提高黄瓜幼苗叶片中 GA 和 IAA 等植物激素的水平10。本试验中,ELE 中多糖分子量为2 420 Da,对植物激素合成有更好的促进作用。有研究表明,当 GA 质量浓度在 0200 mg/L 时,随着浓度的增加,GA 对黄瓜幼苗生长的促进作用增强,但当 GA 质量浓度在 200350 mg/L 时,随着浓度的增加,GA 对黄瓜幼苗生长的抑制作用增强;IAA 的作用同样具有两重性32。本试验中,ELE 更有利于植物激素合成,但 ALE 对黄瓜幼苗的促生长作用更优,原因可能是高浓度的植物激素对黄瓜幼苗的生长会起到抑制作用。4 结论不同工艺制备的海带提取液对黄瓜幼苗均有促生长作用,在不同指标方面的表现各异。在表观生长指标方面,ALE 表现出更好的促进作用,且中剂量 ALE 作用效果最佳。这可能与相关激素的两重性有关。在生化指标方面,ALE 对叶绿素含量的促进作用优于同剂量的 ELE,两种提取液均能提高可溶性蛋白质和可溶性糖的含量。ELE 组能显著提高黄瓜幼苗的 GA 和 IAA 含量,且低剂量的 ELE 生物刺激效果最佳,较对照组分1732023,50(6)水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)别提升了 69.6%和 75.8%。在实际的海带源生物刺激剂的开发和生产过程中,建议根据产品的不同用途选择合适的生产方式。参考文献1MOTESHAREZADEH B,VALIZADEH-RAD K,DADRASNIA A,et al.Trend of fertilizer application during the last three decades(Case study:America,Australia,Iran and Malaysia)J.Journal of Plant Nutrition,2017,40(4):532-542.2CHIAIESE P,CORRADO G,COLLA G,et al.Renewable sources of plant biostimulation:microalgae as a sustainable means to improve crop performanceJ.Frontiers in Plant Science,2018,9:1782.3杨春妹,杨锦,崔丹丹,等.海带酶解和菌解工艺优化及其降解产物对菜心抗逆性的影响J.植物营养与肥料学报,2021,27(8):1432-1444.4王学江,孙林,王乐兵,等.海藻提取物对内蒙古甜瓜产量和品质的影响J.分子植物育种,2022,20(16):5532-5537.5RENAUT S,MASSE J,NORRIE J P,et al.A commercial seaweed extract structured microbial communities 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prepared by chemical acid digestion and biological enzymatic digestion.The growth promotion effect of kelp extracts(concentration 0.08、0.12、0.24 g/L,respectively)with different prepara-tion processes on cucumber seedlings were studied.The results showed that the contents of alginic acid,total protein,mannitol and polyphenols in acid-dissolved kelp extract were significantly higher than those in enzymati-cally dissolved kelp extract(P0.05).Compared with the control group,0.12、0.24 g/L acid-dissolved and enzy-matically dissolved kelp extract had significant promoting effects on the plant height of cucumber seedlings(P0.05);0.12 g/L acid-dissolved kelp extract and 0.08 g/L enzymatically dissolved kelp extract significantly in-creased the aboveground fresh quality of cucumber seedlings(P0.05);0.08 g/L and 0.12 g/L acid-dissolved extract had a significant promoting effect on root fresh quality(P 0.05);and 0.12 g/L acid-dissolved and enzymatically dissolved extract had a significant promoting effect on root length(P 0.05).The content of chlorophyll,soluble protein,and soluble sugar of cucumber seedlings were significantly(P0.05)increased under the effects of 0.24 g/L and 0.12 g/L acidified and enzymatically digested kelp extracts.Enzymatic kelp extract significantly increased the content of gibberellin(GA)and indoleacetic acid(IAA)in cucumber seedlings,and the contents of IAA and GA of cucumber seedlings in the 0.08 g/L enzymatic kelp extract treatment group were increased by 69.6%and 75.8%,respectively.The study showed that two preparation processes of kelp extract had different growth promoting effects on cucumber seedlings in different indexes.Key words:extract of kelp;cucumber;biological stimulation;growth promotion3732023,50(6)水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)