不消化性葡聚糖体外酵解液对RAW 264.7巨噬细胞的免疫调节作用.pdf

食品研究与开发圆园23 年 10 月第 44 卷第 19 期DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2023.19.001基础研究基金项目：国家自然科学基金项目（31801539、32222065、31960464）；江西省高端领军人才培育项目（S2019GDQN2825、20204BCJ24006）；江西省技术创新引导类计划项目（20192AEI91004、20203AEI007）作者简介：张豪（1998），男（汉），硕士研究生，研究方向：功能食品发酵与益生菌资源开发。*通信作者：钟亚东（1984），女（汉），讲师，博士，研究方向：食品营养，肠道微生态。不消化性葡聚糖体外酵解液对RAW 264.7巨噬细胞的免疫调节作用张豪，钟亚东*，谢明勇（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）摘要：为探究不消化性葡聚糖（indigestible glucans，IGs）体外肠道菌酵解液的免疫调节活性，采用厌氧发酵模型利用健康人体粪便菌群分别对 6 种 IGs（大麦 茁-葡聚糖、海带多糖、酵母 茁-葡聚糖、茯苓多糖、抗性淀粉和聚葡萄糖）进行 24 h 体外酵解，除菌过滤获得 IGs 酵解液，对 pH 值和短链脂肪酸含量进行测定。并以 RAW 264.7 巨噬细胞为研究对象，分为正常组、阳性组和 IGs 酵解液组，采用 CCK-8 试剂盒测定细胞活力，一氧化氮（nitric oxide，NO）检测试剂盒测定细胞 NO 释放量，流式细胞仪检测细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量，酶联免疫吸附测定法测定细胞因子分泌量。结果表明，相比于正常组，6 种 IGs 的 24 h 酵解液均显著提高了 RAW 264.7 巨噬细胞活力、NO释放量、ROS 产生量和小鼠肿瘤坏死因子 琢 分泌量。各 IGs 24 h 肠道菌酵解液对 RAW 264.7 巨噬细胞均具有免疫调节的作用。关键词：不消化性葡聚糖；体外酵解；短链脂肪酸；RAW 264.7 巨噬细胞；免疫调节Immunomodulatory Effects of in vitro Fermentation Broths of Indigestible Glucans onRAW 264.7 MacrophagesZHANG Hao，ZHONG Yadong*，XIE Mingyong（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，Jiangxi，China）粤遭泽贼则葬糟贼：To investigate the immunomodulatory activity of intestinal bacterial in vitro fermentation broths ofindigestible glucans（IGs），six IGs（barley 茁-glucan，laminarin，yeast 茁-glucan，pachyman，resistant starch，and litesse）were fermented in vitro for 24 h by anaerobic fermentation model using healthy human fecalmicrobiota，and IG fermentation broths were obtained by sterile filtration.pH and short-chain fatty acid levelswere measured.RAW 264.7 macrophages were divided into normal，positive，and IG fermentation broth groups.Cell viability was determined with a CCK-8 kit，and levels of nitric oxide（NO），reactive oxygen species（ROS），and cytokines were analyzed using NO detection kit，flow cytometry，and enzyme-linked immunosorbent assay，respectively.The results suggested that compared with the normal group，all 24 h fermentation broths of six IGswere able to enhance the viability of RAW 264.7 macrophages，production of NO and ROS，and TNF-琢 release.The intestinal bacterial fermentation broth of each IG had the immunomodulatory ability on RAW 264.7macrophages.运藻赠 憎燥则凿泽：indigestible glucans；in vitro fermentation；short-chain fatty acids；RAW 264.7 macrophages；immunomodulation引文格式：张豪，钟亚东，谢明勇.不消化性葡聚糖体外酵解液对 RAW 264.7 巨噬细胞的免疫调节作用J.食品研究与开发，2023，44（19）：1-11.ZHANG Hao，ZHONG Yadong，XIE Mingyong.Immunomodulatory Effects of in vitro Fermentation Broths of IndigestibleGlucansonRAW264.7MacrophagesJ.Food Research and Development，2023，44（19）：1-11.1食品研究与开发圆园23 年 10 月第 44 卷第 19 期1.2仪器与设备Varioskan LUX 多功能酶标仪（微孔板检测仪）、CO2培养箱：美国 Thermo Scientific 公司；3k15 通用台式冷冻离心机：美国 Sigma 公司；CKX41 倒置显微镜：日本 Olympus 公司；CytoFLEXS 流式细胞仪：美国Beckman Coulter 公司；FE28-Standard 酸碱度测试仪（pH 计）：美国 Mettler toledo 公司；7890 B 气相色谱仪：美国 Agilent 公司。1.3试验方法1.3.1粪菌制备新鲜的粪便样品取自 3 位健康志愿者（2 女 1 男，2225 岁，无肠道疾病史），在厌氧手套箱内用含有0.1%的 L-半胱氨酸盐酸盐的 PBS 缓冲液以 1 颐 10（g/mL）比例进行稀释匀浆，经 100 滋m 细胞过滤器过滤，得到的过滤液用于接种。1.3.2体外酵解及产物处理体外酵解的培养基参考 Hughes 等14的方法配制。将 BG、BY、L、PAC、R 和 Lit 6 种 IGs 分别以 10%的质量分数溶于培养基中，另设置无碳水化合物添加的培养基为空白对照组（control，C），分装至亨盖特厌氧管中并灭菌。体外酵解时，制备的粪便菌液以 10%的体积分数接种到厌氧管内培养基中，使每管培养基终体积为 10 mL，厌氧酵解 24 h（37 益，150 r/min），在 0、24 h 时收集酵解液，离心 15 min（4 益，13 000 r/min），取上清液经 0.22 滋m 无菌滤膜过滤除菌后置于-80 益保存。不消化性多糖广泛存在于食物中，不能被人体消化酶降解，进入结肠后，在丰富的肠道微生物碳水化合物活性酶的作用下，糖苷键断裂，产生小分子的低聚糖或单糖，同时产生短链脂肪酸（short chain fatty acid，SCFAs）、乳酸等有益代谢产物1-3。肠道是人体最大的免疫器官，肠上皮细胞具有摄取免疫球蛋白、分泌细胞因子、提呈抗原等免疫功能，与肠组织中的突触细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等共同构建肠道免疫系统4-5。研究表明，多糖的结肠发酵引起的肠道微生物和 SCFAs 的组成、浓度变化会影响着肠道的上皮功能和免疫调节能力6-7。近年来，多糖的肠道免疫调节功能活性相关研究较多，例如，茯苓多糖能抑制高脂饮食下肠道巨噬细胞的凋亡，从而保护肠道屏障的完整性8。枸杞果实多糖能够修复肠道屏障来发挥抗糖尿病效果9。桑叶多糖能够改善小鼠受损的肠道屏障，通过调节肠道菌群组成和 SCFAs 的产生来发挥免疫调节作用10。大量研究表明不消化性葡聚糖（indigestible glucans，IGs）具有促进肠道益生菌的生长、改善肠道内环境，增强肠道免疫调节能力等作用11-12。然而，关于 IGs 在结肠中的酵解产物对肠道免疫调节作用的相关研究较少。多糖的体外肠道菌酵解是分析多糖在人体肠道中降解和活性作用的重要方法，同时为研究多糖的肠道酵解与人体免疫调节的关系提供了可靠方向。本研究以 RAW264.7 巨噬细胞为研究对象，以脂多糖（lipopolysaccha原rides，LPS）为阳性对照，探讨大麦 茁-葡聚糖（barley 茁-glucan，BG）、海带多糖（laminarin，L）、酵母 茁-葡聚糖（yeast 茁-glucan，BY）、茯苓多糖（pachyman，PAC）、抗性淀粉（resistant starch，R）和聚葡萄糖（litesse，Lit）体外酵解产物的免疫调节活性，以期为不消化性葡聚糖的肠道免疫研究和功能食品开发提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂脂多糖：美国 Sigma-Aldrich 公司；小鼠巨噬细胞系 RAW 264.7：中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；胎牛血清：以色列 Biological Industries 公司；达尔伯克（氏）改良伊格尔（氏）培养基（Dulbeccosmodified eagle medium，DMEM）（含双抗）、磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）：北京索莱宝科技有限公司；多粘菌素 B、一氧化氮检测试剂盒、活性氧检测试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；CCK-8试剂盒：美国 GlpBio 公司；小鼠肿瘤坏死因子 琢（tumornecrosis factor-琢，TNF-琢）试剂盒：江苏酶免实业有限公司。试验中所用 IGs 的详细信息13如表 1 所示。表 1IGs 的基本信息Table 1Detail information of IGsIGs分子量/kDa水溶性/%糖苷键类型公司和产品编码BG17997.780 5茁（1-3）&茁（1-4）爱尔兰 Megazyme 公司（cat no.P-BGBL）L4590.024 3茁（1-3）&茁（1-6）美国 Sigma Aldric 公司（cat no.L9634）BY20020.395 2茁（1-3）&茁（1-6）爱尔兰 Megazyme 公司（cat no.P-BGYST）PAC11402.768 7茁（1-3）爱尔兰 Megazyme 公司（cat no.P-PACHY）R4.935 2琢（1-4）&琢（1-6）美国 Ingredio 公司（Novelose 260）Lit3.293.185 7茁（1，2）,茁（1，3），茁（1，4）,茁（1，6）；主要为 茁（1，6）丹麦 Danisco 公司（Litesse）基础研究2食品研究与开发圆园23 年 10 月第 44 卷第 19 期1.3.3pH 值和 SCFAs 含量测定取适量酵解液测定其 pH 值。将酵解液离心 15 min（4 益，13 000 r/min），所得上清液过 0.22 滋m 水系滤头。取 0.6 mL 过膜后上清液加入 0.2 mL 的 10%硫酸涡旋1 min 酸化，0.4 mL 乙醚涡旋混匀，静止 2 min 后离心2min（4益，13000r/min），吸取乙醚层过 0.22滋m 有机滤膜后经气相色谱仪检测。采用火焰离子化检测器；色谱柱为熔融石英毛细管柱 HP-FFAP；色谱条件设置参考文献15。1.3.4CCK-8 测定细胞活力将细胞以 1伊105个/mL 的密度接种于 96 孔细胞培养板中，每孔 100 滋L DMEM 培养基（含 10%胎牛血清），在培养箱（37 益，5%CO2）中过夜培养后弃去旧培养基。设置正常组、阴性对照组、阳性组与样品组。正常组加入 100 滋L 含有 10%PBS 的完全培养基，阳性组加入 100 滋L 含有 1 滋g/mL LPS（溶剂为 PBS，以10%的体积比加入）的完全培养基，样品组加入 100 滋L 含有不同浓度的 IGs 或 IGs 酵解液的完全培养基，IGs 的终浓度为 0、25、50、100、200、400 滋g/mL（以完全培养基溶解和稀释），IGs 酵解液的终浓度为 0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100 滋L/mL（以 PBS 稀释后按体积分数 10%加入完全培养基中），阴性对照组只含有培养基、不含细胞。继续培养 24 h 后弃去旧培养基，所有孔均加入100 滋L 含有 10%CCK-8 溶液的培养基，避光培养 1 h后，用酶标仪测定 450 nm 处的吸光度。细胞活力计算公式如下。C=A1-A0A2-A0伊100式中：C 为巨噬细胞的细胞活力，%；A0为阴性对照组的吸光度；A1为样品组或阳性组吸光度；A2为正常组吸光度。1.3.5一氧化氮释放测定RAW 264.7 巨噬细胞的接种培养、分组和给药方式与 1.3.4 相同，给药 24 h 后收集细胞培养液，按照一氧化氮（nitric oxide，NO）测定试剂盒说明书进行测定。1.3.6流式细胞仪检测活性氧含量将 RAW 264.7 巨噬细胞以 5 个/mL 的细胞密度接种于 6 孔细胞培养板中，每孔 2 mL 培养基，在培养箱（37 益，5%CO2）中过夜培养后弃去旧培养基。根据分组，正常组加入 2 mL 含有 10%PBS 的完全培养基，LPS 组加入 2 mL 含有 1 滋g/mL LPS 的完全培养基，样品组加入 2 mL 含有不同浓度酵解液的完全培养基，酵解液的终浓度为 1、10、100 滋L/mL。继续培养 24 h，弃去旧培养基，用 PBS 冲洗，加入含有 10 滋mol/L 2，7-二氯荧光素二乙酸酯（2，7-dichlorodihydrofluoresceindiacetate，DCFH-DA）的无血清培养基（按照 1 颐 1 000的体积比用不含胎牛血清的DMEM培养基稀释DCFH-DA，得到终浓度为 10 滋mol/L 的 DCFH-DA），在 37 益避光孵育 30 min，然后除去培养基，避光用 PBS 洗两遍，细胞刮刀收集细胞，离心（1 000伊g、5 min），以500 滋L PBS 重悬细胞，流式细胞仪测定荧光强度，在Treestar FlowJo 10.6.2 软件中进行活性氧（reactive oxy原gen species，ROS）数据分析。1.3.7细胞因子检测RAW 264.7 巨噬细胞的接种培养、分组和给药方式与 1.3.6 相同，给药培养 24 h 后收集细胞培养液，按照小鼠 TNF-琢 试剂盒说明书进行测定。1.3.8内毒素分析设置 BG 酵解液组（终浓度为 1 滋L/mL）和 LPS 处理组（终浓度为 1 滋g/mL），两组分别加入多粘菌素 B（polymyxin B，PMB，100 滋g/mL）预处理 24 h。RAW264.7 巨噬细胞的接种培养和给药方式与 1.3.4 相同，给药 24 h 后收集细胞培养液进行 TNF-琢 测定。1.4数据处理使用 Graphpad prism 7.0 对试验结果进行作图分析。应用 mintab 19.0 统计软件对各组试验数据进行正态性检验，正态性分布的多组数据间进行单因素方差分析（ANOVA）和 Tukey 多重比较检验评估不同组间的差异，当 P0.05 时，认为其具有显著性差异。2结果分析2.1IGs 对 RAW 264.7 巨噬细胞活力的影响细胞活力的测定是评价药物对细胞生长影响作用的一种常用方法16，通过对样品处理后的巨噬细胞活性的检测可以评价样品的毒性和免疫增强能力。IGs 对 RAW 264.7 巨噬细胞活力的影响如图 1 所示。由图 1 可知，在 0400 滋g/mL 的浓度范围 6 种 IGs对 RAW 264.7 巨噬细胞处理后，相比于 0 滋g/mL 的正常组，细胞活力没有显著性地降低，而且除 R 外，BG 的400 滋g/mL、L 的 100400 滋g/mL、BY 的25400 滋g/mL、Lit 的 2050 滋g/mL 和 200400 滋g/mL 以及 PAC 的 25200滋g/mL 对 RAW 264.7 巨噬细胞活力有显著性地提150100500025400ICs 浓度/（滋g/mL）50100200aababababbA基础研究3食品研究与开发圆园23 年 10 月第 44 卷第 19 期高作用（P0.05）。表明 6 种 IGs 在浓度为 0400 滋g/mL时，对 RAW 264.7 巨噬细胞没有毒性作用。2.2IGs 酵解液的 pH 值和总 SCFAs 含量测定多糖在肠道中酵解产生大量 SCFAs，如乙酸、丙酸和丁酸等，是肠道酵解的重要代谢产物17。IGs 酵解液的 pH 值 和总 SCFAs 含量测定结果如图 2 所示。在本试验中总 SCFAs 含量为乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸和戊酸含量之和。由图 2 可知，经过 24 h的体外酵解，6 种 IGs 均显著性地降低了反应体系的pH 值（P0.05），表明酵解过程中产生了大量的酸性物质。与空白对照组相比，6 种 IGs 的酵解均显著提高了总 SCFAs 的含量（P0.05）。IGs 的体外酵解过程中 SCFAs 的产生与它们的理化性质有关，水溶性越高、糖链结构越简单的 IGs 的酵解速率越大，SCFAs 产量越高18-19。2.3IGs 酵解液对 RAW 264.7 巨噬细胞活力的影响IGs 酵解液对 RAW 264.7 巨噬细胞活力的影响如图 3 所示。由图 3 可知，与正常组相比，0、24 h 的 IGs 酵解液在 0.03100 滋L/mL 时不同程度地提高了 RAW 264.7巨噬细胞活力，且在一定范围内巨噬细胞活力与酵解液浓度呈依赖性增加。150100500025400ICs 浓度/（滋g/mL）50100200aabbcbcdcddB150100500025400ICs 浓度/（滋g/mL）50100200aabababbcC150100500025400ICs 浓度/（滋g/mL）50100200abaaaabD150100500025400ICs 浓度/（滋g/mL）50100200aaaaaaE150100500025400ICs 浓度/（滋g/mL）50100200aaabaabFA.BG；B.L；C.BY；D.PAC；E.R；F.Lit。不同小写字母表示差异显著，P0.05。图 1IGs 对 RAW 264.7 巨噬细胞活力的影响Fig.1Effect of IGs on viability of RAW 264.7 macrophages6.56.05.55.04.54.00时间/h24fedcdcbaLitRPACBYLBGCA100806040200CBGLitLBYPACacdcebBcRA.pH 值；B.总 SCFAs 含量。不同小写字母表示具有显著性差异，P0.05。图 2IGs 体外酵解 24 h 的 pH 值变化和总 SCFAs 含量Fig.2pH change and total SCFA concentration in IGsfermented for 24 h in vitro基础研究4食品研究与开发圆园23 年 10 月第 44 卷第 19 期250200150100500ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Acaabbccdddee200150100500ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）abababccdfdeefdeH200150100500ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Bbcaabcdededeee250200150100500ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）bdbabaacbceI200150100500ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Cbabbccddeeee200150100500ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）adcaabcababcbcdJ250200150100500ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Dbabbcddddd200150100500ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）aefbcabbcddeefffK250200150100500ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Eaaabcccdcdde200150100500ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）adbcabcddddL基础研究5食品研究与开发圆园23 年 10 月第 44 卷第 19 期当酵解 0 h 时，BG、L、BY、PAC 酵解液对细胞活力的最佳作用浓度与空白对照组一致，为 100 滋L/mL，R 和 Lit 则为 30 滋L/mL。酵解 24 h 时，IGs 酵解液和空白对照组的最佳作用浓度均比 0 h 酵解液组低，添加量较低时即出现活力抑制的现象。其中，前者为0.330 滋L/mL，后者为 1030 滋L/mL。由此可知，体外酵解提高了 IGs 对细胞活力的促进效果，且 IGs 酵解液效果比空白对照组更优。各 24 h 组在更高浓度（例如 BG 酵解液 30100 滋L/mL）作用时，其细胞活力均呈现下降趋势。这些变化可能是由于 24 h 酵解液中含有大量的 SCFAs 和多糖碎片，且这些代谢物在各组中的含量有所差异，在低添加量时显著促进细胞的增殖活性，而提高酵解液添加量时，SCFAs 含量增大、pH 值过低而抑制了RAW 264.7 巨噬细胞的正常生长20。2.4IGs 酵解液对 RAW 264.7 巨噬细胞释放 NO 的影响NO 的产生是巨噬细胞受到刺激活化的重要特征之一，与细胞的炎症反应紧密相关21。通过对 0 h 和24 h 各 IGs 酵解液组的细胞 NO 释放量进行测定，分析各组 IGs 在不同添加量下对细胞炎症反应的影响，结果如图 4 所示。由图 4 可知，与正常组相比，酵解 0 h 的各组与酵解 24 h 的空白对照组在各剂量下对 NO 释放量均无显著影响，而 24 h 的 IGs 酵解液剂量为 0.3100 滋L/mL时不同程度地促进了 NO 的释放，表明 IGs 在酵解 24 h200150100500ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Fcabcddeeeee200150100500ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）aMcdaaabbcdedeeff200150100500ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Gacdabbcdeeeee200150100500ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）NcedbcabaabcdeAG 分别为 C、BG、L、BY、PAC、R 和 Lit 组 0 h 发酵液处理；HN 分别为 C、BG、L、BY、PAC、R 和 Lit 组 24 h 发酵液处理。不同小写字母表示差异显著，P0.05。图 3IGs 酵解液对 RAW 264.7 巨噬细胞活力的影响Fig.3Effect of IG fermentation broths on viability of RAW 264.7 macrophages43210ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Habbbbbbbbb43210ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Aabbbbbbbbb基础研究6食品研究与开发圆园23 年 10 月第 44 卷第 19 期43210ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Babbbbbbbbb43210ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Cabbbbbbbbb86420ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Jefdebcabacdefgfggg43210ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Dabbbbbbbbb43210ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Kabcaacddeeedede43210ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Eabbbbbbbbb43210ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Labbcaabcdeeeede86420ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Fabbccccbcccc86420ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Mabaaabcccc6420ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Ibccdeabaacddefffdef基础研究7食品研究与开发圆园23 年 10 月第 44 卷第 19 期后能促进巨噬细胞的炎症反应。其中，对于酵解 24 h的 IGs 酵解液，BG 组在 330 滋L/mL，R 组和 L 组在110 滋L/mL，BY、PAC 组在 10100 滋L/mL 时、Lit 组在3100 滋L/mL，作用效果较强，且显著高于正常组（P0.05）。与细胞活力测定结果相似，当剂量进一步提高时，各 IGs 酵解 24 h 组 NO 释放量开始不同程度地下降，这可能是高浓度发酵液的 pH 值过低，导致细胞生长紊乱。另外，根据对 RAW 264.7 巨噬细胞活力和 NO 释放量的测定，确定了后续试验所用 24 h IG 酵解液的低、中、高剂量分别为 1、10、100 滋L/mL，并按照此浓度进行其他指标测定。2.5IGs 酵解液对 RAW 264.7 巨噬细胞 ROS 生成的影响ROS 是需氧细胞在生长过程中氧化反应的一类代谢产物，同时是重要的信号分子，参与维持细胞正常的生理机能22。本研究使用流式细胞术进行测定分析，DCFH-DA 荧光探针被细胞内 ROS 氧化为 DCF，产生绿色荧光，DCF 荧光强度越强，则细胞内 ROS 含量越高。IGs 酵解液对 RAW 264.7 巨噬细胞 ROS 生成的影响如图 5 所示。图 5 表明，相比于正常组，BG、R、Lit和 L组的各浓度均能够显著性地促进细胞 ROS的产生（P0.05），且前三者呈浓度依赖性增加，而 L 酵解液剂量为 10 滋L/mL时 ROS 的产量最高。BY 和 PAC 酵解液剂量为 10、100 滋L/mL 时，能够显著性地促进细胞 ROS 的产生（P0.05），且在 100 滋L/mL 时，PAC 组的 ROS 产量远高于其余 IGs 组。表明各组 IGs 酵解液均具有刺激细胞生成 ROS 的能力，其能力的差异可能与酵解产物的组成有关。6420ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）Gabbbbbbbbb6420ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）NabaabcccccAG 分别为 C、BG、L、BY、PAC、R 和 Lit 组 0 h 发酵液处理；HN 分别为 C、BG、L、BY、PAC、R 和 Lit 组 24 h 发酵液处理。不同小写字母表示差异显著，P0.05。图 4IGs 酵解液对 RAW 264.7 巨噬细胞释放 NO 的影响Fig.4Effect of IG fermentation broths on NO release from RAW 264.7 macrophages60 00040 00020 0000ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）B正常组LPS110100bbabc80 00060 00040 00020 0000ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）A正常组LPS110100cabcd100 00080 00060 00040 00020 0000ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）D正常组LPS110100babcc80 00060 00040 00020 0000ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）C正常组LPS110100cabdd基础研究8食品研究与开发圆园23 年 10 月第 44 卷第 19 期2.6IGs 酵解液对 RAW 264.7 巨噬细胞释放 TNF-琢的影响细胞因子是机体细胞和体液免疫反应过程中重要的信号分子，巨噬细胞被激活后能够产生大量的细胞因子，如 酌 干扰素（interferon-酌，IFN-酌）、白介素-4（interleukin，IL-4）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis fac原tor，TNF）和白介素-10（interleukin-10，IL-10）等，参与免疫功能的调控23。TNF-琢 是机体重要的炎症介质，由巨噬细胞和淋巴细胞分泌，参与人体的炎症反应和免疫反应。IGs 酵解液对 RAW 264.7 巨噬细胞释放 TNF-琢 的影响如图 6 所示。由图 6 可知，与正常组相比，除 100 滋L/mL 的 BY酵解液对 TNF-琢 没有显著影响外，各 IG 酵解液在各浓度均显著性地提高了 TNF-琢 释放量（P0.05）。表明各 IG 酵解液均能显著性地激活巨噬细胞，使其 TNF-琢 的分泌量提高。2.7酵解液中内毒素的影响分析PMB 是一种能与 LPS 特异性结合的抗生素，使LPS 不能诱导巨噬细胞活化为 M 1 型，抑制 LPS 对巨噬细胞的促炎作用24。IGs 的肠道菌体外发酵液上清中可能含有细菌 LPS，在本试验中以 BG 酵解液为例，使用 PMB 预处理来排除酵解液中 LPS 的作用。已知1 滋g/mL 的 LPS 和 1 滋L/mL 的 BG 酵解液给药处理对巨噬细胞 TNF-琢 分泌的作用效果相似，对 LPS 和 BG酵解液组同时进行 PMB 预处理，结果如图 7 所示。由图 7 可知，经 PMB 处理后，LPS 组的 TNF-琢 释40 00030 00020 00010 0000ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）F正常组LPS110100cabcd40 00030 00020 00010 0000ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）E正常组LPS110100babcdA.BG；B.L；C.BY；D.PAC；E.R；F.Lit。不同小写字母表示具有显著性差异，P0.05。图 5IGs 的 24 h 酵解液对 RAW 264.7 巨噬细胞 ROS 生成的影响Fig.5Effect of 24 h fermentation broths of IGs on ROS production from RAW 264.7 macrophages1 5001 0005000ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）D正常组LPS110100abccd1 5001 0005000ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）C正常组LPS110100bcaabc1 5001 0005000ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）B正常组LPS110100abbac1 5001 0005000ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）A正常组LPS110100abcbad基础研究9食品研究与开发圆园23 年 10 月第 44 卷第 19 期1 5001 0005000ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）F正常组LPS110100abbacab1 5001 0005000ICs 酶解液浓度/（滋L/mL）E正常组LPS110100abbacaA.BG；B.L；C.BY；D.PAC；E.R；F.Lit。不同小写字母表示具有显著性差异，P0.05。图 6IGs 的 24 h 酵解液对 RAW 264.7 巨噬细胞释放 TNF-琢 的影响Fig.6Effect of 24 h fermentation broths of IGs on TNF-琢 release from RAW 264.7 macrophages1 5001 0005000正常组BGPMB+LPSLPSPMB+BGabcbcaa不同小写字母表示具有显著性差异，P0.05。图 7PMB 预处理对巨噬细胞 TNF-琢 释放量的影响Fig.7Effect of PMB pretreatment on TNF-琢 release frommacrophages放量显著性下降（P0.05），而 BG 组变化不显著，表明IGs 的 24 h 酵解液促进 RAW 264.7 巨噬细胞炎症反应表达的主要成分是其他酵解产物而不是来自肠道菌裂解的 LPS。3结论以 RAW 264.7 巨噬细胞为研究对象，分析 IGs 体外肠道菌酵解液的免疫调节作用。结果表明，6 种 IGs对细胞没有毒性作用，在肠道菌的酵解过程中产生了大量的 SCFAs。IGs 的 24 h 发酵液都显著提高了细胞免疫调节活性，能够提高 RAW 264.7 巨噬细胞的细胞活力，促进细胞 NO 的释放、ROS 的产生和 TNF-琢 的分泌。此外，PMB 的处理结果表明，IGs 的酵解产物而不是肠道菌结构成分 LPS 促进了巨噬细胞的 TNF-琢 的分泌。本研究为 IGs 在肠道酵解的免疫调节研究提供理论参考，同时为 IGs 的相关产品的开发提供依据。参考文献：1SINGH R P,RAJARAMMOHAN S,THAKUR R,et al.Linear andbranched 茁-glucans degrading enzymes from versatile Bacteroidesuniformis JCM 13288Tand their roles in cooperation with gut bacte原riaJ.Gut Microbes,2020,12(1):1-18.2王如月,余讯,徐静静,等.燕麦 茁-葡聚糖及其寡糖对肠道菌群结构和代谢的影响J.食品与发酵工业,2020,46(11):85-91,97.WANG Ruyue,YU Xun,XU Jingjing,et al.Effects of oat 茁-glucanand its oligosaccharides on composition and metabolism of intestinalmicroorganismsJ.Food and Fermentation Industries,2020,46(11):85-91,97.3FAN L,ZUO S,TAN H,et al.Preventive effects of pectin with vari原ous degrees of esterification on ulcerative colitis in miceJ.Food&Function,2020,11(4):2886-2897.4李伟,陈庆森.肠道黏膜免疫屏障及其菌群与机体健康关系的研究进展J.食品科学,2008,29(10):649-655.LI Wei,CHEN Qingsen.Research progress of relationship of humanhealth with intestinal mucosal immunity and microfloraJ.Food Sci原ence,2008,29(10):649-655.5UEKI T,MIZUNO M,UESU T,et al.Expression of ICAM-I on Mcells covering isolated lymphoid follicles of the human colon J.Acta Medica Okayama,1995,49(3):145-151.6R魻SCH C,TAVERNE N,VENEMA K,et 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