超声法辅助提取内蒙古甘草多糖工艺及其抗氧化活性研究.pdf

ProcessTechnologydoi:10.16736/41-1434/ts.2023.16.028工艺技术超声法辅助提取内蒙古甘草多糖工艺及其抗氧化活性研究Ultrasound Assisted Extraction Process and Antioxidant Activity of Polysaccharides from InnerMongolia Licorice董巍，王文豹，王晓丽，付双，野津（齐齐哈尔医学院药学院，黑龙江齐齐哈尔16 10 0 6）DONG Wei,WANG Wenbao,WANG Xiaoli,FU Shuang,YE Jin(Qiqihar Medical University,College of Pharmacy,Qiqihar161006,China)摘要：为了探究内蒙古甘草多糖的提取工艺和抗氧化活性，本研究采用超声法辅助提取甘草多糖，对料液比、超声温度、超声时间、提取次数进行单因素考察及正交设计优化。抗氧化结果表明，内蒙古甘草多糖具有良好的抗氧化能力，抗氧化能力与其浓度成正比。因此，本研究为内蒙古甘草资源的深入系统开发提供理论基础。关键词：甘草；多糖；超声辅助提取；正交设计；抗氧化活性Abstract:In order to explore the extraction process and antioxidant activity of glycyrrhiza uralensis polysaccharidesin Inner Mongolia,this study assisted the extraction of glycyrrhiza uralensis polysaccharides using ultrasound.Single factoranalysis and orthogonal design optimization were conducted on the solid-liquid ratio,ultrasound temperature,ultrasound time,and extraction frequency.The antioxidant results indicate that Inner Mongolia licorice polysaccharides have good antioxidantcapacity,which is directly proportional to their concentration.Therefore,this study provides a theoretical basis for the in-depth and systematic development of licorice resources in Inner Mongolia.Keywords:licorice;polysaccharide;ultrasonic assisted extraction;orthogonal design;antioxidant activity中图分类号：0 6 2 9.1甘草是我国传统的“药食同源”中草药，为豆科植物甘草（Glycyrrhizauralensis Fisch.）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）或光果甘草（GlycyrrhizaglabraL.）的干燥根和根茎，具有补脾益气、清热解毒、基金项目：齐齐哈尔市科技计划联合引导项目（LHYD-2021026）。作者简介：董巍（198 3一），女，博士，副教授，研究方向为中药药效物质基础。通信作者：野津（198 6 一），女，博士，助理研究员，研究方向为天然药物成分的提取分离和活性研究。E-mail:。XIANDAISHIPIN现代食品/91工艺技术Process Technology祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药功效。由于甘草味甜，气味芳香，常常作为食品调味料出现在多种烹饪方法中。现代研究表明，多糖作为甘草的主要活性成分之一，具有多种药理学活性，表现为免疫调节、抗炎、抗病毒、抗氧化、降血糖、抑制肿瘤生长等方面2-。内蒙古作为甘草的重要产区之一,其具有品质优、产量大、分布广等特点，如何将内蒙古甘草多糖进行合理的开发，对其提取工艺的研究及应用价值的发挥至关重要，因而备受学者们的关注。对于植物多糖的提取方法有很多种8，包括水溶剂提取法19-10 1、酶提取法、微波提取法2、超临界流体萃取法13、超声辅助提取法14等。上述提取方法各有特点，溶剂提取法使用溶剂水作为溶媒，这种方法耗时较长、温度较高、提取效率较低。酶提取法采用复合酶，由于酶对温度要求较高，一旦温度条件发生改变，在实验过程中容易失活，导致多糖的结构被破坏。近年，超临界流体萃取法被作为提取多糖的新兴方法，原理是利用流体兼有液体和气体的特点，对很多物质有很好的溶解能力，但是其设备复杂，运行成本高。超声波辅助提取法，主要基于超声波的特点，由于其具有机械效应、空化效应和热效应，将多糖快速溶解于溶剂中，促进有效成分的溶出，反应在室温中进行，能够有效节约能源。本研究针对甘草多糖提取工艺进行探讨，主要采用超声辅助提取方式，先对单因素进行考察筛选，再利用正交设计进行整体优化，获得最佳工艺条件，以期为其在食品、保健品等领域的应用提供理论依据。1材料与方法1.1材料与仪器1.1.1药材甘草采购于哈尔滨市三棵树中药材市场，经齐齐哈尔医学院董巍副教授鉴定为豆科植物甘草的干燥根和根茎。1.1.2试剂无水乙醇：天津市天力化学试剂有限公司；无水葡萄糖：天津市科密欧化学试剂有限公司；硫酸：成都市科隆化学品有限公司；铁氰化钾：天津市大茂化学试剂厂；三氯乙酸：天津市大茂化学试剂厂；三氯化铁：天津市大茂化学试剂厂；磷酸氢二钠：苏州诚杰精细化工有限公司；磷酸二氢钠：苏州博格瑞化工科技有限公司。1.1.33仪器T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用有限责任公司；FA2004B电子天平：上海佑科仪器仪表有限公司；GZX-9146MBE电热鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LG16-W离心机：北京医用离心机厂；KQ-600V型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；SPARK多功能酶标仪：TECAN/帝肯。1.2方法1.2.1甘草多糖的提取称取适量甘草，粉碎过筛，加人适量的水进行超声提取，超声结束，经过除蛋白后，加人无水乙醇使其浓度在8 0%以上，4醇沉2 4h。将醇沉后的溶液离心，获得甘草多糖。1.2.2甘草多糖的含量测定甘草多糖的含量测定采用苯酚硫酸法，绘制葡萄糖标准曲线，精密称取经干燥后处理的葡萄糖对照品50 mg，并定容至50 mL容量瓶中混匀，然后从其中量取5mL，定容至50 mL容量瓶中，摇匀，即得0.1mg/mL标准溶液。精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4m L溶液，分别加人现配制5%苯酚溶液1mL，并立即向其中加人浓硫酸5mL，45水浴15min，以49 0 nm测定吸光度，以葡萄糖溶液浓度C横坐标，吸光度A为纵坐标绘制曲线，回归方程为Y=54.914X+0.0018，相关系数R=0.9992。称取甘草多糖粉末0.0 3g，定容至2 50 mL容量瓶中，然后从中精密量取1mL溶液加入10 mL的具塞试管中，分别加入1mL蒸馏水、5%苯酚溶液（现配现用）1mL和5mL浓硫酸溶液，立即摇匀，45水浴15min，在波长490 nm处测定吸光度。按照公式（1）计算甘草多糖的提取率。甘草多糖提取率=（CVD）C式中，C为内蒙古甘草多糖样品的浓度（g/mL），V为甘草多糖样品的体积（mL），D 为稀释倍数。1.3单因素试验1.3.1 米料液比对甘草多糖提取率的影响称取4份甘草粉末，每份各10 g，分别考察4个水平料液比1：10、1：15、1：2 0、1：2 5，超声温度为40，超声时间为30 min，提取次数为1次，对甘草多糖提取率的影响。(1)92/现代食品XIANDAISHIPINProcessTechnology工艺技术1.3.2超声温度对甘草多糖提取率的影响称取4份甘草粉末，每份各10 g，分别考察超声温度30、40、50、6 0 4个水平，超声时间30 min，提取次数为1次，料液比为1：2 5，对甘草多糖提取率的影响。1.3.3超声时间对甘草多糖提取率的影响称取4份甘草粉末，每份各10 g，分别考察超声时间2 0、30、40、50 min4个水平，超声温度6 0，提取次数为1次，料液比为1：2 5，对甘草多糖提取率的影响。1.3.4超声次数对甘草多糖提取率的影响称取4份甘草粉末，每份各10 g，分别考察超声次数1次、2 次、3次、4次4个水平，料液比为1：2 5，超声温度条件设置在6 0，超声时间设定在30min，对甘草多糖提取率的影响。1.4正交设计试验以料液比（A）、超声温度（B）、超声时间（C）、超声次数（D）为筛选因素，采用四因素三水平，以甘草多糖的提取率为衡量指标，设计正交试验L（34）对甘草多糖的超声提取工艺进行优化。正交因素水平见表1。表1正交因素水平表A料液比B超声温度C超声时间因素水平D超声次数(g/mL)()11:1521:2031.:251.5甘草多糖的抗氧化活性研究采用普鲁士兰法5。分别精密吸取各组分浓度为0.16、0.31、0.6 3、1.2 5、2.5mg/mL的多糖及溶液2 mL，向其加人0.2 mol/LpH为6.8 的磷酸盐缓冲液1mL和1%铁氰化钾溶液1mL，混匀后在水浴50 加热2 0 min，冷却，加人10%三氯乙酸溶液1mL，混匀后吸取1mL溶液于比色管中，加蒸馏水1mL和0.1%氯化铁溶液0.5mL，反应10 min后在波长7 0 0 nm处测定吸光值。1.6数据处理采用Excel分析数据并制图，SPSS25.0设计正交试验。2丝结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1料液比对甘草多糖提取率的影响料液比对甘草多糖的提取率作用程度见图1，甘草多糖的提取率随着料液比的降低，多糖提取率呈现整体上升的趋势，当料液比为1：2 5时，甘草多糖的提取率最高。开始料液比1：10 时，多糖提取率较低，随着料液比为1：2 0，反应体系中随着溶剂的增加，甘草多糖的提取效果越来越显著，当料液比1：2 5时，反应体系中多糖溶出达到最大程度，多糖提取率最高。0.450.40.35（%）率军0.30.250.20.150.10.050图1料液比对甘草多糖提取率的影响图2.1.2走超声温度对甘草多糖提取率的影响超声温度对甘草多糖提取率影响结果如图2 所示。从图中可以看出甘草多糖提取率明显增加的趋势，当(min)超声温度设置为30 时，甘草多糖提取率为1.0 2%；4020503060401:101次当超声温度设置为40，多糖提取率为1.43%；当超2次声温度设置为6 0 时，多糖的提取率大幅度提高，达3次到2.54%。超声温度的提高，促进了多糖分子的运动，极大地促进多糖的溶出速度,因而多糖的提取率较大。但是，对于超声温度也要进行严格控制，温度过高会破坏多糖结构。2.5%21.510.50图2 走超声温度对甘草多糖提取率的影响图1:15料液比(g/mL)3040超声温度/1:20501:2560XIANDAISHIPIN现代食品/93工艺技术Process Technology2.1.3走超声时间对甘草多糖提取率的影响超声时间对甘草多糖提取率影响结果如图3所示。超声时间的不同，甘草多糖的提取率也会不同，甘草多糖整体呈现提取率先增大后减小。当超声时间设置为2 0 min，多糖的提取率较低；当超声时间设置为30 min，多糖的提取率达到10.0 2%；当超声时间设置为40 min时，多糖的提取率下降。出现这种情况的原因是由于超声的机械效应较强，强烈的振动破坏甘草多糖的原有结构。1210%/本8642020 min图3超声时间对甘草多糖提取率的影响图2.1.4走超声次数对甘草多糖提取率的影响超声次数对甘草多糖提取率的影响结果如图4所示。甘草多糖的提取率随着提取次数的增加，多糖提取率不断增加。当提取次数为3次，多糖的提取率最大，试验号123456789KK2K3R从表2 中R值可知，对于甘草多糖提取率的影响程度分别是：超声次数、超声时间、超声温度、料液比，说明超声次数对甘草多糖提取率的影响最大，其次是超声时间、超声温度，料液比对甘草多糖提取率的影达到10.2 4%；当提取次数为1次，甘草多糖溶出较低。随着提取次数的增加，多糖溶出有增加，但是小幅度增加，当提取次数达到3次时，多糖的提取率增加最多，但是当提取次数为4次，多糖的提取率下降，可能由于超声的强大机械振动促使多糖的结构被破坏，提取率下降。12一10%率642030 min40min超声时间/minA（料液比）B（超声温度）/C（超声时间）/min1:15401:15501:15601：2201：201：2201：251:251;254.517.075.332.561次50 min图4提取次数对多糖提取率的影响图2.2正交试验结果根据单因素考察的结果，确定以料液比（A）、超声温度（B）、超声时间（C）、超声次数（D）为试验因素，采用四因素三水平，以甘草多糖的提取率为衡量指标，确定甘草多糖的最佳提取工艺。试验结果见表2。表2 正交设计试验结果表20n30404030504060204040502060305.625.204.37.266.984.442.682.82响最小，最佳超声提取工艺条件是A,B,C2D3，这与正交试验中提取率最高的组别不一致，因此进行验证试验。根据最佳超声提取工艺条件进行验证，按照最佳工艺条件AB,C,D3，即料液比1：2 0，超声温度6 0，2次提取次数/次D（超声次数）提取率1%13.0223.9136.59310.6213.5027.1023.2335.4917.264.594.757.572.983次4次94/现代食品XIANDAISHIPINProcessTechnology工艺技术10赵云生，姚海花，王其林，等.乌拉尔甘草多糖提取工艺优化研究J.辽宁中医杂志，2 0 13，40（3）：超声时间30 min，超声次数3次。进行3次重复性试验，多糖的提取率分别为11.48%、11.6 7%、12.0 4%，三者均高于正交设计，说明通过正交设计筛选出来的工艺条件为最佳工艺条件。验证试验结果见表3。表3验证试验结果表实验号提取率（%)111.48211.67312.042.3甘草多糖的抗氧化活性结果结果如图5所示。随着浓度的升高，甘草多糖的抗氧化能力越来越强，并与其浓度呈正相关。当浓度为2.5mg/mL时，抗氧化能力达到最强。0.500.400.30B0.200.100.000.00图5不同浓度甘草多糖对铁离子还原能力测定效果图3结语本试验首先探索单因素提取条件，然后结合正交设计确定超声辅助提取甘草多糖的工艺条件，即料液比1：2 0，超声温度6 0，超声时间30 min，超声次数3次，甘草多糖的提取率为11.7 3%。同时，初步探索了其抗氧化活性，试验证明甘草多糖具有一定的抗氧化活性。综上所述，本研究对甘草多糖提取工艺方法进行优化，并对抗氧化活性进行初步探索，以期为甘草多糖的合理利用和科学开发奠定基础。参考文献1国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部M.北京：中国医药科技出版社，2 0 2 0.2中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第42 卷M.北京：科学出版社，2 0 0 4.3王晴，洪叶，柳振宇，等.甘草多糖的抗氧化及降血糖作用研究J.食品工业科技，2 0 2 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