超声辅助双水相提取蓝莓花色苷工艺优化及其抗肿瘤活性研究.pdf

182023年第9期中国食品添加剂China Food Additives着色剂专栏收稿日期：2022-10-12基金项目：山西省高等学校科技创新项目（2019L1012）；山西药科职业学院教科研课题（2022101）。作者简介：杨兆艳（1981-），女，硕士研究生，研究方向：食品功能性活性成分。*通信作者：卢洪秀（1982-），男，硕士研究生，研究方向：农业环境保护。超声辅助双水相提取蓝莓花色苷工艺优化 及其抗肿瘤活性研究杨兆艳1，田艳花1，卢洪秀2，*（1.山西药科职业学院食品工程系，太原 030031；2.上海农林职业技术学院生物医药与健康系，上海 201600）摘 要：采用超声辅助双水相提取蓝莓花色苷，通过单因素实验和正交实验确定最佳的提取工艺；采用MTT 法测定蓝莓花色苷提取物（Blueberry anthocyanins extracts，BAEs）对 HepG2 细胞存活率的影响；利用Hoechst 33342 对 HepG2 细胞进行染色，通过激光共聚焦显微镜观察细胞形态；采用流式细胞分析仪测定不同浓度 BAEs 对 HepG2 细胞凋亡率和胞内 ROS 水平的影响。结果表明超声辅助双水相提取蓝莓花色苷最优工艺条件为：超声功率 300 W、乙醇体积分数 24%、硫酸铵质量分数 18%、料液比（130）g/mL 和提取时间 60 min。在此条件下，花色苷得率为（2.140.05）mg/g。此外，BAEs 可显著抑制 HepG2 细胞存活率、提高细胞核的荧光强度、细胞凋亡率和胞内 ROS 水平，进而发挥较好的抗肿瘤活性。本研究结果为花色苷提取提供一种具有发展潜力的提取方式，并为天然抗肿瘤药物的开发提供重要的物质基础。关键词：超声辅助双水相提取；蓝莓；花色苷；工艺；抗肿瘤活性中图分类号：TS202.1 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2023）09-0018-09doi：10.19804/j.issn1006-2513.2023.09.003Optimization of ultrasound assisted aqueous two-phase extraction of anthocyanins from blueberry and its antitumor activityYANG Zhaoyan1，TIAN Yanhua1，LU Hongxiu2，*（1.Food Engineering Department of Shanxi Pharmaceutical Vocational College,Taiyuan 030031；2.Department of Biomedicine and Health，Shanghai Vocational College of Agriculture and Forestry，Shanghai 201600）Abstract：Anthocyanins from blueberry were extracted by ultrasound assisted aqueous two-phase extraction method.The single factor and orthogonal experiments were applied to optimize the extraction process.The MTT assay was used to evaluate the effect of blueberry anthocyanins extracts（BAEs）on the survival rate of HepG2 cells.HepG2 cells were stained with Hoechst 33342 and observed by laser confocal microscope.The effects of different concentrations of BAEs on the apoptosis rate in HepG2 cells and ROS levels were determined by flow cytometry.It was found that the optimum extraction conditions were：ultrasound power 300 W，ethanol concentration 24%，ammonium sulfate mass fraction 18%，material to liquid ratio（130）g/mL，and extraction time 60 min.Under these conditions，the yield of 192023年第9期中国食品添加剂China Food Additives着色剂专栏anthocyanins was（2.140.05）mg/g.In addition，BAEs could significantly inhibit the survival rate of HepG2 cells，improve fluorescence intensity of the nucleus，the rate of apoptosis and the levels of intracellular ROS.Therefore，it had antitumor activity.The results provide a potential method for anthocyanin extraction and an important reference for the development of natural antitumor drugs.Key words：ultrasound assisted aqueous two-phase；blueberry；anthocyanins；process；antitumor activity蓝莓属于杜鹃花科的越桔属，呈现诱人的蓝色，具有较高的医学和营养价值，主要种植在美国、俄罗斯、意大利、日本和我国的东北及新疆地区1。大量研究表明蓝莓中富含花色苷、多酚、蛋白、多糖、维生素和各种氨基酸等活性成分，深受广大消费者的喜爱2-3。目前，蓝莓花色苷作为天然营养素被用于药品、保健品和化妆品等领域中。大量研究表明花色苷可以有效清除过量自由基，具有较好的抗氧化活性，同时具有抑制肿瘤细胞凋亡和增殖；此外，花色苷还可以抑制促炎因子的分泌，并对心脑血管具有一定的预防和治疗作用4-6。因此，为深入开发和利用花色苷，快速高效提取蓝莓花色苷是至关重要的。目前，主要采用传统的溶剂提取法对天然花色苷进行提取，该方式无需特殊设备、提取成本低和操作便捷。但该方式萃取效率低、耗时长、溶剂消耗量大、挥发性的溶剂会造成环境污染，无法满足我们高效提取花色苷的需求7。为了提高花色苷得率，一些具有发展潜力的提取方式被提出，如超声提取、微波提取、酶提取和超临界CO2提取8。微波辅助提取效率高和过程易控制，但微波选择性加热会造成萃取体系产生局部高温，导致花色苷大量降解。因此，该技术没有被广泛应用于工业上大规模提取花色苷9。超声辅助提取可有效破裂植物细胞壁，降低传质阻力和提高扩散系数，达到强化提取活性成分的目的10。该方式通常联合其它提取技术达到高效提取活性成分的目的。酶辅助提取是依据酶专一性的特点，有效降解植物细胞壁的成分，导致细胞壁被破坏，达到强化提取活性成分的效果。但是酶易受外界提取条件的影响，造成酶失活变性，失去原有的催化活性11。因此，该技术目前还处于实验室阶段。超临界 CO2辅助提取是利用超临界流体具有很强的溶解性，使更多的活性成分溶解在超临界流体中，实现强化提取活性成分的目的12。但该技术对设备要求高、提取成本大，不利于活性成分的大规模提取。随着科学技术的不断发展，提取技术也有了新的突破。近年来双水相提取技术作为一种绿色高效的提取分离技术在天然产物领域中被广泛关注。该技术提取成本低、提取条件温和、提取体系易构建及可用于连续提取天然活性成分等优势13。因此，该技术已被广泛应用不同种类的天然产物的提取当中。但利用双水相提取蓝莓花色苷的报道相对较少。因此，本研究在超声辅助提取的技术上，再利用双水相作为提取溶剂快速提取蓝莓中的花色苷。此外，对利用超声辅助双水相提取后所得的蓝莓花色苷提取物的抗肿瘤活性的研究报道有限。因此，本文采用超声辅助双水相提取技术提取蓝莓中的花色苷。首先研究 5 个实验因素对花色苷得率的影响；在此基础上，通过正交实验优化蓝莓花色苷的提取工艺；采用 MTT 法、激光共聚焦显微镜观察和流式分析法探究不同剂量的蓝莓花色苷提取物（Blueberry anthocyanins extracts，BAEs）对 HepG2 细胞的抗肿瘤活性的影响。1 材料与方法1.1 材料与试剂蓝莓：2021 年 8 月采摘于黑龙江小兴安岭；矢车菊-3-葡萄糖苷（Cyaniding-3-glucoside，C3G）标准品（纯度 99%）：天津质保科技有限公司；人肝癌 HepG2 细胞：北京协和细胞库；DMEM 和 PBS：广东志明生物科技有限公司；MTT：武汉艾美捷科技有限公司；DMSO：中国医药生物科技有限公司；青霉素/链霉素：北京盖德生物科技有限责任公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡：浙江顺达生物科技有限公司；盐酸、无水乙醇、硫酸铵和醋酸钠（分析纯）：山东诺蓝环保科技有限公司。202023年第9期中国食品添加剂China Food Additives着色剂专栏1.2 仪器与设备TL-650CT 超声提取仪：江苏天翎仪器有限公司；GBYS-7 CO2恒温培养箱：河北慧采科技有限公司；DR-200B 全自动酶标分析仪：无锡华卫德朗仪器有限公司 AXTG16G 高速离心机：盐城市安信实验仪器有限公司；ZQZY-78AV恒温培养振荡器：常州金坛良友仪器有限公司；RE-3000ABE 旋转蒸发仪：南北仪器有限公司；TF-SFD-40E 冷冻干燥机：上海拓纷设备有限公司；HW-STORM 流式细胞分析仪：大连华微生命科技有限公司；4XB-3 倒置显微镜：济南方圆试验仪器有限公司。1.3 方法1.3.1 样品前处理实验前首先将蓝莓除杂、清洗、打浆、然后将果浆置于真空冷冻干燥中直至冻干为止，随后将其粉碎，过 40 目筛，获得蓝莓果粉，在-18 冰箱中保存备用。1.3.2 蓝莓花色苷提取物的制备依据许丹妮等14制备乙醇-硫酸铵双水相体系。在预实验的基础上，准确称取 5 g 蓝莓果粉，然后加入制备好的双水相体系，将其充分混合，然后置于超声辅助提取仪中，通过仪器的控制面板设定超声功率和超声时间，提取结束后，待两相分配达到平衡后，收集上相溶液，将其离心（8000 r/min，20 min），一部分取上清液用于测定蓝莓花色苷得率；另一部分上清液通过旋转蒸发仪除去多余溶剂，然后将其置于冷冻干燥机中冻干，制得蓝莓花色苷提取物（Blueberry anthocyanins extracts，BAEs）。1.3.3 花色苷含量测定采用 pH 示差法测定不同提取条件下花色苷得率，依据杨兆艳15的方法并稍作改动。依据式（1）计算样品中花色苷得率。mVDFMAAAAcwnmnmnmnm11000pHpH5.47005200.1700520 1001%/细胞存活率010AAA （1）1.3.4 单因素实验本研究选择超声辅助双水相提取法作为蓝莓花色苷的提取方法，操作同 1.3.2。在前期预实验的基础上，本研究设定超声功率为 100、200、300、400、500 W 5 个水平；乙醇体积分数为18%、20%、22%、24%、26%5 个水平；硫酸铵质量分数为 16%、18%、20%、22%、24%5 个水平；料 液 比 为（110、120、130、140、150）g/mL 5 个水平；提取时间为 20、40、60、80、100 min 5 个水平，每个实验重复 3 次，结果用平均值 标准差表示。1.3.5 正交实验依据单因素实验，本研究选择超声功率（A）、乙醇体积分数（B）和硫酸铵质量分数（C）作为实验因素，以花色苷得率为目标值。设计 L9（33）正交实验，正交实验设计及因素水平编码如表 1 所示。1.3.6 HepG2 细胞培养将 HepG2 细胞接种于 DMEM 培养基中，并加入含 10%FBS 和 1%双抗（青霉素/链霉素），然后放于 37、5%CO2恒温培养箱中培养。当细胞铺满培养皿底 70%80%时，将细胞传代，利用对数期 HepG2 细胞进行后续实验研究。1.3.7 HepG2 细胞活力测定将对数期 HepG2 细胞按照细胞密度为 5104个/孔接种于 96 孔板中，每孔 200 L，在恒温培养箱中培养 24 h，待细胞贴壁时，弃上清，然后加入含不同质量浓度 BAEs（在最优工艺条件下得到的 BAEs）的 DMEM，分别培养 24、48、72 h，设置 BAEs 浓度分别为 0 g/mL（对照组）、低剂量组（25 g/mL）、中剂量组（50 g/mL）和高剂量组（100 g/mL），每个浓度设置 6 个复孔。依据表 1 超声辅助双水相提取蓝莓花色苷的 L9（33）正交实验因素及水平Table 1 L9（33）orthogonal experimental factors and levels of ultrasound assisted aqueous two-phase anthocyanins extraction from blueberry水平因素A 超声功率/WB 乙醇体积分数/%C 硫酸铵质量分数/%130020162400221835002420212023年第9期中国食品添加剂China Food Additives着色剂专栏MTT 法测定 HepG2 细胞存活率，操作步骤严格遵守试剂说明。最后利用酶标仪在 490 nm 处测定其吸光值，依据式（2）计算细胞存活率16。1001%/细胞存活率010AAA（2）式中：A0为空白组的吸光度；A1为样品处理组的吸光度。1.3.8 Hoechst 33342 染色细 胞 按 照 步 骤 1.3.7 进 行 处 理，然 后 向HepG2 细胞加入 1 mL 4%甲醛固定 10 min，随后加入 Hoechst 33342（1 mL/孔），在避光条件下染色 20 min，染色结束后，利用 PBS 缓冲液洗涤 3次。最后采用激光扫描共聚焦显微镜观察 HepG2细胞核的染色情况。1.3.9 不同质量浓度 BAEs 对 HepG2 细胞凋亡率和胞内 ROS 水平的影响将对数期 HepG2 细胞（2105个/孔）接种于 6 孔板，2 mL/孔，在 37、5%CO2条件下培养 24 h，待细胞贴壁后，按照 1.3.7 给药方式加入 BAEs，在恒温培养箱中将其培养 48 h，收集细胞，然后用 PBS 洗涤 2 次。分别取 5104个 HepG2 细胞，其余步骤参考文献15，最后通过流式细胞分析仪检测 HepG2 细胞凋亡率。采用同样的方式处理 HepG2 细胞，随后每孔加入终浓度 5 mol/L DCFH-DA 荧光探针，在避光条件下反应 20 min，吸取探针，利用 PBS 洗涤2 次处理后的细胞，然后采用胰蛋白酶将其消化，弃上清液，然后利用 PBS 重悬，最后通过流式细胞分析仪测定样品荧光强度。2 结果与分析2.1 单因素对蓝莓花色苷得率的影响双水相法提取蓝莓花色苷的单因素实验结果如图 1 所示。1002003004005000.60.81.01.21.41.61.82.0e花色苷得率/(mg/g)超声功率/WAabcd18202224260.60.81.01.21.41.61.82.0cb乙醇体积分数/%add花色苷得率/(mg/g)B16182022240.60.81.01.21.41.61.82.0硫酸铵质量分数/%花色苷得率/(mg/g)Cabcde0.60.81.01.21.41.61.82.0aa1:501:401:301:20料液比/(g/mL)1:10abc花色苷得率/(mg/g)D204060801000.60.81.01.21.41.61.82.0提取时间/minaaabc花色苷得率/(mg/g)E图 1 提取因素对蓝莓花色苷得率的影响Figure 1 Effect of extraction factors on the yield of blueberry anthocyanins222023年第9期中国食品添加剂China Food Additives着色剂专栏由图 1A 可知，当超声功率低于 300 W 时，超声功率越大，花色苷的得率越高，当超声功率在300 W 时，花色苷得率取得最大值 （1.890.04）mg/g。这种现象归因于超声功率越大，将会加速蓝莓细胞壁破裂，强化花色苷提取，进而提高花色苷得率15。但过高的超声功率会破坏花色苷的结构，造成花色苷大量降解，不利于花色苷的提取。该结果与 Xue 等17在探究超声提取树莓酒渣花色苷的结果一致。综上本研究选择超声功率200、300、400 W 三个水平进行正交实验。由图 1B 可知，当乙醇体积分数在 18%22%范围内，乙醇体积分数越高，花色苷得率越大。分析可能的原因是上相中乙醇体积分数越高，在有机相中花色苷具有较高的溶解度和扩散系数，从而提高花色苷得率18。但上相中乙醇体积分数过高，会造成过多的杂质被溶解，进而引起花色苷在有机相中的溶解度降低，最终导致花色苷得率降低19。该研究结果与许丹妮等14采用双水相提取葡萄皮渣花色苷的结果一致。综上本研究选择乙醇体积分数 20%、22%、24%三个水平进行正交实验。由图 1C 可知，硫酸铵质量分数低于 20%时，硫酸铵质量分数越高，花色苷得率越大，即硫酸铵质量分数与花色苷得率呈正相关。在硫酸铵质量分数为 20%时，花色苷得率取得最大值 （1.910.05）mg/g。分析其原因可能是当上相中存在高浓度的硫酸铵时，水分相对较低，花色苷在上相中的溶解度相对较高，此时花色苷得率较高20。当硫酸铵质量分数超过 20%时，不利于花色苷的提取14。该结果与 Qin 等13采用超声辅助双水相提取黑枸杞花色苷的实验结果一致。综上本研究选择硫酸铵质量分数选择 18%、20%、22%三个水平进行正交实验。由图 1D 可知，当料液比在（110）（130）g/mL 范围内，随料液比增加花色苷得率显著增加（P0.05）。其原因是较大的料液比会使得蓝莓细胞内外的浓度梯度逐渐增加，促进花色苷由内向外扩散，进而提高花色苷得率21。当料液比超过（130）g/mL 时，随料液比增加花色苷得率无显著变化（P 0.05）。该结果与 Xue 等22通过超声辅助低共熔提取树莓花色苷结果一致。因此，本研究选择料液比为（130）g/mL，后续不再进行优化。由图 1E 可知，花色苷得率随提取时间的延长呈现先显著增加（P0.05）的趋势，后呈无显著变化的趋势（P 0.05）。当提取时间在 60 min时，花色苷得率取得最大值 （1.820.04）mg/g。分析其原因可能是在提取初期，细胞内外的花色苷浓度梯度较大，这使得花色苷更易从细胞中扩散到溶剂中，进而提高花色苷得率23。但随提取时间的进一步增加，花色苷得率无显著变化（P 0.05）。该结果与 Belwal 等10通过超声辅助提取新红星梨果皮花色苷的实验结果一致。因此，本研究选择提取时间为 60 min，后续不再进行优化。2.2 超声辅助双水相提取花色苷的正交实验结果蓝莓花色苷经超声辅助双水相提取后的正交实验结果如表 2 所示。利用极差大小可判断实验因素对花色苷得率的影响程度。由表 2 可知，实验因素对花色苷得率影响的主次顺序为：C B A。最优水平组合为 A1B3C2，即超声功率 300 W、乙醇体积分数 24%和硫酸铵质量分数 18%。利用优化得到的工艺参数进行 3 次重复实验，所得蓝莓花色苷得率为（2.140.05）mg/g，说明利用正交实验使得超声辅助双水相提取蓝莓花色苷工艺得到优化。表 2 超声辅助双水相提取蓝莓花色苷的 L9（33）正交实验设计及结果Table 2 Orthogonal experimental design L9（33）and results of ultrasound assisted aqueous two-phase extraction of anthocyanins from blueberry实验号因素花色苷含量/（mg/g）A/WB/%C/%11111.630.0521221.550.0331331.820.0442231.460.0352311.320.0562121.860.0473321.920.0583131.390.0393211.530.03k11.671.631.49k21.551.511.78k31.611.691.56R0.120.180.29232023年第9期中国食品添加剂China Food Additives着色剂专栏2.3 不同处理时间和不同浓度 BAEs 对 HepG2细胞存活率的影响通过不同处理时间（24、48、72 h）和不同质量浓度 BAEs（25、50、100 g/mL）处理 HepG2细胞，HepG2 细胞存活率的结果如图 2 所示。由图 2 可知，在三个处理时间（24、48、72 h）下，随 BAEs 浓度增加 HepG2 细胞存活率均呈现显著降低的趋势（P0.05）。对比采用不同处理时间和相同浓度的 BAEs 处理 HepG2 细胞，结果发现在 24 h 时，HepG2 细胞存活率显著高于 48 h 和72 h（P0.05）；说明处理时间越长，BAEs 对HepG2 细胞的抑制能力越强。对比在 48 h 和 72 h 下的 HepG2 细胞存活率发现，在 48 h 和 72 h下 HepG2 细胞存活率无显著差异（P 0.05）。因此，本研究选择 BAEs 处理 HepG2 细胞 48 h 做进一步分析。分析上述的实验结果可知，BAEs在 24、48、72 h 对 HepG2 细胞存活率的 IC50 分别为 145.81、113.85、112.63 g/mL。结果表明BAEs 处理时间越长，抑制 HepG2 细胞增殖能力越强。综上进一步表明 BAEs 在一定程度上可以抑制 HepG2 细胞生长。2.4 不同浓度 BAEs 对 HepG2 细胞形态的影响本研究采用 Hoechst 33342 染色经不同浓度的 BAEs 处理 HepG2 细胞，并利用激光共聚焦显微镜观察染色后细胞形态，其结果如图 3 所示。由图 3 可知，正常对照组细胞核蓝色荧光较弱，结果说明正常对照组 HepG2 细胞形态稳定，未发生凋亡。与正常对照组相比，经不同浓度BAEs 处理 HepG2 细胞，随 BAEs 浓度增加，细胞数量明显降低，且细胞核蓝色荧光强度明显增加，且呈浓度依赖性，进一步表明 BAEs 可以促使 HepG2 细胞发生凋亡。对照组 0 g/mL2550100图 3 不同浓度 BAEs 对 HepG2 细胞形态的变化的影响（100）Figure 3 Morphological changes of HepG2 cells treated with different concentrations of BAEs（100）2.5 不同浓度 BAEs 对 HepG2 细胞凋亡率的影响先前的研究已经表明 BAEs 具有较强的抗氧化能力24，也可以在一定程度上抑制癌细胞生长、阻滞癌细胞周期及加速癌细胞的凋亡，达到较好的抗肿瘤活性25。故本实验在 MTT 的实验的基础上，进一步采用细胞流式分析仪探究不同浓度 BAEs 对 HepG2 细胞凋亡率的影响，其结果如图 4 所示。由图 4B 可知，随 BAEs 浓度增加 HepG2 细胞凋亡率显著增加（P0.05），并呈浓度依赖效应。分别用 BAEs 低剂量（10 g/mL）、中 剂 量（50 g/mL）和 高 剂 量（100 g/mL）浓 度 处 理 48 h 后 的 HepG2 细 胞 凋 亡率 分 别 为（16.750.72）%、（21.461.06）%、（42.371.65）%，与对照组相比，HepG2 细胞凋亡率分别增加了 8.58%、13.29%、34.20%。进一步说明 BAEs 可通过加速细胞的凋亡，且浓度越大，效果越显著，进而实现较好的抗肿瘤效果。020406080100dBdBdAcBcBcAbBbBbAaAaAHepG2细胞存活率/%24h48h72hBAEs浓度/(g/mL)10050250aA图 2 不同浓度 BAEs 对 HepG2 细胞存活率的影响Figure 2 Effect of different concentrations of BAEs on the survival rate of HepG2 cells242023年第9期中国食品添加剂China Food Additives着色剂专栏025BAEs浓度/(g/mL)HopG2细胞调亡率/%50100dcbaAnnexin V-FITCAPIBAEs/(g/mL)025501005000105Q4-11.33%Q4-390.54%Q4-24.49%Q4-43.64%Q4-11.95%Q4-382.19%Q4-28.04%Q4-47.82%Q4-10.02%Q4-379.55%Q4-20.02%Q4-420.40%Q4-13.28%Q4-355.26%Q4-217.32%Q4-424.14%104103102100.610-0.310110210310410-0.310110210310410-0.310110210310410-0.3101102103104105104103102100.6105104103102100.6105104103102100.640003000200010000图 4 不同浓度 BAEs 对 HepG2 细胞凋亡的影响Figure 4 Effect of different concentrations of BAEs on apoptosis of HepG2 cells2.6 不同浓度 BAEs 对 HepG2 细胞内 ROS 的影响当机体在正常生理状态下，ROS 的产生和清除处于动态平衡，机体内适量的 ROS 可提高巨噬细胞的吞噬能力和免疫能力26-27。但当机体受到外界应激原刺激时，会诱发胞内产生过量 ROS。大量研究表明过量 ROS 会损伤细胞膜、DNA 和蛋白，最终导致细胞凋亡28。本研究选择 DCFH-DA 为荧光探针，采用流式细胞分析仪测定 BAEs 对 HepG2 细胞内 ROS 水平。利用平均荧光强度来表示细胞内 ROS 水平。不同浓度 BAEs 对 HepG2 细胞内 ROS 的影响结果如图 5 所示。由图 5 可知，正常对照组细胞内的 ROS 水平较低。BAEs 处理组中，随 BAEs 加入 HepG2 细胞内 ROS 水平显著增加（P0.05），且呈剂量效应。结果表明 BAEs 可诱发 HepG2细胞内 ROS 水平的增加，加速 HepG2 细胞的凋亡。该结果与 BAEs 对 HepG2 细胞内凋亡率的影响结果一致。B100ROS500040003000200010000025BAEs浓度/(g/mL)平均荧光强度50100dcba20015050 010210310410510610210310410510610210310410510610210310410510610020025015050 0100400300100 0200300100 0200CountAB02550100图 5 BAEs 对 HepG2 细胞内 ROS 水平的影响Figure 5 Effect of BAEs on ROS levels in HepG2 cells252023年第9期中国食品添加剂China Food Additives着色剂专栏3 结论本研究在单因素实验的基础上，通过正交实验优化超声辅助双水相提取蓝莓花色苷的工艺，最佳的工艺参数组合为：超声功率 300 W、乙醇体积分数 24%、硫酸铵质量分数 18%、料液比（130）g/mL 和提取时间 60 min，花色苷得率为（2.140.05）mg/g。此外，探究了在最优工艺下获得的 BAEs 对 HepG2 细胞抗肿瘤活性。结果发现 BAEs 可显著抑制 HepG2 细胞存活率、提高细胞凋亡率和胞内 ROS 水平，进而发挥较好的抗肿瘤活性。本研究结果为花色苷绿色高效提取提供一种具有发展潜力的提取方式，同时为天然抗肿瘤药物的开发提供重要的物质基础。参考文献：1于泽源，赵剑辉，李兴国，等.大孔树脂-中压柱层析联用分离纯化蓝莓花色苷 J.食品科学，2018，39（1）：118-123.2Martn-Gmez J，Garca-Martnez T，Varo M，et al.Phenolic compounds，antioxidant activity and color in the fermentation of mixed blueberry and grape juice with different yeasts J.LWT，2021，146：111661.3Matskevich M P，Akimova S V，Samoshenkov E G，et al.Development of methods for preparing lignified cuttings of tall blueberry for rooting J.Journal of Physics：Conference Series，2021，1942（1）：012074.4Shibata Y，Ohara K，Matsumoto K，et al.Total anthocyanin content，total phenolic content，and antioxidant activity of various blueberry cultivars grown in togane，Chiba prefecture，Japan J.Journal of Nutritional Science and Vitaminology，2021，67（3）：201-209.5Raska D，Regulska-Ilow B.The significance of anthocyanins in the prevention and treatment of type 2 diabetes J.Advances in Clinical and Experimental Medicine，2018，27（1）：135-142.6Csedas G，Les F，Gmez-Serranillos M P，et al.Anthocyanin profile，antioxidant activity and enzyme inhibiting properties of blueberry and cranberry juices：A comparative study J.Food&Function，2017，8（11）：4187-4193.7Lotfi L，Kalbasi-Ashtari A，Hamedi M，et al.Effects of sulfur water extraction on anthocyanins properties of tepals in flower of saffron（Crocus sativus L）J.Journal of Food Science and Technology，2015，52（2）：813-821.8Silva S，Costa E M，Calhau C，et al.Anthocyanin extraction from plant tissues：A review J.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2017，57（14）：3072-3083.9Jafari S M，Mahdavee Khazaei K，Assadpour E.Production of a natural color through microwave-assisted extraction of saffron tepals anthocyanins J.Food Science&Nutrition，2019，7（4）：1438-1445.10Belwal T，Huang H，Li L，et al.Optimization model for ultrasonic-assisted and scale-up extraction of anthocyanins from Pyrus communis Starkrimson fruit peel J.Food Chemistry，2019，297：124993.11Zeng F S，Zeng H S，Ye Y Q，et al.Preparation of acylated blueberry anthocyanins through an enzymatic method in an aqueous/organic phase：Effects on their colour stability and pH-response characteristics J.Food&Function，2021，12（15）：6821-6829.12Kitryt V，Kavaliauskait A，Tamkut L，et al.Zero waste biorefining of lingonberry（Vaccinium vitis-idaea L.）pomace into functional ingredients by consecutive high pressure and enzyme assisted extractions with green solvents J.Food Chemistry，2020，322：126767.13Qin B L，Liu X C，Cui H M，et al.Aqueous two-phase assisted by ultrasound for the extraction of anthocyanins from Lycium ruthenicum Murr J.Preparative Biochemistry&Biotechnology，2017，47（9）：881-888.14许丹妮，杨海玲，范丽丽，等.遗传算法优化双水相法提取葡萄皮渣花色苷工艺及其组分分析 J.食品工业科技，2021，42（4）：168-174，193.15杨兆艳.pH 示差法测定桑椹红色素中花青素含量的研究 J.食品科技，2007，32（4）：201-203.16薛宏坤，谭佳琪，刘钗，等.巨峰葡萄皮花色苷的分离纯化、结构鉴定及抗肿瘤活性 J.食品科学，2020，41（5）：39-48.17Xue H K，Tan J Q，Li Q，et al.Ultrasound-assisted enzymatic extraction of anthocyanins from raspberry wine residues：Process optimization，isolation，purification，and bioactivity determination J.Food Analytical Methods，2021，14（7）：1369-1386.18Zheng X Z，Xu X W，Liu C H，et al.Extraction characteristics and