茶多酚对马氏珠母贝外套膜组织和细胞培养的影响.pdf

DOI:10.12131/20230049文章编号：2095 0780（2023）05 0058 08茶多酚对马氏珠母贝外套膜组织和细胞培养的影响方 伟1,2,3，丁瑞霞1,2,3，陈明强1,2,3，王 雨1,2,3，赵 旺1,2,3，温为庚1,2,3，马振华1,2,31.三亚热带水产研究院/海南省深远海渔业资源高效利用与加工重点实验室，海南 三亚 5720002.中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 5103003.中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心，海南 三亚 572018摘要：为改善马氏珠母贝(Pinctada martensii)外套膜组织和细胞体外培养的效果，探究了添加不同浓度的天然提取物茶多酚对外套膜组织和细胞培养液的优化效果。结果显示，当茶多酚的添加量为0.5%2.0%(体积分数)时，马氏珠母贝外套膜细胞的生物活性显著高于对照组(P0.05)；当添加量为1.0%时，相对细胞生物活性最高。5组完全培养液(0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%组)均能较好地促进细胞的生长增殖，且细胞的生长曲线均呈“S”型；当培养液中茶多酚的添加量为1.0%时，外套膜细胞增殖效果最优。研究表明，马氏珠母贝外套膜组织和细胞在最适培养液中均能大量增殖游离细胞，且正常分泌珍珠质，其中培养液中的钙离子(Ca2+)浓度随着组织和细胞增殖过程呈先减后增的趋势，但始终低于初始浓度。研究结果进一步优化了马氏珠母贝外套膜组织和细胞培养液，为推动马氏珠母贝无核珍珠的培育提供了理论基础。关键词：马氏珠母贝；茶多酚；外套膜；细胞培养；细胞活性；细胞增殖中图分类号：S 966.2文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Effects of tea polyphenol on tissue and cell culture of Pinctada martensiimantleFANG Wei1,2,3,DING Ruixia1,2,3,CHEN Mingqiang1,2,3,WANG Yu1,2,3,ZHAO Wang1,2,3,WEN Weigeng1,2,3,MA Zhenhua1,2,31.Sanya Tropical Fisheries Research Institute/Key Laboratory of Efficient Utilization and Processing of Marine Fishery Resources ofHainan Province,Sanya 572000,China2.South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of South China Sea FisheryResources Exploitation&Utilization,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Guangzhou 510300,China3.Tropical Fisheries Research and Development Center,South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of FisherySciences,Sanya 572018,ChinaAbstract:To improve the effects of tea polyphenols on tissue and cell culture of Pinctada martensii mantle,we explored theoptimization effect of adding different concentrations of natural extract tea polyphenols on the mantle tissue and cell culturemedium.The results show that when the added amount of tea polyphenols was 0.5%2.0%,the biological activity of P.martensiimantle cells was significantly higher than that of the control group,and the best added amount was 1.0%.The five groups ofcompletely culture medium(0%,0.5%,1.0%,1.5%and 2.0%)all promoted the growth and proliferation of cells,and the growthcurves of the cells were all in an S shape.When the addition of tea polyphenols was 1%,the proliferation effect of the mantlecells was the best.The mantle tissue and cells proliferated a large number of free cells and secreted nacre normally in the optimal第 19 卷第 5 期南 方 水 产 科 学Vol.19，No.52023 年 10 月South China Fisheries ScienceOct.，2023收稿日期：2023-03-16；修回日期：2023-05-06基金项目：海南省科技计划三亚崖州湾科技城联合项目(320LH009)；中国水产科学研究院基本科研业务费专项资金(2020TD55)作者简介：方伟(1990)，男，助理研究员，硕士，研究方向为贝类基础生物学。E-mail:通信作者：马振华(1981)，男，研究员，博士，研究方向为甲壳类、鱼类繁殖生物学。E-mail:culture medium.The mass concentration of Ca2+in the culture medium decreased first and then increased along with the pro-cess of tissue and cell proliferation,but was always lower than the initial concentration.The study further optimized theP.martensii mantle tissue and cell culture medium,which provides a theoretical basis for promoting the cultivation ofP.martensii nuclear pearls.Keywords:Pinctada martensii;Tea polyphenols;Mantle;Cell culture;Cell activity;Cell proliferation马氏珠母贝(Pinctada martensii)又称合浦珠母贝，隶属于软体动物门、瓣鳃纲、珍珠贝目、珍珠贝科、珠母贝属，是世界上生产海水珍珠的主要贝种，也是我国生产海水养殖珍珠“南珠”的主要贝类之一1。马氏珠母贝主要分布在热带和亚热带海域2-4，从日本千叶县以南至菲律宾、越南、缅甸、印度尼西亚、斯里兰卡、澳大利亚等均有分布5-6，我国主要分布在海南、广东、广西、台湾等省沿海。我国是世界海水珍珠养殖大国，马氏珠母贝是人工插核育珠的主养贝种7-9。近年来马氏珠母贝种质退化，育珠贝病害严重，插核后的死亡率和吐核率增加，且优质珠率下降10。为了突破插核技术的局限性，人工将供体珍珠贝的外套膜组织块或细胞小片一起移植到受体珍珠贝体内，诱导其组织大量分泌珍珠质，以实现无核珍珠的培育11-13。当前国内许多学者对珍珠贝细胞、组织体外培养进行了大量研究，而国外相关的研究报道较少。Lei等14对马氏珠母贝珍珠囊进行了培养研究；李勇和孟立霞15研究了贝类细胞的生存环境，总结了当前贝类细胞培养中存在的问题，为建立细胞系提供了指导；靳雨丽等16对三角帆蚌(Hypriosiscumingii)外套膜细胞培养进行了研究，优化了外套膜细胞培养及育珠的生产条件；岑妍慧和林江17改进了马氏珠母贝外套膜组织细胞体外培养技术和培养条件。茶多酚是从茶叶中提取的多羟基酚类物质的总称，主要包括黄烷醇类(儿茶素类)、黄酮、花色苷类等18-19。已有研究表明，茶多酚作为天然抗氧化物质具有抗氧化、防辐射、抗衰老、抑菌、抗过敏、抗血栓和解毒等作用20。茶多酚不仅广泛应用于畜产品加工和贮藏、食物的防腐保鲜、饲料添加剂等，还可以调节前列腺癌21、乳腺癌22以及鼻咽癌23等多种肿瘤的生物学活性。刘芳君等24研究发现，质量浓度低于 0.05 gL1的茶多酚对小鼠(Mus musculus)黑色素瘤细胞的体外增殖无明显的抑制作用，而当其质量浓度提高至 0.15 gL1时对该细胞迁移具有抑制作用。田梦秋等25研究发现，10320 gmL1 的茶多酚对 Hep2 细胞的体外增殖具有抑制作用，并诱导细胞凋亡，当茶多酚的质量浓度大于 160 gmL1时表现出较强的细胞毒性。王海琴等26研究了茶多酚对人牙槽骨成骨细胞增殖和凋亡的影响及分子机制。但茶多酚应用于马氏珠母贝外套膜组织和细胞培养的研究却鲜有报道。本研究通过在马氏珠母贝外套膜组织和细胞培养液中添加不同浓度的茶多酚，利用其抗氧化性、抑菌及解毒等特性来达到促进细胞生长增殖、提高细胞生物活性的目标，从而进一步优化组织和细胞培养，探索最适完全培养液，以提高组织和细胞体外培养的成功率，为人工无核育珠提供理论参考。1 材料与方法 1.1 实验材料NO2NH+4实验用马氏珠母贝由三亚热带水产研究院陵水试验基地提供。本次实验随机选取生长状态良好的马氏珠母贝，壳长为(5.800.32)cm，平均体质量为(26.500.13)g。暂养于室外遮阳陆基玻璃池(直径 2 m，高 1.2 m 的圆筒形)，换水量为 100%d1，投喂期间的饵料主要为牟氏角毛藻(Chaetocerosmulleri)，水温 2730，盐度 2731，pH7.68.1，溶解氧质量浓度7.0 mgL1，亚硝酸盐()质量浓度0.02 mgL1，氨氮(-N)质量浓度0.2 mgL1。1.2 实验方法1.2.1茶多酚的提取根据前人对茶多酚提取工艺的研究27-28，采用溶剂提取法对茶多酚进行提取。称取研细的苦丁茶末 3.0 g，加 100 mL 体积分数为 70%的乙醇作为溶剂，在 75 下回流浸泡 1.5 h，趁热抽滤，取滤液旋转蒸发，待其呈膏状时，用热水溶解，并用无菌蒸馏水定容至 50 mL 备用，通过吸光度法测定茶多酚的质量分数为 20%。1.2.2完全培养液的配制基础培养液配方：RMI-1640 培养基 10.4第 5 期方 伟等:茶多酚对马氏珠母贝外套膜组织和细胞培养的影响59gL1、Hepes 缓冲液 2.7 gL1、珍珠贝体液 10.0mLL1、青霉素 100 000 IUL1、链霉素 100 000IUL1、氯化钙(CaCl2)200 mgL1、灭活小牛血清200 mLL1、平衡盐溶液 50 mLL1、葡萄糖 100mLL1，pH 7.2。RMI-1640 培养基、Hepes 缓冲液、青霉素、链霉素、灭活小牛血清、平衡盐溶液、葡萄糖等以上试剂均统一采购于北京依珊汇通科技有限公司。其中平衡盐溶液配方为 1/3 的 1.9%(w)乳酸钠溶液和 2/3 的复方氯化钠溶液。自制珍珠贝体液：每次取 10 个马氏珠母贝的外套膜周边黏液，经 2 000 rmin1离心 10 min，取上清液置于 56 水浴锅中灭活处理 20 min，并在紫外灯下灭菌 20 min。加入培养液前需经过 0.2m 的滤膜过滤。将获取的茶多酚溶液稀释为 0%、5%、10%、15%和 20%5 种体积分数，各取 10 mL 溶液，分别加入到 90 mL 的基础培养液中，配置成 5 组含不同体积分数茶多酚的完全培养液(0%、0.5%、1.0%、1.5%和 2.0%组)，其中 0%组为对照组。1.2.3外套膜的获取选取健康且活力较强的马氏珠母贝，用 0.3%(w)肥皂水反复洗刷，去除贝壳表面的附着物。割断闭壳肌、取出外套膜，用双蒸水反复冲洗，并在 0.01%(w)高锰酸钾溶液中浸泡 30 min 进行初步消毒。将已消毒处理的外套膜边缘部位分离出来，并在抗菌溶液(青霉素 4 000 UmL1，链霉素 5 000UmL1)中浸泡 15 min，期间反复冲洗。最后用灭菌的双蒸水再次冲洗 23 次后待用。1.2.4外套膜细胞的体外培养将处理过的外套膜组织小片通过撕膜法获取外套膜外表皮，用无菌单面刀片切成碎块，放入含有 300 mL 消化液(0.25%胰蛋白酶，pH 7.27.4，预配好的胰蛋白酶消化液经 0.22 m 除菌膜进行除菌后再使用)的培养瓶中，置于 37 恒温摇床上以 120 rmin1的速率消化 30 min，后移至 2.5mL 离心管中以 1 000 rmin1的速率离心 5 min，弃上清液。在留有沉淀物的离心管中加入平衡盐溶液继续以 1 000 rmin1的速率离心 2 min，重复操作3 次，获取外套膜细胞。将相同数量的外套膜细胞放入 5 组含不同浓度茶多酚的培养液中，置于 25 的恒温培养箱中持续培养。实验共设置 5 组，每组 3 个平行，每 2 d 更换一次新鲜培养基。1.2.5外套膜组织的体外培养将处理过的外套膜放入无菌培养皿中，先用脱脂棉吸收表面的液体残留，然后用无菌双面刀片将其切割成 1 mm2 大小均匀的组织小片。每个培养瓶(225 cm2)内贴片 30 个组织小片，待组织小片附着于瓶壁后，将培养瓶反转并加入 5 mL 完全培养液。放入恒温箱中 25 培养 24 h 后，将培养瓶再次反转，使组织小片完全浸没在培养基中，继续培养和观察。通过前期开展利用不同浓度的茶多酚对细胞活性影响的实验，得出当茶多酚添加量为1.0%时，相对细胞生物活性最高，细胞生长效果最佳，因此在开展外套膜细胞和组织培养观察实验时仅采用 1.0%组培养液，每 2 d 更换一次新鲜培养基。1.3 测定指标1.3.1外套膜细胞的生长曲线每隔 48 h 对 5 组分别取样，按常规方法消化后各取 1 mL 细胞悬液至 EP 管中计数细胞量，统计分析结果。1.3.2生物活性检测将收集的外套膜细胞悬浮液加入 96 孔培养板(Corning，美国)，每孔 100 L。为确保每孔细胞的数量及活性一致，每批实验都使用同一管混合均匀的细胞悬液，并确保细胞密度约为 5104个mL1。向细胞悬液中分别加入 5 种不同浓度的茶多酚。设置两组对照分别为：仅含 100 L 培养基的空白对照组和仅含 100 L 细胞悬液的对照组，每组 3 个平行。添加完茶多酚后，将细胞置于细胞培养箱(25)中培养 24 h。细胞活性检测方法：使用 Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒(东仁化学)按照说明书进行检测。在 100 L 的细胞悬液中加入 10 L CCK-8 试剂，放回 25 培养箱孵育 4 h 后，用酶标仪测定波长450 nm 处的吸光度。相对细胞活性计算方法：相对细胞活性=(实验组吸光度培养基吸光度)/(对照组吸光度培养基吸光度)。1.3.3细胞形态和钙离子(Ca2+)浓度测定方法采用倒置显微镜观察组织细胞的形态与生长状况，并做好记录。采用血气分析仪测定马氏珠母贝外套膜组织及细胞培养液中的 Ca2+浓度。1.3.4数据分析采用 SPSS 26.0 软件进行统计学分析，采用60南 方 水 产 科 学第 19 卷xst 检验，P0.05 表示差异显著。结果均以“平均值标准差()”表示。2 结果 2.1 不同浓度的茶多酚对细胞活性的影响不同浓度的茶多酚对马氏珠母贝外套膜细胞活性的影响见图 1。在不同浓度的茶多酚刺激下，5 组间的细胞活性均存在显著性差异(P0.5%组2.0%组0%组。在细胞培养第 30 天，细胞密度最高的为1.0%组，最低的为 0%组。结果表明，茶多酚对马氏珠母贝外套膜细胞的活性具有显著的促进作用，有利于细胞的增殖生长，当浓度为 1.0%时，促进效果最佳。2.2 外套膜细胞的培养观察由 2.1 中结果可知，1.0%组完全培养液对于马氏珠母贝外套膜细胞的培养优于其他组。因此采用 1.0%组培养液对马氏珠母贝外套膜细胞进行培养，并利用倒置显微镜观察不同时期的细胞生长状况(图 3)。培养至第 5 天时，细胞呈分散状态，形态为圆形或椭圆形，其中数量最多的为近圆形的上皮细胞，大小为 4050 m，分裂过程中上皮细胞呈现多种形态。当培养至第 10 天时，细胞贴壁效果较好，少量细胞悬浮于培养液中，瓶壁出现少量晶体颗粒。第 20 天时，细胞相互聚集，呈现岛屿状分布。第 30 天时，细胞聚集生长现象更为明显，培养瓶中可观察到在细胞群周边出现絮状结晶。2.3 外套膜组织培养观察采用 1.0%组培养液对马氏珠母贝外套膜组织进行培养，并利用倒置显微镜观察不同时间组织的生长状况(图 4)。外套膜组织培养第 5 天时，组织块周边逐渐有细胞迁移出来，且组织块有细胞迁移留下的痕迹(图 4-a)。迁移出的细胞形态以圆形和椭圆形为主，呈颗粒状分散。当培养第 10 天时，组织块生长晕上的细胞生长旺盛且细胞排列紧密，周边细胞数量进一步增加，并出现透明形态的细胞，胞体周边有突起，且贴壁效果明显，瓶底出现微小的颗粒状晶体。培养第 15第 20 天，组织块周边细胞密集分布形成细胞片，上皮细胞的分泌作用使瓶底颗粒状晶体进一步增多。培养第 25 天，组织块周边出现很多纤维状的突起，上皮细胞继续分泌大量颗粒状物质，在瓶底形成明显的白色块状物质。培养第 30 天，组织块已变成了茶褐色，大部分组织和细胞仍然存活，但活力明显减弱，细胞分泌能力停止。2.4 外套膜组织和细胞培养对 Ca2+吸收的影响采用 1.0%组培养液对马氏珠母贝外套膜组织和细胞进行培养，其组织和细胞培养液中的 Ca2+质量浓度变化如表 1 所示。在组织和细胞培养的整个0.5%1.0%0.5%2.0%0%abcde组别 Group相对细胞活性Relative cell activity00.51.01.52.02.53.03.5图1 不同浓度的茶多酚对外套膜细胞活性的影响注：不同字母间存在显著性差异(P0.05)。Fig.1 Effects of different concentrations of tea polyphenols oncell activity of P.fucataNote:Different letters indicate significant differences(P0.05).0.5%1.0%1.5%2.0%0%05101520培养时间 Culture time/d2530细胞密度 Cell density/(104 个cm2)01020304050608070茶多酚添加量Added amount of tea polyphenols图2 马氏珠母贝外套膜细胞生长曲线Fig.2 Growth curve of cells of P.fucata mantle第 5 期方 伟等:茶多酚对马氏珠母贝外套膜组织和细胞培养的影响61过程中，培养液中 Ca2+的质量浓度随着培养时间的延长均呈现先减后增的趋势，且培养液中的 Ca2+质量浓度均在第 10 天达到最低，分别为(163.588.40)和(148.986.58)mgL1。培养第 0第 5 天，细胞培养液中的 Ca2+质量浓度低于组织培养液，且存在显著性差异(P0.05)，表明在培养前期细胞对 Ca2+的吸收能力明显强于外套膜组织；培养第5第 15 天，细胞培养液中的 Ca2+质量浓度在同期略低于组织培养液，但两者之间无显著性差异；培养第 0第 15 天，组织和细胞培养液中的 Ca2+含量均呈现递减的趋势，说明在组织和细胞培养过程中均吸收了培养液中的 Ca2+。培养第 15第 25天，随着培养时间的延长，组织和细胞培养液中的 Ca2+质量浓度均呈现递增趋势，但始终低于初始表1 马氏珠母贝外套膜组织和细胞培养液中的Ca2+质量浓度变化Table 1 Change of Ca2+mass concentration in mantletissue and cell culture medium of P.fucata培养时间Culture time/d组织培养Tissue culture/(mgL1)细胞培养Cell culture/(mgL1)0200.000.00a200.000.00a5186.605.37bd168.227.24b10163.588.40c148.986.58c15178.739.35d159.548.95d20188.358.78be179.439.63e25196.116.10ae183.424.42e注：同列中不同字母间存在显著性差异(P0.05)。Note:Different letters indicate significant differences(P0.05).(b)(c)(a)(e)(f)(d)图3 马氏珠母贝外套膜上皮细胞培养观察(400)注：a.培养第 5 天的细胞；b.培养第 10 天的细胞；c.培养第 15 天的细胞；d.培养第 20 天的细胞；e.培养第 25 天的细胞；f.培养第 30 天的细胞。Fig.3 Observation on cells of P.fucata mantle(400)Note:a.Cell cultured on Day 5;b.Cell cultured on Day 10;c.Cell cultured on Day 15;d.Cell cultured on Day 20;e.Cell cultured on Day 25;f.Cell cultured on Day 30.(b)(c)(a)(e)(f)(d)图4 马氏珠母贝外套膜组织培养观察(400)注：a.培养第 5 天的组织；b.培养第 10 天的组织；c.培养第 15 天的组织；d.培养第 20 天的组织；e.培养第 25 天的组织；f.培养第 30 天的组织。Fig.4 Observation on tissue of P.fucata mantle(400)Note:a.Tissue cultured on Day 5;b.Tissue cultured for on Day 10;c.Tissue cultured on Day 15;d.Tissue cultured on Day 20;e.Tissue cultured on Day 25;f.Tissue cultured on Day 30.62南 方 水 产 科 学第 19 卷质量浓度(200 mgL1)，两者之间存在显著性差异(P0.05)。3 讨论 3.1 茶多酚对马氏珠母贝组织和细胞培养的影响马氏珠母贝属于双壳类软体动物，作为低等动物，其外套膜组织细胞的培养有别于哺乳动物及其他脊椎动物。当前马氏珠母贝外套膜组织和细胞培养还未取得突破性进展，培养液的优化一直处在不断探索中29。常规的细胞培养液具有良好的借鉴作用，但局限性比较明显，通常情况下细胞的生物活性会随着培养时间逐渐降低，影响细胞的体外培养效果30。茶多酚作为一种天然提取物，具有显著的调节生物学活性、消除自由基、抗氧化、抑菌等功效31。在马氏珠母贝细胞培养液中添加适量的茶多酚，其酚羟基提供的大量 H+与培养液中的氧自由基发生反应，从而提高培养液的抗氧化能力，促进细胞新陈代谢，改善细胞活性，可进一步优化组织细胞培养效果。本研究发现当培养液中添加茶多酚的体积分数为 1.0%时，对细胞活性的促进作用最优，细胞的相对活性提高至 3 倍。茶多酚在一定程度上消除了细胞微环境中的自由基，增强了机体抗氧化性，进一步释放了细胞的生物活性。曹东维等32研究发现，茶多酚在体外高糖环境下可延缓人肾小球系膜细胞(Human glomerular mesan-gial cells,HGMCs)衰老，提高细胞生物活性，这与本研究得出的结果相似。本研究共设置了含 5 个体积分数梯度茶多酚(0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)的培养液，各组的细胞生长曲线均呈“S”型，说明茶多酚在细胞培养过程中未产生抑制或其他不良反应。通常细胞在生长过程中伴随着新陈代谢会排泄出二氧化碳、尿酸及其他有害物质，容易滋生有害细菌，引起培养环境的恶化，长期积累的毒素甚至会导致细胞死亡。在培养液中添加适量的茶多酚，其抗氧化、抑菌等功效可以维持培养环境的稳定，从而促进马氏珠母贝外套膜细胞的新陈代谢，起到延缓衰亡的功效。本研究结果发现所有添加茶多酚的实验组培养效果均优于对照组，其中茶多酚体积分数为 1.0%时，培养效果最优，与其他4 组存在显著性差异(P0.05)。实验结果进一步表明了在细胞培养液中添加适量的茶多酚，对细胞增殖具有良好的促进作用。也有研究发现不同剂量的茶多酚对癌细胞的增殖生长具有抑制作用，这可能与癌细胞的增长和凋亡机制相关33-34。在培养液中添加过量的茶多酚是否对马氏珠母贝外套膜组织和细胞培养产生抑制作用有待进一步研究。3.2 马氏珠母贝外套膜组织与细胞培养观察在培养液中添加 1.0%的茶多酚时，马氏珠母贝外套膜组织和细胞均可正常分裂增殖。培养第5 天，组织块周边出现细胞迁移，呈颗粒状分布，而细胞培养液中也相应的出现大量细胞分裂增殖，两者均观察到了近圆形的上皮细胞。培养第 10 天，组织和细胞培养液中均观察到了细胞贴壁现象，且晶体颗粒初现。王爱民等35研究发现在马氏珠母贝外套膜组织培养中，最先迁移出来的是颗粒状细胞，紧随其后的是透明细胞。本实验在细胞培养前期发现了大量的颗粒状细胞，而透明细胞的数量相对较少，说明在茶多酚的刺激下细胞活性增强，前期以大量分裂增殖为主，当细胞增殖到一定数量后，开始逐渐分化为其他形态的细胞。Machii 和Wada36在对褶纹冠蚌(Cristaria plicata)的研究中，以外套膜组织块上部或边缘部位观察到褐色或茶色来判定其分泌作用，表明组织块而非独立的上皮细胞分泌了珍珠质。本研究在培养第 20 天后发现组织和细胞培养液中均出现了晶体颗粒，说明马氏珠母贝上皮细胞也具有分泌珍珠质的功能。这可能是不同物种贝类的外套膜组织和细胞在不同的培养条件下，其功能表达存在差异。3.3 组织和细胞培养液中的 Ca2+浓度变化培养液是维持动植物组织生长的人工配制养料，细胞培养成功的关键在于培养液中含有充足的营养组分，可提供细胞生长所需的能量、微量元素及未知的生物因子等。由于珍珠的化学成分与产珠贝壳类似，均由超过 95%的碳酸钙和 4%的固体蛋白质生物矿化而来37-38，因此在马氏珠母贝外套膜组织和细胞培养液中添加适量的 Ca2+，可保障其正常的分泌功能。本研究在完全培养液中添加了200 mgL1的 Ca2+，随着组织和细胞的培养，组织液中 Ca2+质量浓度在前 10 d 呈递减趋势，说明组织和细胞增殖的过程中吸收了大量的 Ca2+，同时镜检发现在瓶壁上存在颗粒状晶体也进一步给予证实。陈勇富和钱国英39对三角帆蚌外套膜离体上皮组织珍珠质分泌能力的研究也得出相似结论。在培养第 15 天后，培养液中的 Ca2+浓度随着培养时第 5 期方 伟等:茶多酚对马氏珠母贝外套膜组织和细胞培养的影响63间的延长逐渐升高，说明在培养后期马氏珠母贝外套膜组织和细胞同正常的活体一样，具有旺盛的钙质吸收和分泌功能。这与唐敏和石安静40对外套膜外表皮细胞钙的分泌研究结果一致。通过对培养液中 Ca2+浓度变化的研究可知，当培养液中添加适量的茶多酚、Ca2+及其他营养成分后，马氏珠母贝外套膜组织和细胞可正常增殖分化，且分泌珠质的功能并未受到影响。在茶多酚的刺激下，细胞的氧化代谢能力增强，培养前期可吸收大量的 Ca2+，为珍珠质的分泌提供充足的钙源。在马氏珠母贝无核育珠的实践生产中，既要保证细胞培养液中含有充足的 Ca2+，同时也要确保外套膜细胞在茶多酚的刺激下对其充分吸收，以加快珠质的分泌，提升珍珠的质量和产量。4 结论本研究探索了茶多酚对马氏珠母贝外套膜组织和细胞体外培养的影响。当培养液中茶多酚的添加量控制在 0.5%2.0%时，均可增强马氏珠母贝外套膜细胞的生物活性，其中添加量在 1.0%时的增殖效果最优；进一步优化了马氏珠母贝外套膜细胞培养液(1.0%茶多酚、RMI-1640 培养基 10.4 gL1、Hepes 缓冲液 2.7 gL1、珍珠贝体液 10.0 mLL1、青霉素 100 000 IUL1、链霉素 100 000 IUL1、CaCl2 200 mgL1、灭活小牛血清 200 mLL1、平衡盐溶液 50 mLL1、葡萄糖 100 mLL1，pH 7.2)；马氏珠母贝外套膜组织和细胞在添加适量茶多酚后均可正常增殖分化，且培养液中的 Ca2+浓度随着培养时间的延长呈现先减后增的趋势。马氏珠母贝外套膜组织和细胞培养液作为无核育珠的关键技术之一，可通过添加 1.0%的茶多酚进行优化和改良，这不仅填补了茶多酚在贝类细胞培养研究中的空白，也为贝类育珠的实际生产提供了重要的参考依据。参考文献：蒙钊美,李有宁,邢孔武,等.珍珠养殖理论与技术 M.北京:科学出版社,1996:30-36.1李有宁,陈明强,翁雄,等.我国热带海水大型珍珠贝类的珍珠养殖技术现状及对策建议 J.广东农业科学,2013,40(1):136-138.2陈明强,陈旭,李有宁,等.美济礁合浦珠母贝吊笼养殖试验 J.水产科学,2018,37(3):379-383.3邓正华,林先鑫,陈明强,等.合浦珠母贝幼虫变态中的形态、器官变化及运动与摄食观察 J.水生生物学报,2019,43(5):1072-1080.4严雪瑜,张斌,李选积,等.浅谈广西钦州南珠产业发展策略 J.水产养殖,2020,41(11):66-67.5房晓宸,卢金昭,梁海鹰,等.马氏珠母贝 Caspase-3 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