苍术素调节Notch信号对EGFR-TKI耐药的非小细胞肺癌细胞株H1975增殖、凋亡的影响.pdf

苍术素调节 信号对 耐药的非小细胞肺癌细胞株 增殖、凋亡的影响张琳 朱琳 李晨 【摘要】目的 探讨苍术素对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂()耐药的非小细胞肺癌()细胞株 增殖、凋亡的影响以及可能的作用机制 方法 以人肺腺癌 细胞为亲本细胞采用低浓度逐步加量诱导法构建 耐药细胞株/吉非替尼耐药()/细胞分为正常组(不添加任何药物)、苍术素(低、中、高)浓度组(、/苍术素)、抑制剂组(/抑制剂)法检测各组/细胞增殖活力流式细胞仪检测各组/细胞周期分布和凋亡率 和 检测各组/细胞中 信号通路相关基因和蛋白表达水平结果 吉非替尼抑制/细胞的 显著高抑制 细胞的()表明本研究所构建的 耐药细胞株/可以用于后续实验 药物干预 后与正常组比较苍术素(低、中、高)浓度组和 抑制剂组/细胞增殖活力、/细胞比例以及细胞中、和蛋白表达水平降低(均 )而/细胞比例、凋亡率升高(均 )且苍术素各浓度组呈浓度依赖性(均 )与苍术素(低、中)浓度组比较 抑制剂组/细胞增殖活力、/细胞比例以及细胞中、和蛋白表达水平降低(均 )/细胞比例、凋亡率升高(均 )与苍术素高浓度组比较 抑制剂组/细胞/细胞比例降低()结论 苍术素可抑制 耐药的 细胞株 增殖并诱导细胞周期阻滞和凋亡其作用机制可能与抑制 信号通路激活有关【关键词】苍术素非小细胞肺癌表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药 信号通路 【】()()./()./()()(/)(/)././././()/./()()./().().:./.作者单位:上海同济大学附属杨浦医院药学部临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期 ()/()/()./().【】肺癌仍是全世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤其中非小细胞肺癌()占大多数 虽然在过去的十年中 在筛查、诊断和治疗方面均取得了显著进展但由于 早期症状不典型多数患者确诊时已处于疾病晚期无法进行手术治疗导致患者生存时间仍较短 另外随着表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂()的上市尽管 突变的晚期 患者治疗疗效有所提高但耐药成为了 治疗的瓶颈绝大部分患者经一线治疗后数月即出现疾病进展 因此开发新的治疗药物以降低 耐药性是 患者有效治疗的关键也是目前 治疗的热点和难点问题 近年来天然中草药因其高效、低毒等优势而在各个研发领域广受欢迎 苍术素作为茅苍术根茎所含精油中的一种活性成分其抗肺纤维化、抗炎、抗癌等作用已被报道然而苍术素对 耐药 的作用及分子机制尚不明确 此外已有研究表明在 治疗下 突变肺腺癌的 改变可导致组织学小细胞癌转化在 治疗后一半 突变的 肿瘤组织中 和 上调且 抑制剂可削弱体外和体内奥希替尼(三代)耐药性并表明 抑制剂和奥希替尼联合可能是 突变 的潜在治疗方法 基于此本研究以人肺腺癌细胞 为研究对象探讨苍术素对 耐药的 细胞增殖、凋亡的影响以及 信号通路在此过程中的作用资料与方法一、主要材料 实验细胞人 细胞系 细胞(人肺腺癌细胞)、人正常肺上皮细胞()来源于美国 公司 将 细胞重悬于含 胎牛血清和 双抗(青霉素和链霉素)的 培养基中置于 培养箱中培养待细胞融合度达到 左右时进行消化传代 换液一次取对数生长期细胞进行后续实验主要试剂苍术素(纯度:)购自上海源叶生物科技有限公司 抑制剂(一种 抑制剂纯度 )购自美国 公司 试剂()、蛋白浓度测定试剂盒()购自上海抚生实业有限公司膜联蛋白()异硫氰酸荧光素()/碘化丙啶()双染细胞凋亡检测试剂盒()购自上海弗元生物科技有限公司 链合成试剂盒()购自上海烜雅生物科技有限公司 试剂()、荧光定量 ()()、裂解液()购自上海酶联生物工程有限公司 发光试剂()购自美国 公司兔源一抗()、()、()、()、()和二抗 标记羊抗兔()购自英国 公司二、实验方法 耐药细胞株构建以人肺腺癌细胞 为亲本细胞采用低浓度逐步加量诱导法构建 耐药细胞株/吉非替尼耐药()具体操作为:将处于对数生长期且生长状态良好的亲本细胞 接种于 孔板中第 添加 /吉非替尼第 添加 /吉非替尼第 添加 /吉非替尼第 添加 /吉非替临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期尼以后每天均添加 /吉非替尼进行培养直到添加吉非替尼后细胞不会出现死亡为止此时说明 耐药细胞株/构建成功 法检测亲本细胞 和耐药细胞/对吉非替尼的敏感性以及苍术素对、/细胞的毒副作用 将处于对数生长期的 和/细胞以每孔 个细胞接种于 孔板中(每孔 )待细胞贴壁后添加不同浓度吉非替尼(终浓度为、/)其中/吉非替尼处理组为对照组在、培养箱中培养 后每孔添加 溶液(/)继续培养 后使用酶标仪检测各孔在 波长处的吸光度值()计算细胞存活率以及吉非替尼抑制细胞增殖的半数抑制浓度()细胞存活率()实验组 /对照组 将处 于 对 数 生 长 期 的、和/细胞以每孔 个细胞接种于 孔板中(每孔 )待细胞贴壁后添加不同浓度苍术素(终浓度为、/)其中/苍术素处理组为对照组常规培养 后每孔添加 溶液(/)继续培养 后使用酶标仪检测各孔的 计算细胞存活率细胞分组与药物干预/细胞分为正常组、苍术素(低、中、高)浓度组、抑制剂组 其中正常组细胞不添加任何药物苍术素(低、中、高)浓度组细胞分别添加终浓度为、/的苍术素 抑制剂组细胞添加终浓度为 /的 抑制剂 法检测各组/细胞增殖活力/细胞以每孔 个细胞接种于 孔板中(每孔 )待细胞贴壁后按照实验方法 中分组与处理方法进行干预常规培养 、后每孔添加 溶液(/)继续培养 后使用酶标仪检测各孔的 并以 表示细胞增殖活力 流式细胞仪检测各组/细胞周期分布/细胞以每孔 个接种到 孔板中(每孔 )待细胞贴壁后按照实验方法 中方法干预常规培养 收集细胞并将细胞重悬于 溶液中计数 个细胞添加 染色液室温避光染色 使用流式细胞仪自带软件分析细胞周期 流式细胞仪检测各组/细胞凋亡率/细胞以每孔 个接种到 孔板中(每孔 )待细胞贴壁后按照实验方法 中方法干预常规培养 收集细胞 洗涤后加入 结合液重悬细胞随后加入 和 染色液室温避光染色 使用流式细胞仪自带软件分析细胞凋亡率 检 测 各 组/细 胞 中 信号通路相关基因表达水平收集按照实验方法 中方法干预 后的各组/细胞 试剂提取细胞中总 并按 链合成试剂盒说明将 逆转录为 随后以 为模板将其与基因特异性引物(引物由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成引物序列见表)和荧光定量 ()等试剂相混合配制 反应体系最后置于 仪上扩增 以 为内参采用 法定量分析细胞中、表达水平表 引物序列信息基因 序列()预期产物扩增长度()扩增效率()上游.下游 上游.下游 上游.下游 上游.下游 上游.下游 检测各组/细胞中 信号通路相关蛋白表达水平收集按照实验方法 中方法干预 后的各组/细胞使用 裂解液充分裂解提取细胞中总蛋白 法测定蛋白浓度并加热煮沸使蛋白变性 通过 电泳分离蛋白并在切胶后将蛋白转移至 膜 室温封闭膜 随后加入一抗(、抗体)冰箱中孵育过夜 洗涤后加入二抗(标记临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期羊抗兔)培养箱中孵育 发光试剂显色 以 为内参 软件半定量分析蛋白条带灰度三、统计学方法采用 软件统计分析实验中获取的数据 本实验数据均为计量数据且符合正态分布以均值 标准差()表示多组间比较采用单因素方差分析进一步组间多重比较采用 检验 差异有统计学意义结 果一、亲本细胞 和耐药细胞/对吉非替尼的敏感性与 /吉非替尼比较(、/)吉非替尼均可显著降低 细胞存活率(均 )而(、/)吉非替尼可显著降低/细胞存活率(均 )(见表)经计算吉非替尼抑制/细胞的 为()/显著高于抑制 细胞的()/()表明本研究所构建的 耐药细胞株/可以用于后续实验表 不同浓度吉非替尼干预后 和/细胞存活率比较()吉非替尼(/)存活率()/.值.值.注:与 /吉非替尼比较 与 /苍术素比较/苍术素可显著降低 细胞存活率()而(、/)苍术素均可显著降低、/细 胞 存 活 率(细胞、/细胞 、均 )且、/苍术素干预下/细胞存活率显著高于 细 胞(、)(见表)因此选用、/苍术素作为低、中、高浓度进行下一步实验表 不同浓度苍术素干预后、和/细胞存活率比较()苍术素(/)存活率()/.值.值.注:与 /苍术素比较 二、各组/细胞增殖活力比较药物干预 后与正常组比较苍术素(中、高)浓度组和 抑制剂组/细胞增殖活力降低(均 )与苍术素低浓度组比较苍术素高浓度组和 抑制剂组/细胞增殖活力降低(均 )药物干预 、后与正常组比较苍术素(低、中、高)浓度组和 抑制剂组/细胞增殖活力降低(均)且苍术素各浓度组呈浓度依赖性(均 )与苍术素(低、中)浓度组比较 抑制剂组/细胞增殖活力降低(均 )(见表)表 各组/细胞增殖活力比较()组别增殖活力()正常组.苍术素低浓度组.苍术素中浓度组.苍术素高浓度组.抑制剂组.值.值.注:与正常组比较 与苍术素低浓度组比较 与苍术素中浓度组比较 三、各组/细胞周期分布比较与正常组比较苍术素(低、中、高)浓度组和临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期 抑制剂组/细胞中/细胞比例降低(均 )/细胞比例升高(均 )且苍术素各浓度组呈浓度依赖性(均 )与苍术素(低、中)浓度组比较 抑制剂组/细胞中/细胞比例降低(均 )/细胞比例升高(均 )与苍术素高浓度组比较 抑制剂组/细胞中/细胞比例降低()(见图 和表)四、各组/细胞凋亡率比较与正常组比较苍术素(低、中、高)浓度组和 抑制剂组/细胞凋亡率升高(均 )且苍术素各浓度组呈浓度依赖性(均 )与苍术素(低、中)浓度组比较 抑制剂组/细胞凋亡率升高()(见图 和表)五、各组/细胞中 信号通路相关基因表达水平比较与正常组比较苍术素(低、中、高)浓度组和 抑制剂组/细胞中、表达水平降低(均 )且苍术素各浓度组呈浓度依赖性(均 )与苍术素(低、中)浓度组比较 抑制剂组/细胞中、表达水平降低()(见表)六、各组/细胞中 信号通路相关蛋白表达水平比较与正常组比较苍术素(低、中、高)浓度组和 抑制剂组/细胞中、蛋白表达水平降低()且苍术素各浓度组呈浓度依赖性()与苍术素表 各组/细胞周期分布比较()组别/()()/()正常组.苍术素低浓度组.苍术素中浓度组.苍术素高浓度组.抑制剂组.值.值.注:与正常组比较 与苍术素低浓度组比较 与苍术素中浓度组比较 与苍术素高浓度组比较 图 流式细胞仪检测各组/细胞周期分布情况 为正常组 为苍术素低浓度组 为苍术素中浓度组 为苍术素高浓度组为 抑制剂组图 流式细胞仪检测各组/细胞凋亡情况 为正常组 为苍术素低浓度组 为苍术素中浓度组 为苍术素高浓度组 为 抑制剂组临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期(低、中)浓度组比较 抑制剂组/细胞中、蛋白表达水平降低()(见图 和表)表 各组/细胞凋亡率比较()组别凋亡率()正常组.苍术素低浓度组.苍术素中浓度组.苍术素高浓度组.抑制剂组.值.值.注:与正常组比较 与苍术素低浓度组比较 与苍术素中浓度组比较 讨 论 靶向治疗是晚期 突变 患者一线治疗的标准方式可显著改善患者预后延长无进展生存期 但使用 治疗期间不可避免地会出现耐药性获得性耐药已成为导致 患者治疗失败的重要原因且这对患者和临床医生来说目前仍是一个重大挑战 因此进一步阐明 治疗 的耐药机制并寻找新药物靶点和开发新药物成为临床中急需解决的问图 检测各组/细胞中、蛋白表达泳道 为正常组泳道 为苍术素低浓度组泳道 为苍术素中浓度组泳道 为苍术素高浓度组泳道 为 抑制剂组题 研究表明苍术素作为一种天然中草药具有抗肿瘤、抗炎等多种药理活性 苍术素对肺癌细胞、的增殖均具有抑制作用尤其 细胞并可诱导 细胞凋亡和抑制细胞迁移 然而苍术素在 耐药 中的作用尚有待探索 吉非替尼是第一代 的一线治疗药物本研究通过低浓度逐步加量诱导法构建 耐药细胞株/结果显示/细胞对吉非替表 各组/细胞中、表达水平比较()组别正常组.苍术素低浓度组.苍术素中浓度组.苍术素高浓度组.抑制剂组.值.值.注:与正常组比较 与苍术素低浓度组比较 与苍术素中浓度组比较 表 各组/细胞中、蛋白表达水平比较()组别/正常组.苍术素低浓度组.苍术素中浓度组.苍术素高浓度组.抑制剂组.值.值.注:与正常组比较 与苍术素低浓度组比较 与苍术素中浓度组比较 临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期尼的 显著高于 细胞对吉非替尼的 表明 本 研 究 所 构 建 的 耐 药 细 胞 株/可以用于后续实验 此外本研究发现(、/)苍术素均可显著降低、/细胞存活率但对 细胞存活率无显著影响故选用、/苍术素作为低、中、高浓度进行下一步实验 进一步分析显示低、中、高浓度苍术素均可降低/细胞增殖活力且呈浓度依赖性 表明苍术素可抑制 耐药细胞株/增殖 此外靶向调节细胞周期从而诱导细胞周期阻滞是抑制肿瘤细胞增殖的主要特征之一也是一种重要的抗肿瘤机制 本研究结果显示苍术素可呈浓度依赖性降低/细胞中/细胞比例并升高/细胞比例 提示苍术素可能通过诱导 耐药细胞株/期阻滞进而抑制细胞增殖 细胞凋亡亦可影响细胞生长、分化等生理过程与癌症等病理过程密切相关且近三十多年来临床肿瘤学的支柱和目标一直是开发通过促进细胞凋亡而有效消除癌细胞的疗法 本研究中苍术素可呈浓度依赖性升高/细胞凋亡率表明苍术素可能是通过促进 耐药细胞株/凋亡而杀死癌细胞的潜在药物 信号通路是一条进化上十分保守的信号转导途径 受体(包括、和)通过与配体相互作用激活、等碱性 螺旋 环 螺旋转录抑制因子家族的靶基因从而转导细胞信号调控细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程且 信号通路的异常激活与肝癌、肺癌等肿瘤的发生发展密切相关 研究表明 信号通路与肺腺癌化疗耐药有关且 可促进 细胞的吉非替尼耐药 在肺腺癌组织和 耐药细胞系(/)中表达上调且 蛋白高表达的患者与较短的总生存期相关 本研究结果显示苍术素可呈浓度依赖性降低/细胞中、和蛋白表达水平表明苍术素可能通过抑制 信号通路激活调控 耐药细胞株/增殖、细胞周期和凋亡 为了进一步验证 信号通路的作用本研究使用 抑制剂干预/细胞结果显示 抑制剂既可抑制 信号通路激活又能够降低/细胞增殖活力和/细胞比例并升高/细胞比例和凋亡率且其作用效果与高浓度苍术素几乎相当 这进一步表明 信号通路可能参与苍术素调控 耐药细胞增殖、细胞周期和凋亡的过程综上所述苍术素可抑制 耐药的 细胞株 增殖并诱导细胞周期阻滞和凋亡其作用机制可能与抑制 信号通路激活有关 本研究为苍术素在 耐药 治疗中的应用提供了一定实验依据参考文献 .():.:.():.:.:.():.张鹏飞 刘丽华.肺癌治疗中 耐药与 表达的关系.中国肿瘤生物治疗杂志 ():.():.:./.():.():.():.(下转第 页)临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期.:.():.():.江秋霞 吕国荣 施丽景 等.肺部十四分区超声评分法诊断新生儿呼吸窘迫综合征.中国医学影像技术 ():.():.():.():.():.:.():.():./.():.收稿日期:(上接第 页)周思宇 门万夫 刘振东 等.基因逆转人肺腺癌细胞对 耐药的机制.中华肿瘤防治杂志 ():.():.():.().():.():./.():.():.():.:.()():.():.():.:.():.():.():.收稿日期:临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期