超高效液相色谱—大气压化学电离—飞行时间质谱法测定油茶籽油中的3种甾醇.pdf

基金项目:广州市市场监督管理局科技项目(编号:k j )作者简介:潘锦华,男,广州检验检测认证集团有限公司助理工程师,学士.通信作者:潘锦华(),男,广州检验检测认证集团有限公司助理工程师,学士.E m a i l:q q c o m收稿日期:改回日期:D O I:/j s p j x 文章编号 ()超高效液相色谱大气压化学电离飞行时间质谱法测定油茶籽油中的种甾醇D e t e r m i n a t i o no f t h r e es t e r o l s i nc a m e l l i ao l e i f e r as e e do i l b ya t m o s p h e r i cp r e s s u r ec h e m i c a l i o n i z a t i o nu l t r ap e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t i m eo f f l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y潘锦华,P ANJ i n h u a,陈峰,CHENF e n g,白建平,B A IJ i a n p i n g,段雪菲,DU AN X u e f e i,李绮淇,L IQ i q i,(广州检验检测认证集团有限公司,广东 广州 ;国家加工食品质量检验中心 广东,广东 广州 )(G u a n g z h o uI n s p e c t i o na n dT e s t i n gC e r t i f i c a t i o nG r o u pC o,G u a n g z h o u,G u a n g d o n g ,C h i n a;N a t i o n a lQ u a l i t yT e s t i n gC e n t e r f o rP r o c e s s e dF o o dG u a n g d o n g,G u a n g z h o u,G u a n g d o n g ,C h i n a)摘要:目的:为准确测定油茶籽油中的谷甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇含量.方法:建立超高效液相色谱四极杆/飞行时间质谱测定方法.样品以 酮胆甾烷醇为内标物,m L乙醇加热回流提取 m i n,离心分层后,样液经X b r i d g eB EHC(mmmm,m)色谱柱洗脱分离,大气压化学电离源(A P C I)电离和正离子模式分析测试.结果:种甾醇在 m g/L的质量浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数R均大于 ,本底值,倍添加水平的回收率为 ,相 对 标 准 偏 差(R S D s)为 ,方 法 检 出 限 均 为 m g/k g,方 法 定 量 限 为m g/k g.结论:该方法操作简单、溶剂消耗少且环保、回收率及重现性好,可用于准确测定油茶籽油中的种甾醇.关键词:超高效液相色谱四极杆/飞行时间质谱;大气压化学电离;油茶籽油;谷甾醇;菜籽甾醇;菜油甾醇A b s t r a c t:O b j e c t i v e:I n t h i ss t u d y,u l t r a p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h i g hr e s o l u t i o nq u a d r u p o l et i m eo ff l i g h tm a s ss p e c t r o m e t e r(U P L C Q T O F/M S)w a se s t a b l i s h e dt od e t e r m i n e s i t o s t e r o l,b r a s s i c a s t e r o l,a n dc a m p e s t e r o l i nc a m e l l i ao l e i f e r as e e d o i l M e t h o d s:U s i n g k e t o c h o l e s t a n o l a s t h e i n t e r n a ls t a n d a r da n d p e r f o r m i n gs a m p l ee x t r a c t i o n b y h e a t i n gi tf o r m i na n dr e f l u x i n g i tw i t h m Le t h a n o l A f t e rc e n t r i f u g a t i o na n d l a y e r i n g,t h r e es t e r o l sw e r es e p a r a t e db yX b r i d g eB EH C(mm mm,m)C h r o m a t o g r a p h i c c o l u m ne l u t i o n F i n a l l y,i o n i z e d b y a t m o s p h e r i c p r e s s u r e c h e m i c a li o n i z a t i o ns o u r c ea n da n a l y z e db yp o s i t i v ei o nm o d e R e s u l t s:T h ei n t e r n a ls t a n d a r dc u r v e so f t h et h r e es t e r o l ss h o w e da no b s e r v a b l e l i n e a rr e l a t i o n s h i pi n t h er a n g e o f m g/L,w h i l et h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tRw a sb o t hg r e a t e rt h a n T h ea v e r a g e r e c o v e r i e s a t,a n d t i m e s o f b a c k g r o u n dv a l u ew e r e i nt h er a n g eo f T h e r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n(R S D s)w a sr a n g e df r o m t o M o r e o v e r,t h el i m i t s o f d e t e c t i o n w e r e m g/k g a n d t h el i m i t s o fq u a n t i t a t i o n w e r e m g/k g,r e s p e c t i v e l y C o n c l u s i o n:T h em e t h o dw a s s i m p l e i no p e r a t i o n,l o wi ns o l v e n t c o n s u m p t i o n,a n dt o x i c i t y I th a dg o o dr e c o v e r i e sa n dr e p r o d u c i b i l i t yt h a tc o u l db ea p p l i e df o r t h ea c c u r a t ed e t e r m i n a t i o no f t h r e es t e r o l s i nc a m e l l i ao l e i f e r as e e do i l K e y w o r d s:U P L C Q T O F M S;A P C I;c a m e l l i ao l e i f e r as e e do i l;s i t o s t e r o l;b r a s s i c a s t e r o l;c a m p e s t e r o l油茶是一类山茶科山茶属的常绿小乔木或灌木.油茶籽压榨后所得茶油成分与橄榄油相似,含有 的不饱和脂肪酸.油茶籽油中含有大量的多酚,甾醇等活性成分,具有极强的抗氧化作用,因此 有 降低 血脂、预防心脑血管疾病等作用.而油茶籽油中的甾醇,主要有谷甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇等,具体结构式见图.有研究表明,谷甾醇可减轻幽门螺杆菌感染性胃炎小鼠胃组织炎症,也具有降脂抗肿瘤等作用.由于油茶籽油中含有大量的甾醇,因此被作为健康食用油F OO D&MA CH I N E R Y第 卷第期 总第 期|年月|图种甾醇的化学结构F i g u r eC h e m i c a l s t r u c t u r eo f t h r e es t e r o l s而得到广泛的推广.目 前 对 于 植 物 油 中 的 甾 醇 测 定 方 法 主 要 集 中 在H P L C法、G C法 、H P L C M S/M S法 和G C M S及G C M S/M S法 ,其中,色谱法由于检测器选择性较低,谱图容易受杂质影响,而且分离难度大,因此通常需要在前处理中对样品进行皂化,耗时耗力,且影响回收率.而质谱法中,气相色谱质谱法的报道相对较多,相比于与非质谱检测器联用,具有更高的选择性,也能在短时间内实现多种化合物测定.研究拟以加热回流为提取手段,无需对样品进行皂化,利用高分辨飞行时间质谱精确分子量进行测定,内标法定量,以期为建立植物油中甾醇类物质的测定及相关指纹图谱提供参考.材料与方法仪器与设备飞行 时 间 质 谱 仪:T r i p l e T O F 型,美 国A B s c i e x公司;超高效液相色谱仪:U P L C A D型,日本岛津公司;高速离心机:k 型,德国西格玛公司;多管漩涡振荡器:M u l t iR e a x型,德国H e i d o l p h公司;数显恒温电热板:D B B型,常州润华电器有限公司.材料与试剂油茶籽油:市售;甲酸、乙腈、乙醇:色谱纯,美国赛默飞世尔公司;谷甾醇、菜 籽 甾 醇、菜 油 甾 醇、酮 胆 甾 烷 醇:纯度,上海安谱实验科技股份有限公司.标准溶液的配制标准储备液分别称取 m g种甾醇及内标,无水乙醇溶解并定容至 m L容量瓶,配制成 m g/L的标准储备溶液.内标工作液将 酮胆甾烷醇标准储备液,用无水乙醇稀释成质量浓度为m g/L的标准内标工作液.标准工作液取上述标准储备液加入内标液配制,m g/L的工作曲线,其中内标质量浓度为m g/L.样品处理条件称取g油茶籽油样品于 m L圆底烧瓶中,加入 m L内标工作液,涡旋混匀,连同圆底烧瓶重新称重.控制 电 热 套 温 度,在 乙 醇 微 沸 条 件 下,加 热 回 流 m i n,冷却至室温后,用无水乙醇补足失重,涡旋混匀,取m L溶液于离心管中,以 r/m i n离心 m i n,取上清液过 m有机滤膜,待测定.仪器条件色谱条件色谱柱:X b r i d g eB EH C(mmmm,m);色谱柱柱温:;进样量:L;流动相A为 乙 腈,B为 甲 酸 水 溶 液;流 动 相 流 速:m L/m i n;梯度洗脱程序:m i n,A;m i n,A;m i n,A;m i n,A;m i n,A.质 谱 条 件离 子 源:大 气 压 化 学 电 离 源(A t m o s p h e r i cp r e s s u r ec h e m i c a l i o n i z a t i o n,A P C I);扫 描方式:正离子;离子源温度:;离子源电压:V.四极杆质量扫描范围:D a;去簇电压D P:V,碰撞能量C E:,e V;全信息串联质谱模式检测,灵敏 度 模 式;扫 描 时 间 间 隔:m s;校 正 液 流 速 为m L/m i n,每 个样品进行一次自动校正,以确保系统在批内的精准质量数稳定.回收率试验设计通过初步测定批量样品,选择种甾醇含量较低的样品进行加标回收试验,对含量较高的化合物,按照其测得的本底值的,倍进行添加,含量相对较低的,按照本低值的,倍进行添加,在优化后的方法下进行次平行测定,计算相对标准偏差以评价试验重复性.方法的应用使用优化后的方法,对样品进行测定,每个样品平行测定次,记录相应平均回收率及相对标准偏差.数据分析及绘图待测定化合物信息由A n a l y s tT F软件采集,根据TO F M S和I D A M S高分辨质谱获得化合物的准确分子量,采用P e a k V i e w,M a s t e r V i e w 和M u l t i Q u a n t 等软件进行定性定量分析处理.结果与讨论提取条件的优化提取溶剂体积的选择试验初期对提取溶剂体积|V o l ,N o 潘锦华等:超高效液相色谱大气压化学电离飞行时间质谱法测定油茶籽油中的种甾醇进行优化,由于油茶籽油均为阳性样品,且含量较大,因此难以使用本底值相当的浓度进行加标.为了考察对应的提取效率,试验选择含量较高的样品为对象,以不同提取溶剂体积对同一样品最终测得的含量为判定依据,对提取溶剂体积进行优化,结果如图所示.随着提取溶剂体积 的 增 大,种 甾 醇 测 得 的 含 量 均 在 增 加,在 m L时,基本提取充分,体积继续增大,测得的含量基本持平,最终选择 m L为提取溶剂体积.图提取溶剂体积对提取含量的影响F i g u r eE f f e c t so f s o l v e n t v o l u m eo ne x t r a c t i o nc o n t e n t加热回流时间的选择试验对最佳的加热回流时间进行探讨,种甾醇的沸点均较高,因此具有一定的热稳定性,可长时间加热提取,但长时间加热不但检测成本增加,还会导致乙醇蒸发过多,随时间的推移,提取液中目标物浓度过大,乙醇和油两相之间平行系数发生变化,而导致提取率下降.试验使用 m L的提取液,分别对同一样品提取,m i n,结果发现,谷甾醇在提取 m i n时,提取含量基本达到最大,但菜籽甾醇和菜油甾醇在 m i n时的提取含量明显要比 m i n时的高,因此,综合考虑,最终选择提取时间为 m i n,详细结果见图.质谱条件的确定根据种甾醇的化学结构分析可知,其结构中主要含有烃基,使用不同的离子源,不同的模式电离,可能会产生不同的母离子.试验分别对比了种甾醇在电喷雾电离源(E S I)和大气压化学电离源(A P C I)下的母离子响应强度.结果发现,种甾醇在E S I和A P C I源的负模式下,均没有响应,主要是因为种甾醇的羟基较稳定,没图提取时间对提取含量的影响F i g u r eE f f e c t so f e x t r a c t e dt i m eo ne x t r a c t i o nc o n t e n t能失去H而产生相应的MH母离子.而在正模式下,种甾醇在E S I源中可失去羟基(OH),从而生成MOH形态的母离子,但响应很低,难以用于实际测定,同样,在A P C I源的正模式下,所产生的MH母离子响应也很低,说明这两种母离子均不稳定.而A P C I源的正模式下也同样产生了MOH形态的母离子,其响应则较高,可满足分析要求,因此最终选择A P C I源的正模式进行电离.在流动相中加入质子H,可在离子化过程中与羟基结合,使离子化平衡向右移,增强母离子响应.试验对比了乙腈水和乙腈甲酸水溶液体系作为流动相对母离子响应的影响,结果发现,当使用乙腈甲酸水作为流动相时,种甾醇母离子的响应比乙腈水体系要高 左右,因此,最终选用乙腈甲酸水作为流动相.所测得种甾醇及内标物 酮胆甾烷醇的质谱信息见表.由于无法完全确定子离子的归属,因此选择母离子进行定性定量,其余信息辅助定性.种甾醇标准品提取离子流色谱图见图.甾醇质谱裂解途径分析种甾醇均先由CO键开始断裂,在丢失羟基后,由于氧原子(O)的电负性较强,因此CO键中的电子对被O吸引带走,使该位置的碳原子(C)失去一个电子而带一个单位正电荷,得到MOH形态的母离子.由于种甾醇的结构相似,因此在质谱中的裂解途径也相似,且得到的碎片子离子具有较大的交集.从I D A M S采集得到的子离子质荷比可知,在A P C I源的电离模式下,表种甾醇的质谱信息T a b l eM a s ss p e c t r a l i n f o r m a t i o no f t h r e es t e r o l s化合物分子式理论值(m/z)实测值(m/z)子离子(m/z)误差()谷甾醇C H O ;菜籽甾醇C H O ;菜油甾醇C H O ;酮胆甾烷醇C H O ;安全与检测S A F E T Y&I N S P E C T I ON总第 期|年月|图种甾醇及内标物标准品提取离子流色谱图F i g u r eE x t r a c t e d i o nc h r o m a t o g r a mo f t h r e es t e r o l sa n d i n t e r n a l s t a n d a r d种甾醇所产生的二级碎片质荷比均较小,主要为m/z ,在碰撞能量的轰击下,多元环逐步碎裂,逐级产生出不同质荷比的碎片,而其他烷基则以中性碎片的形式在四极杆中丢失.由图可知,种甾醇的碎片存在互为同分异构体的情况,因此在高通量检测时,若要单独分析单个化合物的裂解机理,应对组分进行色谱分离,以出峰时间作为辅助定性依据.标准曲线和检出限按照的方法配制对应浓度的标注曲线,其中含内标质量浓度为m g/L,于优化后的仪器条件测定,将质量浓度和仪器软件积分后得到的峰面积记录于E x c e l软件,并拟合得到线性方程,种甾醇的相关系数R均大于 ,说明在此仪器条件下,种甾醇线性较好,可准确定量.由于样品均为阳性,因此以信噪比的倍(S/N)和 倍(S/N),结合稀释倍数,计算得到方法检出限(L O D)为m g/k g,定量限(L OQ)为m g/k g,经批量测定样品含量后,该定量限可满足一般样品中种甾醇含量的测定.图甾醇的质谱裂解途径F i g u r eM a s ss p e c t r o m e t r yf r a g m e n t a t i o np a t h w a yo f s t e r o l|V o l ,N o 潘锦华等:超高效液相色谱大气压化学电离飞行时间质谱法测定油茶籽油中的种甾醇表种甾醇的线性方程、检出限(L O D)和定量限(L OQ)T a b l eL i n e a re q u a t i o n,L i m i to fd e t e c t i o n(L O D)a n dq u a n t i t a t i o n(L OQ)f o r t h r e es t e r o l s化合物浓度范围/(m gL)线性方程相关系数R检出限/(m gk g)定量限/(m gk g)谷甾醇 Y X 菜籽甾醇 Y X 菜油甾醇 Y X 回收率与精密度试验对批量样品进行测定,选择种甾醇含量较低的样品,经次测定后,以结果平均值为基准进行不同水平的标准添加,考察种甾醇的回收率.由于油茶籽油中,谷甾醇含量普遍较高,而菜籽甾醇和菜油甾醇含量相对较低,因此分别采用不同倍数水平进行加标,根据测定结果,最终决定谷甾醇的添加水平为,倍,菜籽甾醇和菜油甾醇的添加水平则为,倍.如表所示,在日内重复组平行样品下,种甾醇的回收率为 ,相对标准偏差(R S D)为 ,说明方法回收率高,重复性好,可用于准确测定油茶籽油中的种甾醇含量.表加标回收率和相对标准偏差T a b l eR e c o v e r yr a t ea n dr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n(n)化合物本底值/(m gk g)添加水平/(m gk g)测得值/(m gk g)回收率/R S D/谷甾醇 菜籽甾醇 菜油甾醇 实际样品测定随机选择 个油茶籽油样品进行测定,结果如表所示,谷甾醇含量均远高于菜籽甾醇和菜油甾醇,而不同样品中,谷甾醇和菜油甾醇含量差异较大,但菜籽甾醇含量差异较少.表不同样品中种甾醇含量T a b l eC o n t e n t so f t h r e es t e r o l s i nd i f f e r e n t s a m p l e sm g/k g样品编号谷甾醇菜籽甾醇菜油甾醇 结论研究以蒸馏回流的方式提取油茶籽油中的种甾醇,优化提取条件后,提取率高,同时结合超高效液相色谱分离,飞行时间质谱准确测定分子量,能准确定性定量,且回收率试验数据表明,方法回收率高,重现性好,可用于批量测定油茶籽油中种甾醇含量.针对植物油脂中的中低极性活性物的测定,使用大气压化学电离源可获得较好的响应.研究只针对甾醇进行研究,通过丢失一分子的羟基,可形成相对稳定的母离子,获得较好响应,对于其他不含羟基的化合物,在大气压化学电离源中的离子化机理仍有待进一步研究.参考文献1 叶敏倩,吴峰华,芮鸿飞,等.不同产地油茶籽油主要特征组分分析J.食品科学,2020,41(20):222226.YE M Q,WU F H,RUI H F,et al.Analysis and comparison ofmajor characteristic components of camellia seed oil from differentregionsJ.Food Science,2020,41(20):222226.2 柏云爱,宋大海,张富强,等.油茶籽油与橄榄油营养价值的比安全与检测S A F E T Y&I N S P E C T I ON总第 期|年月|较J.中国油脂,2008(3):3941.BAI Y A,SONG D H,ZHANG F Q,et al.Comparison ofnutritional value betweenCamellia oleiferaseed oil and olive oilJ.China Oils Fats,2008(3):3941.3 TAIYL,WEICL,YANGH,etal.Transcriptomicandphytochemicalanalysisofthebiosynthesisofcharacteristicconstituents in tea(Camellia sinensis)compared with oil tea(Camellia oleifera)J.BMC Plant Biology,2015,15(1):190202.4 FREEMAN B L,EGGET D L,PARKER T L.Synergistic andantagonistic 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