超高效液相色谱法-串联质谱法测定百色辣椒酱中合成辣椒素的含量.pdf

80 食品安全导刊 2023年10月（上）分析检测超高效液相色谱法-串联质谱法测定 百色辣椒酱中合成辣椒素的含量班振，邓瑜*（百色市食品药品检验所，广西百色 533000）摘要：目的：建立超高效液相色谱-串联质谱法快速检测百色辣椒酱中合成辣椒素的方法。方法：样品经 J2 PrepLinc 全自动样品前处理平台净化浓缩后，采用超高效液相色谱法串联质谱法进行分析，以电喷雾化离子源多反应监测模式进行外标定量分析。结果：合成辣椒素在 1.0 500.0 ngmL-1呈良好线性关系，相关系数为 0.999 4，检出限为 0.08 mgkg-1，定量限为 0.40 mgkg-1，加标回收率在 73.8%97.5%，相对标准偏差为 2.1%3.5%（n=6）。结论：该方法操作可靠、测定结果准确，适用于实验室大批量检验辣椒酱中合成辣椒素。关键词：超高效液相色谱-串联质谱法；辣椒酱；合成辣椒素Determination of Synthetic Capsaicin in Baise Chili Sauce by Ultra-High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass SpectrometryBAN Zhen,DENG Yu*(Baise Institutes for Food and Drug Control,Baise 533000,China)Abstract:Objective:A new method for the determination of synthetic capsaicin in Baise chili sauce by using UPLC-ESI-MS/MS was developed.Method:The samples were cleaned up by J2 PrepLinc platform and then determined by UPLC-ESI-MS/MS with multiple reaction monitoring.Result:The synthetic capsaicin showed a good linear relationship between 1.0 and 500.0 ngmL-1,with a correlation coefficient of 0.999 4.The quantitation limit was 0.08 mgkg-1,and the quantification limit is 0.40 mg kg-1.The recoveries were in the range of 73.8%97.5%,and the relative standard deviations of which were 2.1%3.5%(n=6).Conclusion:This method is reliable in operation and accurate in determination results,which can meet the requirement of analysis in a large number of samples.Keywords:ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry;chili sauce;synthetic capsaicin辣椒中呈辣味的物质统称为辣椒素或辣素，又名辣椒碱1。天然辣椒素具有抗菌、抗肿瘤和镇痛消炎的作用，能促进胃液分泌、增强食欲，促进血液循环，提高机体的抗病能力，还有驱虫、发汗、无瘾镇痛等功效，但提取纯化成本高、产量低限制其推广和应用。合成辣椒素具有与天然辣椒素类似的结构和功能，二者辣度相当，目前国内已有成熟的化学全合成路线，成本仅为天然辣椒素的 1/20，医学上广泛应用于镇痛、消炎、活血、化瘀，具有强烈的辛辣味和非常强烈的刺激性2。化学合成的合成辣椒素在价格和辣度方面与天然辣椒素相比占有绝对优势，很多加工企业为追求低生产成本，添加合成辣椒素代替天然辣椒素3。由于合成辣椒素具有价格低、辣度可控制等优势，容易被人为加入辣椒制品中以提升辣度，存在很大的作者简介：班振（1984），男，壮族，广西百色人，本科，工程师。研究方向：食品药品检验。通信作者：邓瑜（1985），男，广西平乐人，本科，工程师。研究方向：食品检验技术。E-mail:。Oct.2023 CHINA FOOD SAFETY 81分析检测食品安全隐患和风险。本方法使用 J2 Scientific PrepLinc 全自动样品前处理平台进行样品前处理，实现样品前处理的无人化和自动化，有效提高样品前处理的速度和可靠性，降低误差风险。1材料与方法1.1材料与试剂样品为采集自百色市各市县区 20 家餐饮店的自制辣椒酱；甲醇、乙腈、甲酸、四氢呋喃、乙酸乙酯和环己烷，色谱纯，其他试剂为分析纯；标准物质为合成辣椒素（天津阿尔塔科技有限公司，CAS 为2444-46-4，100 gmL-1，批号为 S116989）。1.2仪器与设备Agilent 1260/6460A高效液相色谱-质谱联用仪，安捷伦科技公司；J2 Scientic Preplinc（AccuVapTM）样品前处理平台；CPA225D 电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；ST4R Plus 高速冷冻离心机，Thermo Fisher；明澈TM-D 超纯水器，默克密理博实验设备（上海）有限公司。1.3实验方法1.3.1样品前处理称取样品（50.5）g（精确至 0.001 g）置于具塞离心管中，加入 50 mL 甲醇溶液并摇匀，将样品置于J2 Scientific PrepLinc 全自动样品前处理平台，选取SPE 在线浓缩功能，将样品过柱净化并浓缩至近干，转移定容至 100 mL，准确吸取 1.0 mL 至 10 mL 容量瓶中，摇匀，用 0.22 m 尼龙 66 微孔滤膜过滤，待上机检测。1.3.2标准曲线的配制分别准确移取合成辣椒素标准溶液 1.00 mL 置于 10 mL 容量瓶中，用甲醇-乙腈（1 1）稀释至刻度，即得标准储备溶液（10 gmL-1）。量取不同体积的标准储备溶液用甲醇-乙腈（1 1）稀释，配制成浓度为 1.0 ngmL-1、5.0 ngmL-1、10.0 ngmL-1、50.0 ngmL-1、100.0 ngmL-1和 500.0 ngmL-1的系列标准工作液。1.3.3仪器条件（1）色谱条件。流动相 A 为 0.1%甲酸+甲醇-水溶液（10 90），流动相 B 为 0.1%甲酸+乙腈-水溶液（90 10），洗脱条件见表 1。进样量：5 L；柱 温：38；色 谱 柱：安 捷 伦 858700-902 SB-C18 RRHD（2.1 mm100 mm，1.8 m）。表 1流动相洗脱条件时间/minA/%B/%流速/（mLmin-1）085150.251.5085150.253.005950.255.005950.255.5085150.25（2）质谱条件。扫描方式：正离子模式；检测方式：多反应监测；干燥气温度：320；干燥气流量：10 Lmin-1；定量定性离子对、碰撞能量、碎裂电压见表 2。表 2质谱条件化合物定量离子对（m/z）碎裂电压/V碰撞能量/eV合成辣椒素294.2/170.1942294.2/137.09462结果与分析2.1系统适应性精密吸取合成辣椒素标准物质（100 gmL-1）溶液适量，按 1.3.3 项下仪器条件进样测定，详见图 1。Acquisition Time(min)3.84.04.24.44.64.85.05.25.4Relative Abundance(%)-0.100.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.1102294.2-137.0,294.2-170.1Ratio=5.0(100.0%)图 1100 gmL-1合成辣椒素标准物质色谱图2.2标准曲线分别取 1.3.2 项下系列标准工作液上机测试，根据结果绘制标准曲线，曲线如图 2 所示。以浓度（X，ngmL-1）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，所得线性方程为 Y=11 099.99X+26 105.75，相 关 系 数 为 0.999 4，结 果 表 明 合 成 辣 椒 素 在1.0 500.0 ngmL-1与峰面积呈良好的线性关系。2.3检测限与定量限取1.3.2项下的标准溶液适量，逐级稀释，按1.3.3项下仪器条件进样测定，记录峰面积，以信噪比分82 食品安全导刊 2023年10月（上）分析检测别为 3 1 和 10 1 时的待测成分质量浓度记为检测限和定量限，结果检测限为 0.08 mgkg-1，定量限为 0.40 mgkg-1。2.4回收率与精密度实验结果取样品适量，加入低、中、高浓度的合成辣椒素标准溶液，按 1.3.1 进行样品前处理，进行 6 次重复测定，计算回收率和相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD，结果见表 3。低、中、高浓度合成辣椒素的回收率 RSD 值均小于 5%，表明该方法精密度良好，准确可靠，可满足分析方法的要求。表 3回收率和 RSD 结果加标浓度/（ngmL-1）回收率/%RSD/%123456576.5 77.1 81.4 74.3 73.8 76.23.55088.2 83.7 89.5 84.9 88.1 82.43.310097.5 91.3 94.6 95.2 94.9 93.82.12.5样品测定结果对比取 20 家餐饮店的自制辣椒酱适量，按 1.3.1 项下样品前处理方法处理，按 1.3.3 项下仪器方法测定合成辣椒素含量，并与 GB/T 404382021 方法的测定结果进行比较，见表 4。本研究方法共有 18 份样品检出合成辣椒素，含量为 4.62 499.63 mgkg-1；GB/T 404382021方法共18份样品检出合成辣椒素，含量为 4.38 504.73 mgkg-1。有 2 份样品两种方法均未检出合成辣椒素。3结论与讨论剁辣椒、辣椒油、辣椒酱等是我国传统加工产品，在国内、国际市场上享有盛誉。辣椒引起辛辣感和热感的主要成分统称为类辣椒素，又名辣椒碱或辣椒辣素，是一种香草基胺的酰胺衍生物4。辣椒的辛辣程度是评价辣椒或辣椒制品品质的重要指标，辣度越高，说明辣椒素含量就越高，它已成为辣椒品种培育、产品评定、药效研究及出口等的重要指标5。随着人们对生活品质追求的不断提高，以辣椒为Nonivamide-6 Levels,6 Levels Used,6 Points,6 Points Used,0 QCsConcentration(ng/ml)-40-20020406080100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540Responses106-0.500.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.5y=110 99.989 272*x +261 05.749 062R2=0.99941110Type:Linear,Origin:Ignore,Weight:None 图 2合成辣椒素标准曲线表 4样品中合成辣椒素的测定结果样品本研究方法/（mgkg-1）GB/T 404382021 方法/（mgkg-1）135.7235.1828.758.84317.2917.444303.77306.8158.739.0564.624.387未检出未检出867.0865.96912.3011.9410108.35106.9411499.63504.73129.658.971324.8222.031411.0212.0915未检出未检出1692.4492.871723.6624.85186.226.341922.3822.95209.449.81Oct.2023 CHINA FOOD SAFETY 83分析检测原料的市售调味品种类越来越多，不排除某些商家以低劣辣椒为生产原料，添加合成辣椒素改善和提高辣椒制品的辣度，常加入以辣椒为主的调味品中，如方便食品酱料包、辣椒酱等。合成辣椒素在食品安全国家标准 食品添加剂使用标准（GB 27602014）中没有相关的使用规定，不在食品添加剂的使用范围内。2022 年实施标准植物源产品中辣椒素类物质的测定 液相色谱-质谱/质谱法（GB/T 403482021）中仅说明辣椒及其辣椒制品中辣椒素与二氢辣椒素占辣椒素类物质的90%左右，合成辣椒素（N-壬酸香草酰胺）未有明确的含量要求6。目前，国内学者测定合成辣椒素的方法有薄层层析法、红外光谱法、高效液相色谱法、荧光光谱法、高效液相色谱-串联质谱法等7。高效液相色谱-串联质谱法具有灵敏度高、操作简便和分离效果好等优点，广泛用于复杂体系中痕量成分的准确定量8。本研究采用高效液相色谱-串联质谱法对辣椒酱中合成辣椒素进行测定，结合 J2 Scientific PrepLinc 全自动样品前处理平台对样品进行前处理，同时与标准植物源产品中辣椒素类物质的测定 液相色谱-质谱/质谱法（GB/T 404382021）的方法进行对比。植物源产品中辣椒素类物质的测定 液相色谱-质谱/质谱法（GB/T 403482021）中规定的植物源产品中辣椒素类物质含量的测定方法样品前处理简单，而辣椒制品中基质复杂，无法有效去除色素、蛋白质、脂肪、糖类，色谱柱柱效下降快，柱压高，电喷雾离子源易被污染。J2 Scientific PrepLinc 全自动样品前处理平台，集 凝 胶 色 谱 柱（Gel Permeation Chromatography，GPC）功能、串联 C18等萃取柱实现净化（Solid Phase Extraction，SPE）功能以及在线定量浓缩（AccuVap）功能，在实验过程中可随意选择 PrepLinc GPC、PrepLinc SPE、PrepLinc GPC&AccuVap、PrepLinc SPE&AccuVap 等模式有机组合，来满足实验需求。J2 Scientific PrepLinc 全自动样品前处理平台的PrepLinc GPC 功能可以有效去除辣椒酱中色素、蛋白质、脂肪等干扰物质，AccuVap 功能可以实现样品前处理的无人化和自动化，在很大程度上提升了样品前处理的可靠性，以及结果测定的稳定性。本 研 究 结 果 显 示 合 成 辣 椒 素 的 检 出 限 为 0.08 mgkg-1，定量限为 0.40 mgkg-1；合成辣椒素在1.0 500.0 ngmL-1呈良好线性关系，相关系数为0.999 4，加标回收率在 73.8%97.5%，RSD 值为2.1%3.5%。对比 20 个样品的测定结果，本方法测定结果与 GB/T 403482021 方法测定结果基本一致，稳定性较好。全自动处理平台可实现无人化和自动化处理样品，比 GB/T 403482021 方法更有优势、更省时间、更高效。综上所述，采用高效液相色谱-串联质谱法结合全自动处理平台进行前处理，建立辣椒制品中合成辣椒素成分检测的方法，样品结果更稳定，效率高且结果准确，建立的方法简便快速，为百色辣椒酱的质量控制提供了一个更科学有效的方法。参考文献1 邓文溢,文江平.辣椒的化学成分与药理作用研究进展 J.湖北农业科学,2021,60(15):5-10.2 董彩军,李锋,卢国峰,等.辣椒及辣椒制品辣度分析研究进展 J.中国调味品,2016,41(12):142-146.3ARVAPALLY M,ASATI A,NAGENDLA N K,et al.Development of an analytical method for the quantitative determination of multi-class nutrients in different food matrices by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry using design of 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