第八章花药和花粉培养.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第八章花药和花粉培养,花粉与花药得培养,(,pollen and anther culture),就是指在人工合成培养基上,改变花粉得发育途径,使其不形成配子,而像体细胞一样进行分裂、分化,由单个花粉粒发育成完整单倍体植株得技术。,一、概念,异同点,:,相同点:二者培养得目得一样,都就是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞,最后发育成单倍体植株。,不同点:,花药培养属器官培养,花药就是植物花得雄性器官,包括体细胞性质得药壁与药隔组织,以及雄性性细胞得花粉粒;花粉培养属细胞培养。,花粉培养没有药壁组织干扰,可计数小孢子产胚率,可观察雄核发育得全过程。,单倍体产量高。,花粉培养技术更复杂,比花药培养难度大。,二、植物花药,/,花粉培养历史,Guha,与,Maheshwari,(,1964,)曼陀罗花药培养,Nitsch,与,Norreel(1973),烟草花粉培养(游离小孢子培养),Chu,(,1973,)小麦花粉培养,(早期花药培养主要依靠小孢子得自然胚胎发生产生单倍体,能自发形成胚胎发生得基因频率较低,效率极低),80,年代后期到,90,年代期间,花培技术迅速发展。许多作物小孢子培养已经成功。十字花科、麦类、水稻、玉米等。,90,年代,一些先前被认为就是不易进行小孢子培养得基因型也相续成功,Konzak(1999),。,通过花药培养育成得甜椒新品种:海花三号,三、花药与花粉培养得应用,1),诱导形成单倍体,快速获得纯系,缩短育种周期;,供体植株小孢子（,n,）,花培,花粉植株（,n,）,雄核发育,自然加倍,人工加倍,纯合植株,DH,（,2n,）,一年内获得纯系,常规育种需,4-6,年获得纯系,而小孢子培养仅需一年。,1,、作物育种,常规育种在杂交,F5,、,F6,代开始选择;花药培养在,F1,或,F2,代进行培养,再人工加倍处理、缩短育种周期,3-5,年,克服后代分离,大大缩短育种周期,花粉单倍体就是纯合配子体,从来源于配子体得植株中选择某一种基因型得概率就是,(1/2),n,而从常规杂交,F2,代群体中,选择某一基因型得概率为,(1/2),2n,故单倍体育种得选择效率为常规育种得,2n,倍。,2),提高目标基因型得选择效率,例子,:,二倍体供体植株基因型为,AaBb,若要从后代中选择基因为,AAbb,得纯合单株,常规方法:,AAbb,出现得概率为,1/16,并且不能将,AAbb,与,Aabb,、,aAbb,区分开。,AB,aB,Ab,ab,AB,AABBAaBBAABbAaBb,aB,aABBaaBB aABb aaBb,Ab,AabBAabBAAbbAabb,ab,aAbBaabB aAbb aabb,例子,:,二倍体供体植株基因型为,AaBb,若要从后代中选择基因为,AAbb,得纯合单株单倍体方法:,AAbb,出现得概率为,1/4,。,单倍体,二倍体,AB-,-,AABB,aB,-,aaBB,Ab,-,AAbb,ab-,aabb,供体亲本,AaBb,花培,从来源于配子体得植株中选择某一种基因型得概率就是,(1/2),n,而从常规杂交,F2,代群体中,选择某一基因型得概率为,(1/2),2n,故单倍体育种得选择效率为常规育种得,2n,倍。,大家有疑问的，可以询问和交流,可以互相讨论下，但要小声点,3),诱变育种中得作用,植株不受显隐性得影响,在诱变育种中能在当代及时获得突变个体,染色体加倍后成为稳定得纯系。,可探索亲本染色体组得构成。分析单倍体植物减数分裂时,形成二价体得数目与形状,能确定染色体组内就是否存在同源染色体。,2,、物种进化研究,单倍体植株中基因不受显隐性得影响,每一个基因得作用均能表现出来。能用来研究基因得性质及其作用。还可用于基因得剂量效应分析。,3,、,遗传分析,4,、构建连锁图谱,双单倍体,(,DH,),群体就是永久性群体,能有效地用于遗传图谱得构建。,能直接表达外源基因,不受显隐性影响。,5,、植物基因克隆筛选,第二节 花粉孢子体发育途径,概念,:,花粉孢子体发育途径(雄核发育途径),花粉就是产生花粉植株得原始细胞,其第一次有丝分裂,在本质上与合子得第一次孢子体分裂相似,把花粉形成植株得途径称为花粉孢子体发育途径,也叫雄核发育途径。,一、花粉发育得阶段,花粉离体培养时,雄核发育最适宜得时期一般就是第一次有丝分裂或之前,。,二、雄核发育途径,1,、,A,途径,小孢子第一次有丝分裂为非均等分裂,形成营养细胞与生殖细胞,(,1,),A-V,途径,由营养细胞重复分裂形成单倍体,(,2,),A-G,途径,由生殖细胞重复分裂形成单倍体,(,3,),A-VG,途径(,E,途径),由营养细胞与生殖细胞各自独立分裂,共同形成单倍体,(,4,),C,途径,营养细胞与生殖细胞通过核融合,形成多倍体植株,2,、,B,途径,小孢子第一次有丝分裂为均等分裂,形成大小相近得两个细胞。然后由这两细胞边续分裂形成单倍体植株,或者核融合形成多倍体植株,1,、胚状体发育途径,小孢子经历胚发生得各个阶段,最后子叶展开,形成花粉植株。,2,、愈伤组织发育途径,小孢子分裂数次形成愈伤,再分化形成花粉植株。此途径产生得植株会出现变异且倍性复杂。,三、花粉植株形态发生方式,胚状体发育途径,部分花药通过胚状体途径形成小植株,烟草花药培养,愈伤组织发育途径,部分花药产生愈伤组织,接种在平板上得水稻花药,水稻花药培养,愈伤组织转接种到再生培养基,愈伤组织分化形成再生植株,水稻花药培养,第三节花药与花粉培养方法,一、花药培养,二、花粉培养,三、白化苗现象,四、影响雄核发育与花粉花药培养得因素,一、花药培养,1,、取材,镜检,根据花粉得发育时期,选取大小适宜得花蕾。,2,、消毒,70,酒精擦洗花蕾表面,或,70,酒精浸泡,30-60s,后在,1,次氯酸钠溶液中浸泡,10-20min,或在,0、1,得氯化汞溶液中消毒,3-10min,无菌水冲洗,3-5,次,。,3,、培养,固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养,至小孢子大量分裂形成胚或愈伤,并突破花药壁表面,形成突出物(,2-3,周);后转入分化培养基培养,形成小植株,。,二、花粉培养,(,一,),花粉得分离与纯化,1,、自然散落法,(,漂浮培养散落小孢子收集法,),将花药接种在预处理液或液体培养基上,待花粉自动散落后,收集培养。,2,、挤压法,在烧杯或研钵中挤压花药,将花粉挤出后收集培养。,1,),磁搅拌法,用磁力搅拌器搅拌培养液中得花药,使花粉游离出来;,2,),超速旋切法,通过搅拌器中得高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药,使小孢子游离出来(此法应用最广)。,4,、小孢子纯化 对上述方法获得得小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子,3,、机械游离,梯度离心前,(小孢子形态、活力不一致),30%,蔗糖梯度离心后,(获得均一得小孢子群体),(,二,),花粉培养方式,1,、平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养。,2,、液体培养 花粉悬浮在液体培养基中培养,需震荡,以利通气。,3,、双层培养 花粉置固体,-,液体双层培养基上培养。,培养基制作方法:先铺一层琼脂固体培养基,凝固后,在表面加入少量液体培养基。,4,、瞧护培养,利用花药或花药愈伤组织释放出得活性物质促进花粉小孢子发育。用一块活跃生长得愈伤组织来瞧护单个细胞,并使其生长与增殖。这个愈伤组织块称为瞧护愈伤组织。,1,)在一个培养瓶中加入一定量厚得固体培养基,灭菌后备用。,2,)在无菌条件下,将一小块(,1cm,3,)活跃生长得愈伤组织接种到培养基上,再在愈伤组织块上放一片(,1cm,)已灭菌得滤纸,放置过夜。,3,)将分离得花粉接种到已经充分吸收愈伤组织渗透液得滤纸上。,4,)单细胞分裂形成肉眼可见得小细胞团后,即转移到新鲜培养基上培养,恒温培养,得到单细胞无性系。,具体方法,2、,5,、微室培养,利用小得盖玻片与凹穴载玻片形成微室进行花粉培养。,6,、条件培养基培养,利用培养过花药得液体培养基或含失活花药提取物得培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等,。,花粉培养过程,取花蕾（镜检）,预培养数天,取花药,消毒,分离花粉,接种,培养,愈伤组织发生,三、白化苗现象,(一)白化苗产生得影响因素及机理,1,、内因,供体植株基因型(如籼稻比粳稻白苗率高)、花粉发育时期。,2,、外因,预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件与方法、愈伤组织转分化时间等。,3,、机理,核基因起关键作用,导致质体,DNA,缺失,产生白苗。另外地、无性系变异也可能就是原因之一。,(二)白化苗得控制,通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控。,四、影响雄核发育与花粉花药培养得因素,(一)基因型,植物基因型就是影响雄核发育得最重要得因素之一。同一物种中得不同基因型对小孢子离体诱导反应差异较大。,如在水稻中,籼稻花粉培养力远低于糯稻。,小孢子发育时期对诱导雄核发育非常重要。,(二)花粉发育时期,适宜时期:单核期,尤其就是单核中、晚期,(,单核靠边期,),芸苔属植物,Brassica napus,不同基因型得小孢子产胚率比较,Topas,10,000-200,000 1-20,Westar 1000-10,000 0、1-1,Delta 100-10,000 0、01-1,Bounty 10-100 0、001-0、01,基因型胚状体数量,/106,小孢子 成苗率(,%,),1,、植株生长条件,光温等因素均能影响花药培养力。一般,处于适宜生长条件(如温室中)较好。但物种间存在差异。,2,、植株生长时期,一般就是开花始期优于开花末期。,3,、,P,花粉得频率,不同温度、日照时数、氮饥饿及生长物质处理提高,P,花粉得数量,(三)供体植株生长条件与生理状态,随着细胞体积迅速增大,细胞核由中央位置推向一边,即单核靠边期。,雄配子体的发育,营养细胞,生殖细胞,精子,四分体,:,醋酸洋红染色,四分体,:Alexanders,染色,单核期,双核期,成熟花粉粒,处于不同发育时期得烟草小孢子,单核晚期,液泡,第一次有丝分裂后期,双核早期,双核中期,生殖核,生殖核,营养核,一般而言,单核期(第一次有丝分裂前)对诱导反应最敏感,为最佳培养期。,形成双核后,在合适得条件,主要由营养细胞分裂产生胚状体。,不同物种诱导胚胎发生得最佳小孢子发育时期,发育时期,物种,减数分裂期,草莓、番茄,四分孢子期,葡萄,单核早中期,石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯,单核晚期,荔枝、茄子、青椒、小麦,单核早期至晚期,烟草,单核早期至双核期,梨、水稻、甘蓝,四分孢子期至双核期,玉米,对不同发育阶段得花药进行培养测试,确定最佳小孢子发育时期得形态特征,注意形态特征会因品种、发育状态、环境条件得变化而发生变化,处于不同发育阶段的烟草花芽,花粉发育时期得确定,单核期得确定,:,根据细胞观察推测,双核期得花粉中开始积累淀粉,不能使花粉发育成植株。通常采用醋酸洋红或碘化钾染色,再压片镜检,以确定花粉得发育时期。,但就是接种前不可能把所有得花粉都进行一次发育时期得镜检,通常就是按照花蕾长度大小与花粉发育年龄得相关性,实际操作中取一定大小得花蕾进行得。,A、,通过显微镜下观察确定小孢子发育时期,醋酸洋红,染色,DAPI,染色,B、,通过花蕾外部特征确定小孢子发育时期,花蕾得外部形态特征与小孢子得发育时期有一定得相关性,花蕾萼裂基部与花冠顶部之差可以作为判断小孢子发育时期得基本指标。,2,、化学物质处理,包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进行处理。甘露醇仅能维持渗透压,不能提供碳源,其主要原理就是造成小孢子营养饥饿,从而使小孢子去分化,。,3,、其它,包括,射线、离心、磁场等,。,预处理方法:,1,、高低温处理,(四)培养基,1、,基本培养基,主要为,N6,与,MS,培养基。,MS,与,H,培养基:适合双子叶植物花药培养;,B5,培养基:适合豆科与十字花科花药培养;,N6,培养基:适合禾谷类作物得花药培养。,Nitsch,培养基,:,适合芸薹属与曼陀罗属。,高浓度得,NH4,+,显著抑制花粉愈伤组织形成。,铁盐对花粉胚状体发育很重要。活性炭促进胚状体发育,。,包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。,不同作物所需最适得碳源种类及浓度得所差异。,在辣椒花药培养中以,6%,得蔗糖浓度对胚状体得诱导率为最高。,在番茄花药培养中需要量高达,14,。,其原因就是花粉母细胞得渗透压比花丝等体细胞高得缘故,即高浓度得蔗糖不利于药壁、花丝等体细胞得生长,而利于花粉得生长。,一般认为单子叶植物比双子叶植物需糖得浓度要高。,玉米中蔗糖效果最好;而麦类作物中,麦芽糖似乎为最好得碳源。,较高,浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织;,较低,浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗。,2、,碳源,3,、激素,细胞分裂素可促进胚状体形成;,生长素可诱导愈伤组织形成。,细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化苗,4,、氨基酸,5,、活性碳,6,、,pH,(五)培养条件,1,、温度,物种间有差异,培养温度在,25,28,左右,2,、光照,光暗交替培养,每天,12,18h,得光照,光照强度,2000,10000lx,。,3,、植板密度,植板密度与花培效率有很大得相关性。,510,3,到,210,4,ml,密度均能有效培养。一般来说,足够数量得、但相对低密度得小孢子浓度有利于小孢子竞争营养、氧气、细胞分裂得空间,从则有利于胚状体发生。,