超高效液相色谱-串联质谱法检测绵羊组织中地昔尼尔残留的方法学研究.pdf

中国畜牧兽医 ,():C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y&V e t e r i n a r yM e d i c i n e超高效液相色谱串联质谱法检测绵羊组织中地昔尼尔残留的方法学研究仇亚伟,季辉,彭麟,江善祥,高修歌(南京农业大学动物医学院,南京 )摘要:【目的】建立一种绵羊组织中地昔尼尔及其代谢产物,三氨基 氰基嘧啶质量浓度的超高效液相色谱串联质谱(U P L C M S/M S)检测方法.【方法】对采集的绵羊肌肉、脂肪、肝脏、肾脏组织进行前处理,以乙腈和七氟丁酸水溶液为流动相,利用A c q u i t yU P L CB e hC 色谱柱进行梯度洗脱;流速为 m L/m i n,柱温为,进样量为L.在正离子扫描模式下通过多离子反应监测采集数据,采用外标法测定地昔尼尔及其代谢产物浓度,并考察该检测方法的线性范围、检测限、定量限、回收率、批内与批间精密度、准确度和稳定性.【结果】建立的检测方法灵敏度高,检测限为 g/k g,定量限为 g/k g,地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧啶的添加浓度为 g/k g,标准曲线的线性关系良好,相关系数均 .将地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧啶以高、中、低、定量限个水平分别添加到各空白组织中,测得地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧啶的回收率为 ,批内和批间变异系数均.在考察的条件下,地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧在各组织中的稳定性良好.【结论】建立的U P L C M S/M S检测方法专属性强、重复性好、灵敏度高,可适用于地昔尼尔乳剂在绵羊组织内的药物代谢动力学和残留研究.关键词:地昔尼尔;,三氨基 氰基嘧啶;超高效液相色谱串联质谱法;绵羊中图分类号:S 文献标识码:AD o i:/j c n k i 开放科学(资源服务)标识码(O S I D):收稿日期:基金项目:中央高校基本科研业务费项目(K J QN );江苏省研究生实践创新计划(S J C X _ )联系方式:仇亚伟,E m a i l:q i u y a w e i n j a u e d u c n.通信作者江善祥,E m a i l:n a u v y s i n a c o m;高修歌,E m a i l:v e t g a o n j a u e d u c nM e t h o d o l o g yS t u d yo nD e t e r m i n a t i o no fD i c y c l a n i lR e s i d u a l i nS h e e pT i s s u eb yU l t r a p e r f o r m a n c eL i q u i dC h r o m a t o g r a p h y t a n d e m M a s sS p e c t r o m e t r yQ I UY a w e i,J IH u i,P E NGL i n,J I ANGS h a n x i a n g,GAOX i u g e(C o l l e g e o fV e t e r i n a r yM e d i c i n e,N a n j i n gA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,N a n j i n g ,C h i n a)A b s t r a c t:【O b j e c t i v e】T h i ss t u d yw a sc o n s t r u c t e dt oe s t a b l i s ham e t h o df o r t h ed e t e r m i n a t i o no ft h em a s s c o n c e n t r a t i o no f d i c y c l a n i l a n d i t sm e t a b o l i t e s,t r i a m i n o p y r i m i d i n e c a r b o n i t r i l e i ns h e e pt i s s u eb yu l t r a h i g hl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t a n d e m m a s ss p e c t r o m e t r y(U P L C M S/M S)【M e t h o d】S h e e pt i s s u e s(m u s c l e,f a t,l i v e ra n d k i d n e y)w e r e p r e t r e a t e d A c e t o n i t r i l ea n dh e p t a f l u o r o b u t y r i ca c i da q u e o u ss o l u t i o nw e r eu s e da sm o b i l ep h a s e s,A c q u i t y U P L CB e hC c o l u m nw a su s e df o rg r a d i e n te l u t i o n T h ef l o wr a t ew a s m L/m i n,t h ec o l u m nt e m p e r a t u r ew a s a n dt h ei n j e c t i o n v o l u m e w a sL T h ed a t a w e r ec o l l e c t e d b y m u l t i r e a c t i o nm o n i t o r i n g i np o s i t i v e i o ns c a n n i n gm o d e,a n dt h ec o n c e n t r a t i o n so fd i c y c l a n i l a n d i t sm e t a b o l i t e sw e r ed e t e r m i n e db ye x t e r n a l s t a n d a r dm e t h o d T h e l i n e a r r a n g e,d e t e c t i o n l i m i t,q u a n t i t a t i v e l i m i t,r e c o v e r yr a t e,i n t r a a s s a ya n di n t e r a s s a yp r e c i s i o n,a c c u r a c ya n ds t a b i l i t yo ft h e m e t h o d w e r ei n v e s t i g a t e d【R e s u l t】T h ee s t a b l i s h e dd e t e c t i o nm e t h o dh a dh i g hs e n s i t i v i t y,t h ed e t e c t i o nl i m i tw a s g/k g,a n dt h el i m i to fq u a n t i t a t i o n w a s g/k g T h ea d d i t i o nc o n c e n t r a t i o n so f中国畜牧兽医 卷d i c y c l a n i l a n d,t r i a m i n o p y r i m i d i n e c a r b o n i t r i l ew e r e i nt h e r a n g eo f t o g/k g,a n dt h e l i n e a r r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h es t a n d a r dc u r v e sw a sg o o d,w i t hc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t s T h er e c o v e r i e so f d i c y c l a n i l a n d,t r i a m i n o p y r i m i d i n e c a r b o n i t r i l ew e r e t o w h e n t h e yw e r ea d d e dt ot h eb l a n kt i s s u e sa th i g h,m e d i u m,l o wa n dl i m i t e dq u a n t i f i c a t i o nl e v e l s,a n dt h ec o e f f i c i e n to fv a r i a t i o nw i t h i na n db e t w e e nb a t c h e sw a s l e s s t h a n T h es t a b i l i t yo fd i c y c l a n i la n d,t r i a m i n o p y r i m i d i n e c a r b o n i t r i l e i nd i f f e r e n t t i s s u e sw a sg o o du n d e r t h ec o n d i t i o n so fi n v e s t i g a t i o n【C o n c l u s i o n】T h ee s t a b l i s h e dU P L C M S/M Sa s s a yw a ss p e c i f i c,r e p r o d u c i b l ea n ds e n s i t i v e,a n dc o u l db eu s e df o rp h a r m a c o k i n e t i ca n dr e s i d u a ls t u d i e so fd i c y c l a n i le m u l s i o ni ns h e e pt i s s u e s K e yw o r d s:d i c y c l a n i l;,t r i a m i n o p y r i m i d i n e c a r b o n i t r i l e;U P L C M S/M S;s h e e p地昔尼尔又名丙虫啶,是一种嘧啶衍生的昆虫生长调节剂.最早于 年由汽巴嘉基公司(现为诺华公司)提出,年地昔尼尔浇泼剂在澳大利亚首次上市,商品名为C l i k,靶动物为绵羊.地昔尼尔对双翅目昆虫和蚤有高度杀灭作用,主要用于预防蝇蛆病和阻止双翅目昆虫和蚤的幼虫发育成蛹虫、成虫 .目前诺华公司上市的种制剂,分别为C l i k、C L I K Z i N和C L I KP l u s,主要用于绵羊体表寄生虫的防治.G i f f o r d等报道了在绵羊体内 C标记的地昔尼尔残留研究,约通过皮肤吸收,给药后d残留在动物体内的药物 通过粪便排出、通过尿液排出;M a c l e a n等发现地昔尼尔给药后d内约药物被机体吸收;A n d e r s o n等研究报道,给药后 d内,共计约地昔尼尔被吸收,残留标记物在体内广泛分布,给药处的皮下脂肪中药物浓度最高.欧洲药品管理局(EME A)报道的地昔尼尔残留标识物为地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧啶,规定了其在绵羊各组织中的最高残留限量(MR L):肌肉 g/k g、脂肪 g/k g、肝脏 g/k g、肾脏 g/k g.目前国内有单独检测地昔尼尔残留的报道,但有关地昔尼尔残留标识物在绵羊组织中的残留检测研究却鲜见报道.因此,本研究拟采用超高效液相色谱串联质谱(U P L C M S/M S)方法检测绵羊组织中地昔尼尔的药物残留,以期为地昔尼尔的临床使用提供参考,并为制定给药方案及合理制定休药期提供参考依据.材料与方法 样品与主要试剂绵羊空白肌肉、脂肪、肝脏、肾脏组织样品,采自扬州申通畜牧养殖有限公司.地昔尼尔对照品(批号:S Z B B X V,)购自S i g m a公司;,三氨基 氰基嘧啶对照品(批号:,)购 自W i t e g a公 司;乙 腈(批 号:L O T ,色 谱 级)、甲 醇(批 号:L O T ,色谱级)均购自T E D I A公司;无水硫酸钠(批号:,)购自国药集团化学试剂有 限 公 司;七 氟 丁 酸(批 号:H ,)购自A l a d d i n公司.主要仪器液相 色 谱串 联 质 谱 仪(X e v o T Q D)、O a s i sMC X固相萃取柱(m g/m L)均购自W a t e r s公司;低温高速离心机(K 型)购自S i g m a公司;匀浆机(I KA T B S )购 自I KA公 司;氮 吹 仪(D C H型)购自上海安谱科学仪器有限公司;通道固相萃取装置(S P E D)购自上海熙扬仪器有限公司.标准溶液配制精确称取地昔尼尔对照品 g,于 m L容量瓶中,用 乙腈溶液溶解并稀释至刻度,得 g/m L地昔尼尔标准储备液.再准确量取地昔尼 尔 标 准 储 备 液,用 乙 腈 溶 液 稀 释 成 g/m L,即为地昔尼尔标准工作液.精确 称 取,三 氨 基 氰 基 嘧 啶 对 照 品 g,于 m L容量瓶中,用 乙腈溶液溶解并稀释至刻度,得 g/m L,三氨基 氰基嘧啶标准储备液.再准确量取,三氨基 氰基嘧啶标准储备液,用 乙腈溶液稀释成 g/m L,即为,三氨基 氰基嘧啶标准工作液.样品前处理 提取分别称取绵羊肌肉、脂肪、肝脏、肾脏空白组织()g,放入 m L离心管中,加g无 水 硫 酸 钠,再 加 入 m L乙 腈,均 质 器 r/m i n均质 m i n,涡 旋 混 匀 m i n,超 声 m i n,r/m i n离心m i n.取上清液,倒入期仇亚伟等:超高效液相色谱串联质谱法检测绵羊组织中地昔尼尔残留的方法学研究 m L离心管中.残渣用 m L乙腈溶液再次提取,合并次提取液,水浴条件下以氮气吹至近干.残余物加入 m L水复溶,涡旋混匀m i n,r/m i n离心m i n,上清液待净化.净化O a s i sMC X固相萃取柱依次用m L甲醇、m L水淋洗活化,加入 m L待净化样品液上样过柱,依次用m L水、m L甲醇淋洗,弃去流出液,抽干,再用m L氨水甲醇溶液洗脱,用 m L试管收集洗脱液,整个净化过程控制流速m L/m i n.洗脱液于 水浴中以氮气吹干,残 余 物 用 m L流 动 相 溶 解,涡 旋 混 匀,过 m滤膜,供U P L C M S/M S测定.液相色谱工作条件色谱柱:A c q u i t yU P L CB e hC (mm mm,m);流动相A为乙腈,流动相B为 mm o l/L七氟丁酸水溶液,梯度洗脱条件见表;进样量为L;柱温为.表梯度洗脱条件T a b l eT h ec o n d i t i o no f g r a d i e n t e l u t i o n时间T i m e/m i n流速S p e e d/(m L/m i n)A/B/质谱条件电喷雾离子源(E S I),正离子扫描,采用多反应离子监测模式进行检测;电离电压为 k V;离子源温度为 ;雾化温度为 ;锥孔气流速为 L/h;雾化气流速为 L/h;质谱调谐结果见表.表质谱调谐结果T a b l eT h e r e s u l t o fm a s s s p e c t r u mt u n i n g药物D r u g s定性离子对Q u a l i t a t i v e i o np a i r/(m/z)定量离子对Q u a n t i t a t i v e i o np a i r/(m/z)锥孔电压C o n eh o l ev o l t a g e/V碰撞能量C o l l i s i o ne n e r g y/e V地昔尼尔 D i c y c l a n i l ,三氨基 氰基嘧啶 ,t r i a m i n o p y r i m i d i n e c a r b o n i t r i l e 方法学验证参照中华人民共和国农业农村部公告第 号和 进出口动物源性食品中地昔尼尔残留量检测方法 液相色谱质谱/质谱法(S N/T ),对地昔尼尔及其代谢产物,三氨基 氰基嘧啶的U P L C M S/M S法进行方法学考察.专属性本试验为验证待测药物在出峰时间处无杂质干扰,收集不同来源的空白绵羊组织,按 法进行操作后检测,通过与标准溶液、空白组织添加色谱图进行比较,观察待测药物在保留时间处有无干扰,以此判定该方法的专属性.检测限和定量限将适量地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧啶标准工作溶液添加于g空白组织中,配制成不同浓度的组织样品,按 方法处理后供U P L C M S/M S检测,测定药物定量离子的色谱峰信噪比,取信噪比(S/N)时的添加浓度为检测限(L O D);以S/N 为参考,并结合回收率试验结果确定定量限(L OQ).基质匹配标准曲线的制备精确称取各空白组织g,按照 方法操作,制备空白基质溶液,按照表的药物添加浓度分别将地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧啶标准溶液添加到各空白基中国畜牧兽医 卷质溶液中,涡旋混匀,过 m滤膜,每个浓度个平行样品,进样检测,记录色谱图,得峰面积(A),以A为纵坐标,对应的药物添加浓度(C)为横坐标,分别得到不同组织样品的回归方程.表各组织基质匹配标准曲线药物添加浓度T a b l eD r u ga d d i t i o nc o n c e n t r a t i o no fm a t r im a t c h e ds t a n d a r dc u r e i ne a c ht i s s u e组织T i s s u e s浓度C o n c e n t r a t i o n/(g/k g)肌肉M u s c l e 脂肪F a t 肝脏L i v e r 肾脏K i d n e y 准确度和精确度通过添加回收试验验证方法的准确度与精密度,用相对回收率和相对标准偏差来评价方法的准确度和精密度.精确称取各空白组 织g,匀 浆,准 确 添 加 适 量 的 昔 尼 尔 和,三氨基 氰基嘧啶标准溶液,使组织中待测药物浓度分别为定量限、低、中、高个浓度(具体添加浓度见表),按 方法处理后进行检测,每个浓度个平行样品,进行批单独试验,测定回收率,并计算批内和批间的相对标准偏差(R S D).表各组织待测药物回收率添加浓度T a b l eA d d e dc o n c e n t r a t i o no fd r u gr e c o v e r y t ob em e a s u r e d i ne a c ht i s s u e组织T i s s u e s浓度C o n c e n t r a t i o n/(g/k g)定量限L OQ低L o w中M i d d l e高H i g h肌肉M u s c l e 脂肪F a t 肝脏L i v e r 肾脏K i d n e y 稳定性将地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧啶标准溶液加入空白组织中制备低、中、高个浓度组织样品,每个浓度个平行,添加浓度见表,按 方法处理后检测.分别考察组织样品室温放置h、组织样品反复冻融次、组织样品放置于 冻存 d、样品前处理后室温放置 h的稳定性.表各组织待测药品稳定性添加浓度T a b l eA d d e dc o n c e n t r a t i o no fd r u g s t a b i l i t y t ob em e a s u r e d i ne a c ht i s s u e组织T i s s u e s浓度C o n c e n t r a t i o n/(g/k g)低L o w中M i d d l e高H i g h肌肉M u s c l e 脂肪F a t 肝脏L i v e r 肾脏K i d n e y 数据统计分析本试验采用基质匹配标准曲线对实际样品中的地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧啶浓度进行定量,所有数据采用E x c e l进行整理分析.结果 专属性对地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧啶标准溶液(图)、空白组织(图)和空白组织添加药物(图)进 行 处 理 并 检 测,结 果 显 示,地 昔 尼 尔 和期仇亚伟等:超高效液相色谱串联质谱法检测绵羊组织中地昔尼尔残留的方法学研究,三氨基 氰基嘧啶在该试验条件下分离效果好,组织中其他生物基质在其出峰位置无干扰,地昔尼尔的保留时间为 m i n左右,三氨基 氰基嘧啶的保留时间为 m i n左右,且基质对目标物的分离无明显干扰,表明该方法分离度和专属性良好.图地昔尼尔(A)和,三氨基 氰基嘧啶(B)标准溶液的色谱图(n g/m L)F i g C h r o m a t o g r a mo f t h e s t a n d a r ds o l u t i o no fd i c y c l a n i l(A)a n d,t r i a m i n o p y r i m i d i n e c a r b o n i t r i l e(B)(n g/m L)图地昔尼尔(A)和,三氨基 氰基嘧啶(B)空白组织的代表性色谱图F i g C h r o m a t o g r a mo f t h eb l a n kt i s s u eo fd i c y c l a n i l(A)a n d,t r i a m i n o p y r i m i d i n e c a r b o n i t r i l e(B)图空白组织添加地昔尼尔(A)和,三氨基 氰基嘧啶(B)的色谱图(g/k g)F i g C h r o m a t o g r a mo fb l a n kt i s s u e s p i k e dw i t hd i c y c l a n i l(A)a n d,t r i a m i n o p y r i m i d i n e c a r b o n i t r i l e(B)(g/k g)中国畜牧兽医 卷 定量限和检测限以S/N为L O D,结果显示各组织中药物的L O D为 g/k g;以S/N 作为L OQ,各组织中药物的L OQ为 g/k g.基质匹配标准曲线由表可知,测定肌肉、脂肪、肝脏、肾脏组织样品中地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧啶浓度,绘制标准曲线方程,结果显示,各组织中药物浓度在 g/k g范围内时,线性关系良好.表各组织中地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧啶的标准曲线及相关系数T a b l eS t a n d a r dc u r v e sa n dc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t so fd i c y c l a n i l a n d,t r i s a m i n o p y r i m i d i n e c a r b o n i t r i l e i ne a c ht i s s u e组织T i s s u e s线性范围L i n e a r i t yr a n g e/(g/k g)地昔尼尔D i c y c l a n i l,三氨基 氰基嘧啶,t r i a m i n o p y r i m i d i n e c a r b o n i t r i l e标准曲线方程R S D标准曲线方程R S D肌肉M u s c l e A C R A C R 脂肪F a t A C R A C R 肝脏L i v e r A C R A C R 肾脏K i d n e y A C R A C R 准确度和精密度由表可知,各组织药物添加浓度为 g/k g时回收率均在 ,其余添加浓度的回收率均在 ,批内和批间精密度的变异系数均,符合残留检测要求.表地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧啶在各组织中的准确度与精密度T a b l eA c c u r a c ya n dp r e c i s i o no fd i c y c l a n i l a n d,t r i a m i n o p y r i m i d i n e c a r b o n i t r i l e i ne a c ht i s s u e组织T i s s u e s添加浓度A d d e dc o n c e n t r a t i o n/(g/k g)地昔尼尔D i c y c l a n i l,三氨基 氰基嘧啶,t r i a m i n o p y r i m i d i n e c a r b o n i t r i l e回收率R e c o v e r y批内I n t r a a s s a y批间I n t e r a s s a y回收率R e c o v e r y批内I n t r a a s s a y批间I n t e r a s s a y肌肉 M u s c l e 脂肪 F a t 肝脏 L i v e r 肾脏 K i d n e y 稳定性组织样品室温放置h、反复冻融次、放置于 冻存 d、样品前处理后室温放置 h的稳定性考察结果见表、,结果表明待测药物添加期仇亚伟等:超高效液相色谱串联质谱法检测绵羊组织中地昔尼尔残留的方法学研究回收率为 ,精密度均,表明各组织中地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧啶在上述条件下均保持稳定.表地昔尼尔在各组织中不同条件下稳定性T a b l eT h e s t a b i l i t yo fd i c y c l a n i l u n d e rd i f f e r e n t c o n d i t i o n s i ne a c ht i s s u e组织T i s s u e s添加浓度C o n c e n t r a t i o n/(g/k g)室温hR o o mt e m p e r a t u r ef o rh反复冻融次R e p e a t e df r e e z i n ga n dt h a w i n gf o rt i m e s 冻存 dF r o z e na t f o r d a y s前处理后室温 hA f t e rp r e t r e a t m e n t,r o o mt e m p e r a t u r e f o r h平均回收率P e r c e n tr e c o v e r y精密度P r e c i s i o n平均回收率P e r c e n tr e c o v e r y精密度P r e c i s i o n平均回收率P e r c e n tr e c o v e r y精密度P r e c i s i o n平均回收率P e r c e n tr e c o v e r y精密度P r e c i s i o n肌肉 M u s c l e 脂肪 F a t 肝脏 L i v e r 肾脏 K i d n e y 表,三氨基 氰基嘧啶在各组织中不同条件下稳定性T a b l eT h e s t a b i l i t yo f,t r i a m i n o p y r i m i d i n e c a r b o n i t r i l eu n d e rd i f f e r e n t c o n d i t i o n s i ne a c ht i s s u e组织T i s s u e s添加浓度C o n c e n t r a t i o n/(g/k g)室温hR o o mt e m p e r a t u r ef o rh反复冻融次R e p e a t e df r e e z i n ga n dt h a w i n gf o rt i m e s 冻存 dF r o z e na t f o r d a y s前处理后室温 hA f t e rp r e t r e a t m e n t,r o o mt e m p e r a t u r e f o r h平均回收率P e r c e n tr e c o v e r y精密度P r e c i s i o n平均回收率P e r c e n tr e c o v e r y精密度P r e c i s i o n平均回收率P e r c e n tr e c o v e r y精密度P r e c i s i o n平均回收率P e r c e n tr e c o v e r y精密度P r e c i s i o n肌肉 M u s c l e 脂肪 F a t 肝脏 L i v e r 肾脏 K i d n e y 中国畜牧兽医 卷讨论地昔尼尔作为一种新型的用于预防蚊蝇的浇泼药物制剂,在农业生产中应用十分广泛.但该药物及其代谢产物的检测方法研究仍不够全面和系统.本研究参考现有的检测方法,对地昔尼尔在绵羊组织中残留检测方法进行了优化,并检测了地昔尼尔代谢产物,三氨基 氰基嘧啶组织残留.提取和净化条件的选择与优化研究发现,乙腈可用于提取动物组织中的地昔尼尔 ,但关于组织中,三氨基 氰基嘧啶提取的研究鲜见报道.吴海霞等建立了高效液相色谱法测定动物性食品中的地昔尼尔残留量,采用乙腈作为提取剂,但仅是对单一的地昔尼尔进行提取.研究表明,乙腈适用于极性范围较大的农药残留检测,因为其具有渗透性强、与动物组织相容性较好的特点,具有沉淀蛋白和脱脂的作用,可以使待测药物与蛋白质达到较完全分离状态,中国发布的多个检测标准中同样选择了乙腈作为农药残留分析的提取剂 .因此本试验采用乙腈对地昔尼尔及其代谢产物,三氨基 氰基嘧啶进行提取,结果表明各组织药物添加浓度为 g/k g时回收率均在 ,其 余 添 加 浓 度 的 回 收 率 均 在 ,回收率符合残留检测要求.虽然乙腈有较好的提取效果,但是提取液中仍然会有一些内源性物质一同被提取出,从而产生干扰,如脂肪、色素类杂质等.为了得到干净的上样液,试验选用固相萃取柱(S P E)进行净化.参照文献 报道,本试验前期考察了种S P E柱(O a s i sHL B和O a s i sMC X)的净化效果.HL B固相萃取柱是基于“N 乙烯吡咯烷酮二乙烯基苯聚合物”填料的反相复合填料,试验发现,采用HL B固相萃取柱净化时效果并不理想,虽然地昔尼尔的添加回收率重复性比较好,但,三氨基 氰基嘧啶的添加回收率仅为 左右,推测,三氨基 氰基嘧啶作为地昔尼尔在动物体内的代谢产物,很有可能会溶解在脂肪组织中,在正己烷除脂这一过程中会损失很大一部分.具体原因仍有待进一步探究.相比于HL B柱,MC X固相萃取柱在地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧啶的回收率和重复性方面效果较好.提取液直接转入活化的MC X柱,填充物充分对药物进行吸附,从而保证了试验的回收率和重复性.淋洗过程中使用了甲醇,其可以除掉吸附在MC X柱上的脂肪,但药物不会被洗脱.相比于现行的行业检测标准,本研究省去了提取过程中正己烷除脂的步骤,大大缩短了提取和净化时间.因此试验中选择了MC X固相萃取柱用于试验样品的净化.但由于提取液中杂质较多,容易堵塞柱内初层滤膜,在过柱环节用时较长,该方法仍然有待改进.流动相的选择与优化流动相的组成与配比、梯度洗脱条件不仅影响待测药物的色谱结果,还影响待测药物的离子化效率和灵敏度.本试验同时对地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧啶进行检测,因此对流动相的选择更为严苛,前期试验使用了常用的液质分析的流动相体系,如乙腈和甲酸溶液、乙腈和水等 ,得到的色谱图峰型较差.在考察的过程中,向乙腈和水的流动相体系中加入了适量的七氟丁酸,七氟丁酸作为流动相的改性剂,改善了峰型,还延长了待测药物在色谱柱上的保留时间.通过梯度洗脱改变流动相的比例使地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧啶种待测药物的出峰时间错开,也缩短了样品的运行时间,最终实现地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧啶在m i n内出峰.本研究建立的地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧啶测定方法,其操作简便易行,快速准确,且重复性 好,适 用 于 检 测 绵 羊 各 组 织 中 地 昔 尼 尔 和,三氨基 氰基嘧啶浓度的检测.结论本试验通过对提取、净化和流动相条件的优化,建立了检测绵羊各组织中地昔尼尔和,三氨基 氰基嘧啶的U P L C M S/M S法,且对该方法进行了方法学验证,在 g/k g线性范围内,线性 关 系 良 好;检 测 限 和 定 量 限 分 别 为 和 g/k g;待测药物的准确度、精密度和稳定性均符合检测要求.参考文献(R e f e r e n c e s):S CHM I DH R,TU L D E RGV,J UNQU E R AP F i e l de f f i c a c yo ft h ei n s e c tg r o w t hr e g u l a t o rd i c y c l a n i lf o rf l y s t r i k ep r e v e n t i o no nl a m b sJV e t e r i n a r yP a r a s i t o l o g y,():詹希美人体寄生虫学M北京:人民卫生出版社,Z HAN X MH u m a n P a r a s i t o l o g yMB e i j i n g:P e o p l es M e d i c a l P u b l i s h i n g H o u s e,(i nC h i n e s e)S A L E S N,S UANN M,K O E F O R D KD i c y c l a n i l期仇亚伟等:超高效液相色谱串联质谱法检测绵羊组织中地昔尼尔残留的方法学研究r e s i s t a n c ei nt h e A u s t r a l i a ns h e e p b l o w f l y,L u c i l i ac u p r i n a,s u b s t a n t i a l l yr e d u c e sf l y s t r i k ep r o t e c t i o nb yd i c y c l a n i l a n dc y r o m a z i n eb a s e dp r o d u c t sJI n t e r n a t i o n a lJ o u r n a lf o rP a r a s i t o l o g y:D r u g sa n dD r u gR e s i s t a n c e,:G I F F O R D L J,D UN S I R E J P A b s o r p t i o n,d i s t r i b u t i o n,a n de x c r e t i o no f CP y r i m i d y lC GA a f t e rt o p i c a la d m i n i s t r a t i o nt os h e e pRR e p o r tN o ,I n v e r e s k R e s e a r c hI n t e r n a t i o n a l,T r e n e n t,S c o t l a n d,MA C L E AN C L,DUN S I R E J PA b s o r p t i o n,d i s t r i b u t i o n,a n de x c r e t i o no f CP y r i m i d y lC GA a f t e rp o u r o na d m i n