第四章-克隆载体.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程的基本程序及研究策略,目的基因的制备,(donor DNA),载体,DNA,及其改造,(Vector DNA),体外,DNA,重组,(DNA recombination),重组,DNA,的转化,(Transformation),重,组体的筛选鉴定与克隆扩增,(identification&clone amplification),目的,DNA,在受体细胞中的表达,(gene expression),基因工程的目的,基因克隆,-,获得目的基因,基因表达,-,使受体的新性状表现，获得大量目的蛋白,In vivo expression,In vitro expression,载体,-,基因工程中的重要工具,载体,(vector),：携带外源,DNA,进入宿主细胞的工具,载体的功能,1.,运送外源基因高效转入受体细胞,2.,为外源基因提供,复制,能力或,整合,能力,3.,为外源基因的扩增或表达提供条件,第一节 概述,introduction,一、概念,克隆载体（,cloning vector),：用于携带目的基因（外源基因）进入受体细胞进行复制、扩增的工具。,二、特点,(vectors which are used in genetic engineering should:),1,、能独立复制，具有,复制子,（,replican,),replican,：基因组中能独立复制的最小单位，含,复制起始点,(ori),和复制终点。,DNA,的复制由,ori,控制,原核细胞的染色体和质粒有固定的,ori,真核细胞的染色体有多个,ori,按复制起点划分克隆载体,质粒复制型,复制起点来自质粒,ARS,复制型,ARS,（,autonomus replicative sequence),，或称染色体复制型,病毒复制型,复制起点来自病毒,混合复制型,同种生物复制起点混合,质粒形式存在；质粒或病毒形式存在,不同生物复制起点混合,穿梭载体,（,shuttle vector,）两种生物中均以质粒形式存在；在一种生物中以质粒形式存在，在另一种生物中以质粒或病毒形式存在,复制起点种类与拷贝数间的关系,1),质粒复制起点类型,：,低拷贝（,严紧型,，,1-2 copies,，受宿主染色体基因控制）,高拷贝（,松弛型,，,20 copies,，受宿主染色体控制较弱）,2)ARS,型载体,：拷贝数较高（约,20 copies,）,3),病毒型复制起点,：高拷贝,2,、属于,松弛型复制子,(,relaxed plasmid,),3,、具有,复制非必需区,4,、有一个或多个单一酶切位点，即多克隆位点,多克隆位点（,Multiple cloning site,MCS,）,：一段人工合成的,DNA,序列，其上含有密集排列的多种单一限制性内切酶位点，以利于不同来源的外源,DNA,插入载体。,5,、具有筛选标记,6,、分子量合适（,3-10kb),7,、高拷贝数,拷贝数（,copy):,一个细胞内存在的 分子数,8,、生物安全性好,三、克隆载体必备条件,（,1,）具有复制起点,（,2,）具有抗菌素抗性基因（遗传标记）,（,3,）具有若干限制酶单一识别位点，允许外源基因插入,（,4,）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。,四、常用克隆载体种类,Classification of cloning vectors),质粒（,plasmid),噬菌体（,bacteriophage),粘粒（,cosmid,）,M13,噬菌体（,bateriophage M13,）,人工染色体,(artificial chromosome),第二节 常用克隆载体介绍,Several cloning vectors,一、质粒（,plasmid),（一）一般特性,(features),Plasmid,：,染色体外能够进行自主复制的遗传单位。,包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸,(DNA),分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的,DNA,分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体,多为环状双链,DNA,可自我独立复制,天然存在：,F,质粒、,R,质粒等,编码重要遗传信息,不相容性,质粒的不相容性,：是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。,质粒的不相容性分子基础，主要是由于它们在,复制功能之间的相互干扰,造成的。,（二）分类,(classification),大小：小型质粒,(,15kb),大型质粒,(60kb),功能：,F,质粒、,R,质粒,宿主：,窄宿主范围质粒,：,ori,特异，仅能在一种宿主中复制,宽宿主范围质粒,：,ori,不特异，可在多种宿主中复制,复制类型：,严紧型质粒,：,复制受宿主细胞的严格控制,低拷贝数（,1-2copies/cell),松弛型质粒,：,拷贝数高,(10-200 copies/cell),复制仅需,DNA,聚合酶,I,，不需蛋白质合成,宿主细胞蛋白质合成及染色体复制停止时，可大量扩增至上千份（,氯霉素,）,构型,：,超螺旋型（,supercoiled circle,SC),or,共价闭环双股,DNA(covalently closed circle,CCC),开环型（,opened circle,OC,）,线形（,linear circle,LC),（三）质粒的命名,用小写字母,p,代表质粒,（,plasmid,），在,p,字母后用,两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称,，再加上,质粒编号,。,如：,pBR322,：,p,表示一种质粒，而,“,BR,”,则是分别取自该质粒的两位主要构建者,F.Bolivar,和,R.L.Rodriguez,，,322,为编号。,（四）克隆质粒的改建,(how can cloning vectors be made),1,、改建质粒的目的,调整质粒结构、提高转化率,2,、常用手段：,减小分子量,引入,MCS,引入具有多种用途的辅助序列,向天然质粒中引入选择标记,pSC101,多个质粒,重组,，增强选择标记,过大,pBR313,减小复制非必需区,缩小分子量,增大容量,pBR322,调整质粒结构，,完善载体功能,（减小分子量、引入,MCS,及辅助序列）,3,、克隆质粒的发展趋势,4,、发展概况,第一阶段（,1977,年前）：,天然质粒和重组质粒的利用,，如,pSC101,colE1,pCR,pBR313,和,pBR322(1977,Bolivar et al),第二阶段：,增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因,。如,pUC,系列载体。,第三阶段：,进一步完善载体功能,以满足基因工程克隆中的不同要求，如,M13mp,系列载体，含,T3,，,T7,，,sp6,启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。,单标记、复制效率低（平均每个寄主细胞仅有,12,个拷贝）,双标记，,50%,以上的复制非必需区,9.09kb,物理图谱,（,physical map),物理图谱（,physical map):,在,DNA,分子上标明限制性内切酶位点、数目、排列顺序及特征性功能标记的图形。又称为,限制图谱（,restriction map),载体物理图谱识图要求,1,、载体大小,2,、载体类型,3,、载体组成,4,、载体主要元件（特点）及其应用,（五）常见人工构建质粒的分类,:,according to their functions,plasmids can be classified into:,人工构建的质粒根据其功能及用途分为,:,1.,多拷贝质粒,复制子经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因。,2.,测序质粒,sequencing plasmid,3.,整合质粒,装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因准确重组,整合,入受体细胞的染色体上,4.,穿梭质粒,shuttle plasmids,含有两个不同的复制子，能在,两种不同的受体,细胞中复制,5.,表达质粒,expression plasmids,装有,强的启动基因,，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效,表达,（,六）常用质粒介绍,detail introduction of several plasmids,质粒命名原则,4.36kb,双标记,分散的多个单一酶切位点,插入灭活,双抗菌素对照实验,1,、,pBR322,77,年,Boliver,构建,插入失活、双抗菌素对照实验,pBR322,衍生质粒,2,、,pUC18/19,pBR322,的重要衍生质粒,1983,年构建：,pBR322+M13,基本元件：,ori,Amp,r,MCS,辅助序列：,lacZ,基因,lacI,基因,lacZ,基因编码,-,半乳糖苷酶,lacI,基因编码阻遏蛋白,使,lacZ,不能表达,诱导物与阻遏蛋白结合,lacZ,表达,乳糖操纵子,(lac Z operon),乳糖操纵子的表达调控,Regulation of Lac Z expression,pUC,载体,(,含,lacZ,、,lacI,基因）,诱导物,(IPTG),lacZ,表达,-,半乳糖苷酶,N,端片段（,-,肽）,宿主细胞,lacZ,M15,缺陷型,-,半乳糖苷酶,-,半乳糖苷酶,X-gal,变兰色,pUC,载体蓝白斑筛选的原理,-,插入失活,1,how to select positive clone using a vector with LacZ,pUC,载体,(,含,lacZ,、,lacI,基因）,外源基因插入,lacZ,失活,不产生,-,半乳糖苷酶,N,端片段（,-,肽）,X-gal,不变色，呈白色,pUC,载体蓝白斑筛选的原理,-,插入失活,2,3,、,pGEM,系列,pGEM-1,MCS,两侧有,SP6,、,T7RNA,聚合酶启动子,pGEM-1,MCS,两侧有,SP6,、,T7RNA,聚合酶启动子,1,、可进行体外转录,转录具有特异性,可分别转录插入片段的两条链,转录产物可制备,体外翻译的模板、探针及反义,RNA,2,、为插入片段的测序提供特异引物位点,pGEM-3/4Z-,MCS,位于,lacZ,基因内部,插入失活,蓝白斑筛选,具有,SP6,、,T7,启动子,pGEM-3Zf(+)/(-)-,引入丝状噬菌体,f1(+)/(-),复制起始点,可以产生单链,DNA,，并分泌至上清中，便于对插入片段进行测序,F1,的方向,(+/-),决定复制哪一条链,4,、,T-vector,用于,PCR,产物的直接克隆,载体,DNA,两条链的,5,端有一个,游离的,T,：,PCR,产物的直接克隆,SP6,、,T7,启动子,：体外转录、为克隆产物的测序提供特异性引物,插入位点两侧的,酶切位点,：为回收克隆片段进行亚克隆提供便利的酶切位点,5,、,pCDNA3-,穿梭载体,穿梭载体（,shuttle vector),即可以携带外源基因在原核细胞中复制，又可以使其在真核细胞中表达的载体,。,小 结,(conclusions),质粒的发展趋势：,调整质粒结构、提高载体效率：减小分子量、引入,MCS,引入多种用途的辅助序列,:,lacZ,、,lacI,基因：,蓝白斑筛选,SP6,、,T7RNA,聚合酶启动子：,体外转录,F1,复制起始点：,产生单链,DNA,真核启动子：,穿梭载体,二、,噬菌体载体,Bacteriolphage,（一）,噬菌体的分子生物学,biological features of bacterophage,1,、,噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和,-DNA,组成,2,、,-DNA,：,线状双链,DNA,分子，全长,48.5kb,两端各有一个,12,核苷酸的互补单链（粘性末端，,GGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGA,，称为,Cos,位点（,cohesive end,）,或,cos,区。,功能相近的基因在基因组中聚集在,一起。,噬菌体生物学性状介绍,3,、基因组成：,48.5 kb in length,；,Linear or circular genome(cos ends),Cos,位点（,cohesive end),：,DNA,分子两端各有一个,12,碱基长的互补单链顺序，是天然的粘性末端，称,cos,位点,左臂（,编码外壳蛋白,）：头部基因（,7,个）、尾部基因（,11,个）,右臂（,负责裂解宿主细胞、,DNA,自主复制以及调控,),：裂解基因（,2,个）,中间段,(,控制基因组整合到寄主基因的基因,),：,DNA,复制及溶菌生长非必需区,（重组基因、正调控基因、负调控基因）、,DNA,合成基因,cos,位点的作用,4,、生活周期,温和性噬菌体,（二）,DNA,载体的构建,建立,克隆载体前需要解决,2,个问题：,Two key points of preparing,vectors,1,）包装容量有限,：,DNA,分子只能增加,5%,的大小，意味着只能插入,3kb,的,DNA,分子。,2,）酶切位点复杂,：,基因组非常大，对于每一种酶来讲都含有超过,1,个的识别序列，酶切后产生多个片段，连接不能形成,基因组。,两种解决方案：,1,）缩短长度,：,DNA,上约有,40-50%,的,DNA,片段是复制、裂解所不必需的，将之切除便可提高载量。,2,）修饰酶切识别位点：,利用自然选择法获得限制性位点缺失的,品系。,天然的,-DNA,上有多个酶切位点，如：,EcoRI 5,个，,HindIII 7,个，这些多余的酶切位点必须被修饰。,DNA,Protein coat,cos,cos,Nonessential region,Long(left),arm,short(right),arm,Exogenous DNA,(20-23 kb),phage,12bp,Viruses that can infect bacteria.,48.5 kb in length,Linear or circular genome(cos ends),phage,Lytic phase,(Replicate and release),Lysogenic phase,(integrate into host genome,),自然选择法,：利用一个产生,EcoRI,的大肠杆菌，大部分侵入细胞的,DNA,分子会被限制性酶破坏，少部分能够成活，这些就是突变型的噬菌体，其,EcoRI,位点缺失了。,（三）,噬菌体载体,1,、基本组成元件,components of,vectors,Cos,位点,左臂（头尾基因）,右臂（裂解基因）,酶切位点,噬菌体载体,2,、类型,types of,vectors,：,插入型载体：,含有单个或多个单一酶切位点供外源基因插入,替换型载体：,含有一对或多对酶切位点便于外源基因替换,插入型载体,(insertion vector),该类载体经改造后的长度为,37kb,，为包装的下限，它本身也能被包装，其允许的插入片段最大为,17.9kb,（,54.9-37kb,）。,由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。（,0-17.9kb,）,gt10,：,可以携带,8kb,的,DNA,分子，插入位于,cI,基因内的单一的酶切位点,EcoRI,。插入失活导致裂解循环，从而很容易识别重组子。,ZAPII,：,含有多聚接头，可以使用六种不同的限制性内切酶插入约,10kb,的新的,DNA,分子，通过,lacZ,基因的插入失活鉴定重组子，不能形成蓝色的噬菌斑。,替换型载体,(replacement vector),该类载体经改造后的长度约为,40kb,，在非必需区域内含有两个相同的酶切口，两者间的距离为,14kb,长，使用时用酶切开，分离去除这个,14kb,长的,DNA,片段，然后用外源,DNA,片段取代之。,特点：,容量大，且有一个下限,：,40-14kb=26kb,，包装下限为,36.4kb,，因此其载装下限为,10.4,而上限为,25.5kb,。,WES.B,：,两个,EcoRI,位点跨越替换区域，根据分子大小筛选重组子。,EMBL3,EMBL4,：,可以插入,20kb,的,DNA,分子，可利用,EcoRI,、,BamHI,、,SalI,替换填充片段，因此可以插入不同粘端的,DNA,片断。,噬菌体载体,3,、体外包装,将重组的噬菌体,DNA,分子与噬菌体头、尾部蛋白混合，通过自动包装，体外组成完整的具有极强感染性噬菌体颗粒的过程。,噬菌体载体,外源基因,重组噬菌体,DNA,替换,/,插入,噬菌体头、尾蛋白,子代病毒颗粒,体外包装,宿主,感染,大量扩增目的,DNA,感染力较低,感染力极强,以感染方式导入细胞的频率可达,10,6,10,8,/gDNA,，而以转染（,translation,）的方式导入的频率仅为,10,3,10,5,/gDNA,噬菌体载体,4,、用途：,构建文库，容量大,5.-DNA,作为载体的优点,merits of,vectors,1)-DNA,可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌,2)-DNA,作为载体，其装载外源,DNA,的能力为,25kb,，远远大于质粒的装载量,3),重组,-DNA,的筛选较为方便,4),重组,-DNA,分子的提取比质粒容易,三、粘粒（,cosmid),1978,年构建,（一）考斯质粒,(,粘粒，,cosmid),：即含有,-DNA,两端,cos,区的质粒。,cos,位点,的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有,cos,位点的任何,DNA,分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体,的颗粒。,将此,DNA,片段与质粒连在一起，即,cosmid,就可装载更大的外源,DNA,片段，同时它仍可象,-DNA,一样，被体外包装，以感染方式，高效的将重组,DNA,转入大肠杆菌,考斯质粒不能形成子代病毒颗粒，更不能裂解细胞，而是以质粒形式进行复制。,由,质粒,和,噬菌体,cos,位点,构建而成，同时具备二者的特点：,质粒,ori-,环状复制,单一酶切位点,选择标记,Cos,位点,体外包装,构建,DNA,文库，容量为,29,45kb,（二）考斯质粒的优越性,1),能象,-DNA,一样体外包装，并高效导入受体细胞,2),容量大，如,cos,区及附近顺序长为,1.7 kb,，质粒长为,3.3kb,，则该考斯质粒最大可装载,46.5kb,的外源,DNA,3),由于携带质粒的选择标记，便于筛选,4),由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。,以,cosmid,为载体克隆,DNA,的技术路线,柯斯质粒,pHC79,系列,由质粒,pBR322,和噬菌体,的,cos,位点的一段,DNA,构成全长,4.3kb,Digestion,Ligation,C)Packaging and infect,Formation of a cosmid clone,Ligation to cleaved cosmid vector molecules can produce vector-target concatemers,resulting in a large exogenous DNA fragment flanked by cos sequences.,四、,M13,噬菌体载体,Bacterophage M13,M13,噬菌体：,E.coli,的丝状噬菌体,闭环正链,ssDNA,，,6.4kb,M13,生殖周期,向胞外分泌单链,DNA,RF DNA,M13,噬菌体载体的构建：,M13-DNA,上几乎没有非必需区域，因而载体的构建主要是插入标记基因如，,lacZ,、多克隆位点，消除多余的酶切位点。,Blue-white selection,M13,载体系列,M13 DNA,上引入,lacZ,基因,M13mp1,，可以通过插入失活鉴定重组噬菌斑。,M13mp1,载体通过体外定点突变,在基因的起始端，获得含有,6,碱基的序列,GCATTC(EcoRI,位点,)M13mp2,。,合成短的多聚核苷酸,(polylinker),插入到,M13mp2,的,EcoRI,位点上,就将限制性内切酶位点引入到,lacZ,基因,M13mp7,。,M13,噬菌体载体：用于制备单链,DNA,、测序,M13,克隆载体分子结构图,五、噬菌粒载体,噬菌粒载体,由,质粒,载体和,单链噬菌体,载体结合而成的新型的载体系列。,它具有,质粒,的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便,DNA,的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生,单链的子代噬菌体,。,1.,具有较小分子量，可克隆,10kb,的外源,DNA,片段，并易于进行分离与操作；,2.,编码一个,amp,r,基因作为选择记号，便于转化子的选择；,3.,拷贝数含量高，每个寄主可高达,500,个；,4.,存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源,DNA,片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；,常用的噬菌粒载体,pUC118,和,pUC119,5.,lacZ,基因插入失活,，可按照,IPTG,组织化学显色反应试验，筛选重组子；,6.lacZ,基因是置于,lac,启动子,的控制之下，这样插入的外源基因便会以,融合蛋白质的形式表达,；,7.,含有,质粒的复制起点,，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链,DNA,分子,8.,带有一个,M13,噬菌体的复制起点,，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出,单链,DNA,拷贝，并包装成噬菌体颗,分泌,到培养基中；,9.,在,pUC118,和,pUC119,这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链,DNA,，另一个则可转录出负链,DNA,；,10.,可以直接对克隆的,DNA,片断进行核苷酸的,序列测定,，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。,pBluescript,噬菌粒载体,基本结构：,1.,在多克隆位点的两侧，有一对,T3,和,T7,噬菌体的启动子,，可以定向指导外源基因的转录活动；,2.,同时具有一个单链噬菌体,M13,或,f1,的复制起点,和一个来自,ColE1,质粒的复制起点，在不同的情况下，可以采取不同的复制形式，分别合成单链或双链的,DNA,；,3.,编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转化子记号；,4.,含有,lacZ,基因,，可用,Xgal-IPTG,组织显色反应法筛选噬菌粒载体。,T7,T3,用于体外转录,六、人工染色体,克隆大片段,DNA,1,、真核生物染色体中的关键部位（分裂、复制必需区）,着丝粒,(centromere,CEN):,分裂,端粒,(telomere,TEL),：保护染色体、维持染色体复制,自主复制序列,(autonomously replication sequence,，,ARS),：复制起始位点,2,、人工染色体：,以真核生物的,CEN,、,TEL,、,ARS,为骨架，可携带插入的外源基因进行复制，即为人工染色体,3,、种类：,酵母人工染色体（,yeat artificial chromosome,YAC),细菌人工染色体,(bacterial artificial chromosome,BAC),YAC:,利用酵母的,TEL,、,ARS,及,CEN,构建的人工染色体,结构,：,左臂,：,TEL,、选择标记、,ARS,、,CEN,、,右臂,：,TEL,、选择标记,特点,：,容量大（,50-1000kb,），减少克隆数,稳定性差，不易分析,BAC,：,利用细菌复制必需区,(TEL,ARS,CEN,）构建的人工染色体,载体容量为,100-300kb,Structure of a bacterial artificial chromosome(BAC),used for cloning large fragments of donor DNA.,CM,R,is a selectable marker for chloramphenicol resistance.,oriS,repE,parA,and,parB,are F genes for replication and regulation of copy number.,cosN,is the,cos,site from,l,phage.,Hin,dIII and,Bam,HI are,cloning sites,at which foreign DNA is inserted.,The two promoters,are for transcribing the inserted fragment.The,NotI,sites,are used for cutting out the inserted fragment.,PAC,载体,质粒,噬菌体,柯斯质粒,单链噬菌体,克隆,DNA,大片段,*,+,+,-,构建基因组文库,-,+,+,-,构建,DNA,文库,+,-,-,-,常规的亚克隆化,+,-,-,-,构建新型的,DNA,结构,+,-,-,-,序列分析,+,-,-,+,单链探针,+,*,-,-,+,外源基因在大肠杆菌中的表达,+,-,-,-,四种常用载体的比较,*,外源,DNA,如超过,10kb,，则重组质粒的转化率和,DNA,得率都非常低,*已有个别材料可用于此目的,小 结,载体的概念、性能,plasmid,质粒载体,必须,具备的基本条件,pUC,质粒载体,pBR322,质粒载体,phage,phage,cos ends,主要类型,包装长度,M13vector,质粒发展趋势及关键辅助序列,噬菌粒载体,柯斯质粒载体,特点、结构特征、,人工染色体,