血红蛋白的提取与分离上课讲义.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,血红蛋白的提取与分离,2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成，这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代,人类基因组：,指DNA分子所携带的全部遗传信息,蛋白质组：,生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究,血液,血浆,水 分,固体物质：,血浆蛋白、,无机盐、磷脂、葡萄糖等,血细,胞,白细胞,血小板,红细胞,（最多）,血红蛋白,（90）,两个,肽链,两个一肽链,四个亚铁红素基团,2.提问：,血液有哪些成分？,1.提问：,用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。,血红蛋白,血红蛋白,两个,肽链,两个一肽链,四个亚铁红素基团,每个肽链环绕一个,亚铁血红素基团，,此基团可携带,一分子氧或一分子二,氧化碳，,血红蛋白因含有,血红素,而,呈,红色。,血红蛋白的特点：,1.分离生物大分子的基本思路：,选用一定的,物理或化学,的方法分离具有不同物理或化学性质的,生物大分子,。,2.蛋白质分离和提取的原理：,根据蛋白质,各种特性,的差异，如,分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力,等等，可以用来分离,不同种类,的蛋白质。,一、血红蛋白的提取和分离,3.高温灭菌和酒精灭菌的结果：,使微生物的,蛋白质发生,变性,、,蛋白质的,空间结构,被破坏。,（一）凝胶色谱法（,分配色谱法,）,2.凝胶：,大多数凝胶是由,多糖类化合物,（如,葡聚糖或,琼脂糖,）构成的,多孔,小球体，,内部有许多贯穿的,通道,。,根据被分离物质的蛋白质,相对分子质量,的大 小，利用具有,网状结构,的凝胶的,分子筛,作用，来进行,分离。,1.概念：,3.凝胶色谱法的原理,分子筛效应：,当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;,而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。,相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。,依据的特性是：,蛋白质分子量的大小。,4.,凝胶色谱法,分离蛋白质,的原理和,具体过程,（二）缓冲溶液,1.概念:,在一定的范围内，凡是能够抵制,外加少量强,酸或强碱,的影响使原来溶液,PH值基本保持,不变的混,合溶液。,能够抵制,外界的酸和碱,对溶液,PH值,的影响，,维持PH基本不变。,2.作用:,3.缓冲溶液的配制:,通常由,12 种缓冲剂,溶解于水,中配制而成。调节缓冲剂的,使用比例,就可以制得在,不同PH范围内,使用的缓冲液。,4.,提问：在本课题中使用的缓冲液是:_,其目的是:,利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证,血红蛋白的正常结构和功能，便于观察,(,红色,),和科,学研究,(,活性,),磷酸缓冲液,缓冲溶液的组成及分类,弱酸及其对应的盐：,弱碱及其对应的盐：,多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐:,H,2,CO,3,NaHCO,3,；CH,3,COOHCH,3,COONa,NH,3,H,2,ONH,4,CL;NH,4,OHNH,4,CL,NaHCO,3,Na,2,CO,3,；NaH,2,PO,4,Na,2,HPO,4,缓冲溶液由足够浓度的共轭酸碱对组成。其中，能对抗外来强碱的称为,共轭酸,；能对抗外来,强酸的称为,共轭碱,。这一共轭酸碱通常称为,缓冲对、缓冲剂或缓冲系,。,常见的缓冲对主要有如下,三种类型：,（三）电泳：,1.概念：,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,2.原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、,核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。,电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离,。,3.类型:,琼脂糖,凝胶电泳、,聚丙稀酰胺,凝胶电泳。,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动,琼脂糖凝胶电泳示意图,聚丙稀酰胺凝胶电泳,1、在测定蛋白质分子量时常用,十二烷基硫酸钠（SDS）,聚丙稀酰胺凝胶电泳。,聚丙稀酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在,引发剂,和,催化剂,的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的,迁移率,取决,于它所带,净电荷,的多少以及,分子的大小,等因素。,（,SDS的作用）,为了消除,净电荷对迁移率的影响，,可以在凝胶中加入SDS,。,2.原理：,聚丙稀酰胺凝胶电泳,SDS能使蛋白质发生完全变性,。由几条肽链组成的,蛋白质复合体,在SDS的作用下会,解聚成单条肽链,，因此测定的结果只是,单条肽链的分子量,。SDS能与各种蛋白质形成,蛋白质SDS复合物,，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子,原有电荷量,。因而掩盖了,不同种蛋白质间的电荷差别,，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。,3.SDS作用机理:,用SDS测定蛋白质分子量的方法,使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,测定蛋白质的分子量时，可选用一组,已知分子量的标准蛋白,同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的,电泳区带位置,，用,电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线,，可以测定,未知蛋白质,的分子量。,市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。,二、实验操作,样品处理粗分离,纯化,纯度鉴定,1.样品处理：,（一）蛋白质提取和分离步骤,（二）操作过程,本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。,(1)红细胞的洗涤:,洗涤目的:,去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的,分离纯化，洗涤次数不可过少。,洗涤操作：,1、采集血样。2、低速短时间离心,（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）,3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心,（低速短时间）,6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。,(2)血红蛋白的释放：,加蒸馏水到,原血液体积,，再加40体积的,甲苯,，置于,磁力搅拌器,上充分搅拌10分钟（,加速细胞破裂,）,细胞破裂释放出血红蛋白。,(3)分离血红蛋白溶液：,过程：,将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。,试管中溶液层次：,第1层（最上层）：甲苯层（,无色透明,）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（,白色薄层固体,）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（,红色透明液体,）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（,暗红色,）。,分离：,用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的,红色透明液体,。,二、实验操作,甲苯层,（,无色透明,）,白色薄层固体,红色透明液体,杂质沉淀层,（,暗红色,）,试管中溶液层次,(4)透析：,过程：,取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的,磷酸缓冲液,中（pH为7.0），透析12小时。,透析目的：,除去样品中分子量较小的杂质。,二、实验操作,2.凝胶色谱操作:,（1）凝胶色谱柱的制作：,取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，,两端需用砂纸磨平。,底塞的制作：,打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的,一,端,。,注意事项,：,底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。,顶塞的制作：,打孔安装玻璃管,。组装：,将上述三者按相应位置组装成一个整体,。,安装其他附属结构。,（2）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：,A、材料：,交联葡聚糖凝胶（G-75）。,B、代表意义：,“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围,。,75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。,凝胶的前处理：,配置凝胶悬浮液：,计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。,凝胶色谱柱的装填方法：,A、固定：,将色谱柱装置固定在支架上。,B、装填：,将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。,注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。,2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：,因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果,。,洗涤平衡：,装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的,磷酸缓冲液（pH为7.0）,充分洗涤平衡,12小时,。,注意：,1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。,2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象,。,（2）凝胶色谱柱的装填,50cm高,（3）样品加入与洗脱,调节缓冲液面：,打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。,滴加透析样品：,吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。,样品渗入凝胶床：,加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。,洗脱：,小心加入,pH=7.0,的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。,收集：,待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。,（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）,注意：,正确的加样操作：,1、不要触及并破坏凝胶面。,2、贴壁加样。,3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,（3）样品加入与洗脱,注意：,正确的加样操作是：,1、不要触及并破坏凝胶面。,2、贴壁加样。,3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,思考下面的问题：,让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。,1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？,2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？,血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？,血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：,样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定,。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到,血红蛋白溶液,，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后,通过凝胶色谱法,将相对分子质量较大的,杂质蛋白除去,，即:样品的纯化；最后经,聚丙烯酰胺凝胶电泳,进行纯度鉴定。,（三）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,2.试剂的配制：,鉴定血红蛋白纯度。,1.目的：,丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺:,用去离子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液。,十二烷基硫酸钠（SDS）:,用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存。,用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液。TEMED：,作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。,用去离子水配制10%过硫酸铵：,作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。,Tris甘氨酸电泳缓冲液：,25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸(pH 8.3)，0.1%的SDS。,样品处理液：,50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。,染色液：,0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。,脱色液：,10%的甲醇和10%的冰醋酸。,1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。,2、TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。,3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。,注意事项：,（三）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备：,用去离子水4.6 mL，30%的丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8的Tris缓冲液2.5 mL，10%的SDS 0.1 mL，10%的过硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5 cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高23 mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。,分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。,配制SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水2.7 mL，30%的丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8的Tris缓冲液0.5 mL，10%的SDS0.041 mL，10%的过硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。,整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。,（1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板,（2）SDS聚丙烯酰胺凝胶制备：,3、电泳方法步骤,（3）样品处理：,在电泳样品中按11体积比加入样品处理液，在100 温度下加热3 min，以使蛋白质变性。,（4）浓缩胶聚合完全后（30 min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。,（5）加样：,按顺序加样，加样量通常为1025 L。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品,（6）电泳：,将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm处，关闭电源。,（7）剥胶：,从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。,（8）染色：,将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1-2 h。,（9）脱色：,染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色3-10 h，其间需多次更换脱色液至背景清楚。,（10）观察结果：,SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。,3、电泳方法步骤,观察你处理的血液样品离心后,是否分层,（见教科书图5-18），,如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。,此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,三、实验结果分析与评价,1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，,例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，,观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。,如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；,如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,三、实验结果分析与评价,本课题作业;,1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的?,2.什么是缓冲溶液?它的作用是什么?,3.电泳的作用及其原理是什么?,4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗?,5.与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点?这一特点对你进行,蛋白质的分离有什么意义?,再见,此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢,