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Direct survival role of vascular endothelial growth factor on rat ovarian follicular cells

前言
雌性生殖系统是研究成体血管发生的一个有趣的模型，因为它面临着许多生成血管的过程加上周期进化和衰退（卵巢，子宫内膜，胎盘结构）。相反，维管系统在其他组织是普遍静止的，除了伤口愈合和一些病例条件下。
VEGF家族和他的受体在血管发生中构成了一个重要的信号通路,在近20年来研究的比较深入。七个家族成员已经被鉴定，VEGF-A到-E。胎盘生长因子（PIGF）-1和-2，他们都是通过三酪氨酸激酶受体，VEGFR-1到3发信号的。特别的，VEGFA(通常被称为VEGF)在血管发生中是主要的参与因子，VEGFR2/KDR是主要的受体。VEGF,acting through Flk-1/KDR is a crucial physiological component in follicular growth, being necessary for the selection of recruited antral follicles。在牛，猪，鼠类卵巢中，VEGF在早期卵泡发育过程中表达，而且在卵泡生长的全部过程中在颗粒细胞和卵泡膜细胞表达量增加。我们最近的研究表明VEGF蛋白和其受体VEGFR2/KDR，在大鼠卵泡的颗粒细胞和卵泡膜细胞中有高表达。
一些研究已经对在卵泡发育中VEGF的功能进行研究。在小鼠上，用一种特殊的抗体抑制KDR来抑制促性腺激素依赖的卵泡血管发生并且阻拦成熟卵泡的发育。
服用VEGF TRAP ，一种来自猴的可溶性VEGF受体，可以使卵泡血管发生减弱，FLT1和KDR受体发育减缓。而且，在早期卵泡发育中加入抗VEGFR2抗体可以干扰卵泡的正常发育。（Moreover, the administration of an anti-VEGFR2 antibody in the early follicular phase interferes with the normal development of the cohort of recruited antral follicles）。在恒河猴卵泡内注射VEGF拮抗剂可以降低排卵和后续的黄体发育及其功能。在我们的研究中，我们发现用Trap处理来抑制VEGF可以使抗细胞凋亡的比例失调：在大鼠卵巢中可以导致大量卵泡闭锁的凋亡前的蛋白。
除了它的促血管生成作用，在不同的细胞中VEGF还是一个存活因子。特别是它在内皮细胞通过它的受体KDR促进有丝分裂，这在体内和体外都以证明。但是，这个因子同时还能在神经元中起到保护细胞的作用，通过抑制凋亡，刺激神经形成，在中枢神经系统起到gliotrophic作用，并且在局部缺血后，在肌细胞起到存活因子的作用。近几年，还报道VEGF在小鼠胚胎时期对眼的发育和晶状体的分化有直接的作用。但是，迄今为止，很少由关于VEGF在大鼠卵巢细胞的存活因子的角色，特别是在早期卵泡和颗粒细胞的培养中。已经指出在牛卵泡中可能充当存活因子的角色，通过它的KDR受体，在牛卵巢中通过抑制颗粒细胞的凋亡来抑制卵泡闭锁。
VEGF通过它的主要受体VEGFR2/KDR在内皮细胞形成了一个多样的，网络状的信号通路，产生了多功能性。这个VEGF促进细胞存活的主要的通路是P13K依赖的抗细胞凋亡激酶和AKT/蛋白激酶B的激活。VEGF也可以在其他细胞中激活P13/AKT途径，例如神经元和平滑肌细胞。另外，VEGF是ERKs1和2的强烈的活化剂，通过KDR在血管发生和细胞存活中起着重要作用。但是，还没有报道关于卵泡细胞中VEGF的信号转导通路。
我们已经发现在体内，通过TRAP intrabursal administration 抑制VEGF可在大鼠卵泡中诱导细胞凋亡，抑制细胞增生，调节卵泡生长和发育，P13K/AKT信号通路是这个机制中的一种。但是，我们不能说明这个影响在体内发生是通过血管延伸减少或者是抑制卵泡细胞中VEGF与它的受体间的相互作用。
我们的主要目的是研究来自DES-处理的大鼠的卵泡和颗粒细胞中VEGF的直接的存活作用。我们特别研究了体外在早期卵泡和颗粒细胞中VEGF在卵泡细胞增殖和凋亡的作用。另外，我们试图去阐明在卵巢细胞中PI3K/AKT and ERKs 1 and 2细胞内途径与VEGF的直接作用是有关的。
2.材料和方法
2.1试剂
DMEM-F12,双抗，羊FSH，人VEGF，抗PCNA抗体PCNA (sc-7907), Caspase 3 (sc-7148), phospho AKT (sc-7985-R), ERK (sc-154) and phospho ERK (sc-7383)，
2.2动物
青春期钱的母大鼠，皮下注射雌激素（己烯雌酚），连续3天来刺激早期卵泡的发育
2.3卵泡培养
将卵泡（350直径）洗干净在培养基内培养。60个从5只动物上取下的卵巢卵泡混在一起用于不同的处理。4分之一的卵泡在无血清的培养基中孵育（37 °C，350ulDMEM/F12,包含有10 mM HEPES，含有双抗）。有研究用这种培育条件检测出卵巢卵泡生理学上的调节功能。另外，这种实验模型维持了卵泡的结构和不同卵泡细胞将的相互作用。用DES处理未成熟大鼠来刺激卵巢卵泡的发育可以是分离的卵泡呈现出早期卵泡的特征：大小，小空泡，薄的壳层。另外，有些研究利用这个模型研究在早期卵泡中的凋亡机制。将卵泡在无血清的培养基中培养24h研究器凋亡和增殖，and for 60 min for intracellular pathways studies。在不同的条件下：无血清，加入FSH或VEGF。在细胞凋亡研究中，10个从不同卵巢取来的卵泡培养与相同的培养基中24h。在无血清中培养出现了典型的凋亡DNA条带：180bp长的核小体间的片度出现。在相同的培育时间之后，将卵泡冻存在-70°C中，用于后续的蛋白或DNA的提取。
2.4western blot
提取卵泡蛋白
2.5DNA提取及破碎分析
2.6颗粒细胞分离和培养
从DES处理的大鼠上分离颗粒细胞。放入96孔板或8孔板中。先将细胞培养在含有BSA，胰岛素，转铁蛋白，维生素C 3的DMEM/F12中小时，之后将未贴壁的细胞转移到新鲜的富集培养基中24h，之后将培养基换为含有FSH和雌二醇包含VEGF或不含VEGF的DMEM/F12中。
2.7增殖分析
氚化胸腺嘧啶在细胞培育24h之后加入。24h之后，将细胞收集到凹玻片中，将多余的氚化胸腺嘧啶用酒精冲洗，之后用蒸馏水冲洗。用闪烁计数器计量放射性。每个实验包含6到8个重复，每个实验进行3次大重复，是不同的颗粒细胞组，他们从6只大鼠上获得。
2.8TUNEL染色
用tunel鉴定颗粒细胞凋亡。
2.9数据分析
3．结果
3.1VEGF可以刺激细胞增殖
VEGF对与卵泡细胞的增殖作用是通过鉴定PCNA（增殖细胞核抗原）的表达，它在G1和S期有表达。加有VEGF(100ng/ml)的分离的早期卵泡可以明显的增强卵泡PCNA蛋白含量，与其他条件下比较。当卵泡培养在含有FSH或VEGF(50ng/ml)的培养基中时，我们没有检测出来细胞增殖。
图一
VEGF对卵泡PCNA蛋白表达的直接影响。对蛋白提取物（DES处理的大鼠的早期卵泡用不同的方法处理）中的PCNA进行免疫印迹分析。卵泡培养在没有刺激物，含有FSH20ng/ml,VEGF50ng/ml,or 100ng/ml的基本培养基中。光密度测定法分析。5个独立实验，3次重复。星号表示显著差异。
3.2在体外研究中，VEGF抑制细胞凋亡，降低卵泡细胞中caspase 3的活性
细胞凋亡后期，细胞DNA断裂成180bp长的碎片，可以在琼脂糖凝胶中观察出来。由于自然凋亡，卵巢培养24小时后，可以观察到典型的凋亡细胞的DNA降解。早以前的研究中，我们证实了通过TRAP处理抑制VEGF可以导致大量的卵泡闭锁。因此我们接着研究VEGF是否能直接调控卵泡闭锁。两种剂量的VEGF（50，100ng/ml）都能明显降低细胞凋亡的DNA碎片，高浓度的剂量最用更明显。（图2A）.FSH同样可以降低自然凋亡。、
图2
在体外研究中，VEGF抑制细胞凋亡，降低卵泡细胞中caspase 3的活性。(A)在24小时中通过不同的刺激（FSH,VEGF50ng/ml,100ng/ml）用琼脂糖凝胶分析早期卵泡DNA片段图，鉴定细胞凋亡。（B）在卵泡中密度计量caspase 3活性片段。caspase 3蛋白可以用抗caspase 3抗体直观的现象出来。
我们观察到卵泡细胞中VEGF可以减少细胞凋亡，我们接着研究了这种抑制是否伴随着caspase 3活性的降低。我们对卵泡中的蛋白提取物中的caspase 3的活性片段进行了western blot。VEGF浓度物50ng/ml时，减少了caspase 3的p17活性片段，与对照组比较。FSH有相同的作用。意外的是，我们不能检测出对照组和加了100ng/mlVEGF的实验组的差别，可能是VEGF有双向的作用。
3.3 VEGF刺激颗粒细胞增殖
为了研究VEGF对细胞的保护作用是直接作用与颗粒细胞的细胞因子，我们离体培养了颗粒细胞并培育与不同的条件下，如上所述。我们首先用3H-Thymidine核素掺入法分析了细胞的增值指数。得到同时用FSH和雌二醇，能增加Thymidine。有趣的是，当加入50ng/ml或100ng/ml的VEGF时，颗粒细胞的增殖效果会增强。
图3
VEGF对颗粒细胞的增殖和凋亡的影响。（A）从早期卵泡分离的颗粒细胞培养在不含刺激物的基础培养基中，加有FSH和E2，加有FSH+E2+50ng/mlVEGF或100ng/mlVEGF。（B）用tunel染色鉴定凋亡细胞。这些柱形显示了不同处理下的凋亡细胞的百分比。
3.4 VEGG抑制颗粒细胞凋亡
知道了在卵泡中VEGF可以抑制卵泡细胞凋亡，我们通过tunel染色，进一步研究了在离体颗粒细胞中是否会发生细胞凋亡。就像前面描述的那样，将颗粒细胞放入FSH和雌二醇中孵育，的确可以降低凋亡细胞的百分比。另外，加入50ng/mlVEGF,作用比加入100ng/mlVEGF作用更明显。而100ng/ml的作用与50或其他加入刺激物的实验组的作用没有显著的区别。（图3B）
3.5 VEGF激活了AKT和ERK的胞内途径
我们研究VEGF对卵泡存活和细胞凋亡调节的机制。因此，我们研究了VEGF的作用是否影响了卵泡P13K/AKT途径。我们首先将卵泡孵育在基础培养基，含有FSH,含有50VEGF,含有100VEGF的不同处理中1小时。之后，我们用western blot 鉴定了总的AKT和磷酸化的AKT。如（图4A）所示，当将卵泡孵育在含有100ng/ml的细胞因子中时，VEGF现出增加了AKT 的磷酸化水平。在相同时间点，对于50VEGF的处理，我们不能检测出来任何的影响。
图4
在卵巢中VEGF对AKT和ERK磷酸化的直接影响。将卵泡孵育在不同条件中60分钟后，用光密度定量法测定蛋白提取物中的AKT(A)和ERK(B)的磷酸化水平。每一个蛋白都用actin B标准化。下方都是每一个组的免疫印迹。（图4B）
4.讨论
在此研究中，我们证实了对于从经过DES处理的青春期前的大鼠体内取出的卵巢和颗粒细胞，VEGF起着增殖和保护细胞的角色。对于VEGF对内皮细胞的效应，研究的比较多，在去年，大量的研究证实VEGF在非血管性的细胞如：神经元细胞，和肌细胞中扮演着存活角色。到目前为止，很少有研究是关于VEGF在卵巢中的非血管性组织中的存活作用。
为了分析VEGF对于卵巢细胞的影响，我们首先用的到的模型是体外培养的早期卵泡，它可以保护卵泡的结构，研究不同卵泡细胞间的相互作用。用这个方法，我们证实了当在大鼠卵巢培养基中加入VEGF后，可以刺激卵巢细胞的增殖。这个结果与先前我们在体内局部抑制卵巢VEGF的表达所得的结论是一致的：VEGF促进颗粒细胞和卵泡膜细胞的增殖。这也与其他的研究者一致：当在灵长类卵巢中抑制VEGF，可以抑制卵泡膜细胞的增殖。另外，还有研究指出在山羊中，VEGF可以改善卵泡超微结构的完整性，促进卵泡生长。这些研究都说明在发育的卵泡中VEGF通过与颗粒细胞或卵泡膜细胞中的受体作用，在自分泌和旁分泌中起到了促有丝分裂的作用。不论早期卵泡的发育不完全的血管网，我们不能排除VEGF对内皮细胞有可能由作用。
另一方面，我们分析了VEGF对卵泡细胞凋亡的作用。将卵泡培养在无血清的培养基中24小时，提取的DNA显示了典型的凋亡细胞的DNA降解。加入FSH（已知的较好的卵巢卵泡存活因子）可以减少细胞凋亡的DNA碎裂片。我们的研究证实在培养基中加入VEGF可以得到与FSH相同的结果。而且，将早期卵泡培育在无血清的培养基中，VEGF可以抑制caspase 3的活性。有些研究证明了在不同类型的细胞如胚胎神经元VEGF可以干扰caspase 3的激活抑制细胞凋亡。在我们的研究中得到，在卵泡细胞中VEGF扮演着存活因子的作用（通过caspase 依赖的机制）
为了进一步分析VEGF在卵泡细胞中的作用，我们研究了它对颗粒细胞可能的直接功能。已经知道大鼠和其他物种的颗粒细胞在卵泡发育过程中表达KDR是有差别的。有研究证实了在牛健康颗粒细胞中VEGF和它的受体是共表达的。与他们一致，我们最近证实了VEGF和它的受体在大鼠卵泡发育的全程中可以增加表达。为了研究VEGF对颗粒细胞的直接作用，我们离体培养青春期前的大鼠颗粒细胞，用diethylestilbestr处理。当细胞用FSH和雌二醇处理后，我们观察到卵泡增殖。这个现象我们在以前就描述过，其他也有研究。当用FSH，VEGF，雌二醇共同处理细胞后，我们发现tritiated thymidine显著增加。当VEGF单独作用时，它对细胞增殖并没有作用。这些结果说明VEGF与FSH和雌二醇对颗粒细胞增殖有着协同作用。对于猪颗粒细胞，VEGF单独作用也可以刺激颗粒细胞增殖。我们的研究指出，对于从大鼠早期卵泡中的颗粒细胞来说，VEGF单独作用不会影响细胞增殖，但是却可以加强FSH和雌二醇促使细胞生长的能力。FSH和VEGF对早期卵泡或颗粒细胞影响中的差别可能是由于在颗粒细胞中FSH受体的易受性或是在卵泡中与其他因子的相互作用。
众所周知，对于不同的物种和细胞类型，VEGF是一个存活因子，通过在内皮细胞和非内皮细胞如：神经元，肌细胞，内皮细胞和卵巢细胞中的KDR受体发生作用，使他们减少细胞凋亡。通过tunel染色，我们发现对于从大鼠早期卵泡中的颗粒细胞来说，VEGF单独作用不会影响颗粒细胞凋亡水平，但是却可以加强FSH和雌二醇对颗粒细胞的保护作用。我们总结出，在卵泡细胞中VEGF不是作为一个增殖因子，而是起到一个保护的作用，组织颗粒细胞凋亡，防止卵泡闭锁。这些作用发生在VEGF与FSH和雌二醇协同作用的时候。值得指出的是，在卵泡发育时期，我们抑制VEGF得到了相似的结果：凋亡的颗粒细胞数目增加，自然的DNA断裂碎片增多，caspase 3活性提高。但是，用这个实验模型我们不能区别这个影响是由于为卵泡供养的血管减少的原因还是卵泡细胞VEGF与其受体直接作用的原因。这个研究证实了VEGF通过与FSH和雌二醇协同作用直接影响了卵泡细胞，阻止细胞凋亡，刺激细胞增殖，促进卵泡发育，促进排卵。（thus promoting follicular development and selection of the follicle to ovulate。）因此，与其他生长因子一起，增加VEGF的活性是机制的一部分：在含有相同FSH的条件下更能是卵泡发育好一些。
VEGF在不同的细胞中可以激活P13K/AKT途径，如内皮细胞，平滑肌细胞。我们最近报道了在大鼠体内，在卵泡发育期抑制VEGF可以AKT的磷酸化。在目前的研究中，我们验证VEGFS是通过活化P13K/AKT途径来直接作用与卵泡细胞的。事实上，我们观察到，当将VEGF加入到含有不同刺激物的早期卵泡培养基中是，可以是AKT在丝氨酸473的磷酸化程度增加。相反，FSH不能激活AKT。但是，有证据表明在许多细胞中FSH可以刺激P13K/AKT的信号传导，如支持细胞，卵母细胞，颗粒细胞。这些不一致可能由于细胞的类型和对FSH分析时的曝光时间有关。
除了知道VEGF对P13K/AKT途径的活化作用，还有一些证据表明VEGF还可以刺激ERK1/2信号。ERK主要是通过生长因子或有丝分裂原的刺激来促使细胞分化，生长，存活。在内皮细胞和神经元细胞中VEGF通过FLK-1/KDR受体和ERK1/2刺激DNA合成和增殖。有趣的是，在我们的实验模型中，我们观察到FSH和VEGF都可以增加ERK1/2D磷酸化。我们推测VEGF在卵泡细胞中通过刺激两个信号传导机制来发挥它的存活活性，P13K/AKT和ERK胞内途径。但是，我们不能排除在大鼠卵巢中，VEGF还影响了其他的途径。
在目前的工作中，我们发现在一些凋亡数据的分析中VEGF在不同浓度下的作用有一些差别。这可以归咎于VEGF在我们实验模型中的双向作用。值得注意的是，有些研究也指出VEGF在不同的细胞间对于细胞分化和胞内介质的磷酸化有着双向作用。事实上，Meng dt al.证实了在成熟小鼠的神经元细胞中，大剂量的外源性VEGF显著的负调节内源性的KDR和FLT1的表达，相反，小剂量的则能显著的正调节。双向作用也被报道在其他生长因子上发现，如转化生长因子β (TGFβ)。把我们的结果总结起来发现VEGF除了能增加血管通透性，促进血管生长，更重要的是在非血管性的卵巢细胞中VEGF能阻止细胞凋亡，促进细胞增殖，防止卵泡闭锁。VEGF在大鼠卵巢细胞中可以起到局部的细胞增殖和细胞保护的作用。我们也证实了胞内途径有可能与VEGF的特殊的作用有关。此外，我们证VEGF的一些功能是由于它直接作用在了颗粒细胞上。
总的来说，在大鼠早期卵泡细胞中（特别是颗粒细胞）VEGF刺激细胞增殖，阻止卵泡闭锁。它也可以抑制caspase 3的活性。而且，P13K/AKT和ERK/MEK途径都与VEGF的局部作用有关。

PCNA:
增殖细胞核抗原，因其只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内而得名，以后的研究发现PCNA与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标。PCNA是一种分子量为36KD的蛋白质，在细胞核内合成，并存在于细胞核内，为DNA聚合酶δ的辅助蛋白。在细胞核内存在可溶性与不溶性两种PCNA，可溶性PCNA在细胞周期各期中均有表达，其量在DNA合成过程中不发生明显变化，易被去污剂提取、甲醇破坏；不溶性PCNA较稳定，不易被去污剂洗脱、甲醇破坏，这种PCNA在G0～G1期细胞中无明显表达，G1晚期，其表达大幅度增加，S期达到高峰，G2～M期明显下降，其量的变化与DNA合成一致，检测其在细胞中的表达，可作为评价细胞增殖状态的一个指标[1,2,4]。

ERK
胞外信号调节激酶-----ERK
从细胞外刺激作用于细胞,至细胞出现相应的生物学效应,须通过MAPK信号转导通路的三级激酶级联反应。细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases,ERK)包括ERKl和ERK2,是将信号从表面受体传导至细胞核的关键。磷酸化激活的ERKl/2由胞质转位到核内,进而介导Elk-1,ATF,NF-κB,Ap-1,c-fos和c-Jun的转录活化,参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架的构建、细胞凋亡和细胞的恶变等多种生物学反应。遵循MAPKs的三级酶促级联反应，即上游激活蛋白→MAPK激酶的激酶（MAPKKK）→MAPK激酶（MAP-KK）→MAPK

细胞凋亡
1）DNA的片段化
　　细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA降解，这是一个较普遍的现象。
这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的DNA片段约为180-200bp的整倍数，而这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度，提示染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断，产生不同长度的寡聚核小体片段，实验证明，这种DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱，而坏死呈弥漫的连续图谱。

Caspase 3
即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程，到目前为止，至少已有14种Caspase被发现，Caspase分子间的同源性很高，结构相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根据功能可把Caspase基本分为二类：一类参与细胞的加工，如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二类参与细胞凋亡，包括caspase2,3,6,7,8,9.10

Akt
Akt又称PKB，即蛋白激酶B，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞存活和凋亡中起重要作用。胰岛素等生长和存活因子都可以激活Akt信号途径。Akt的Ser473可以被PDK1磷酸化。PI3K即磷脂酰肌醇-3激酶，PI3K-Akt信号途径是一条经典的信号途径，LY294002等PI3K的抑制剂抑制PI3K时，即可抑制PIP3的生成，阻断了Akt的活化。 Akt能磷酸化一系列蛋白成分，通过多种途径抑制细胞凋亡。
P I 3 K ／ A k t 通路被 认为是癌细胞存活的首要通路 。 有“ 抗 凋亡途径” 之 称。P I 3 K是一 种胞内磷脂酞肌醇激酶 ，本身具有 S e r ／ T h r ( 丝氨酸／ 苏氨酸) 激酶的活性 ， 也具有磷脂酞肌醇激酶的活性。 P I 3 K是许多生命活动中关键的信号分子 ， P I 3 K介导的信号 转导通路可以调节细胞的分裂 、 分化 、 凋亡等活动 。 近年发现 ， Ak t 是 P I 3 K下游直接的靶蛋 白， 具有丝氨 酸／ 苏氨酸残基 ， 可直接被 P I 3 K激活 ， 也可以被 P I 3 K 激活的 P D K1和 P DK 2激活。 在 P I 3 K途径中， 当上游 信号刺激细胞膜表面时 ，穿膜受体酪氨酸激酶 自磷 酸化或磷酸化其他底物后 ，可在细胞膜内表面产生 P I 3 K结合位点 ， P I 3 K结合后可产生一些磷脂 ，激活 其下游的 A k t ， 活化的 A k t ( p — A k t ) 可介导各种类型的 细胞生长 、 生存和分化 ， 同时还可上调抗凋亡基 因的表达 ， 抑制由 c ． my c诱导的细胞凋亡 ， 或活化细胞 内 其他信号转导通路 ， 调节细胞的适应性生存