参芪颗粒质量标准研究.pdf

142DOl:10.16720/ki.tcyj.2022.158Special Wild Economic Animal and Plant Research特产研究参芪颗粒质量标准研究张红岩，古伟玲，张桐语，秦鑫，杨振（吉林省中医药科学院，吉林长春130 0 12)摘要：为制定参芪颗粒质量标准。本研究采用薄层色谱法（TLC)对参芪颗粒中黄芪、益母草和大黄进行鉴别；采用高效液相色谱法(HPLC)对参芪颗粒中黄芪甲苷含量进行测定。参芪颗粒中薄层色谱鉴别专属性强，斑点清晰且阴性无干扰；参芪颗粒中黄芪甲苷的线性范围是0.498 1 8.96 52 ug(r=0.9982)，平均回收率为98.35%,RSD为1.16%（n=6)。薄层色谱鉴别和HPLC含量测定方法准确性高，重复性好，可有效控制参芪颗粒质量。关键词：参芪颗粒；薄层色谱法；高效液相色谱法；黄芪甲苷中图分类号：R286.0文献标识码：A文章编号：10 0 1-47 2 1(2 0 2 3)0 5-0 142-0 5Research on the Quality Standard for Shenqi GranulesZHANG Hongyan,GU Weiling,ZHANG Tongyu,QIN Xin,YANG Zhen*(Jilin Academy of Traditional Chinese Medicine,Changchun 130012,China)Abstract:In order to establish the quality standard of Shenqi granules.In this study,the Thin Layer Chromatography(TLC)was used forthe qualitative identification of Astragali Radix,Leonuri Herba and Rhei Radix et Rhizoma.The content of astragaloside IV was determinedby the High Performance Liquid Chromatography(HPLC).The specificity of TLC was strong,spots were clear and no negative interferencewas observed in Shenqi granules.The linear range of astragaloside IV was 0.498 18.965 2 g(r=0.998 2).The average recovery rate of as-tragaloside IV was 98.35%,the relative standard deviation(RSD)was 1.16%(n=6).TLC identification and content determination havehigh accuracy and good repeatability,which could effectively control the quality of Shenqi granules.Key words:Shenqi granules;thin layer identification;high performance liquid chromatography;astragaloside IV参芪颗粒是由黄芪、党参、肉桂、大黄和益母草等中药材经过水提、干燥等一系列处理后加入辅料而制备成的中药颗粒剂，主要用于脾肾气虚以及湿浊内蕴型慢性肾功能衰竭的治疗，临床应用中取得了较好的效果，现拟对其创新中药复方制剂开发进行研究。为了对成品有更好的控制方法，保证参芪颗粒在用药上的安全有效及质量可控，在前期完成了参芪颗粒制备工艺研究的基础上，我们又对制成的样品开展了一系列质量控制方法规范化研究，利用色谱技术手段对所得样品中各药材的组成成分开展了色谱鉴定研究。经过深入研究后，黄芪、益母草和大黄的TLC斑点鉴别显著，阴性无干扰，重复性好。此外，在试验中还研究了利用高效液相色谱法测定参芪颗粒制剂中重要药效成分黄芪甲苷含量的方法，对参芪颗粒3批样品内所含黄芪甲苷依据所确定方法进行测定，并确定了其含量限度。通过以上研究，为药品质量的控制打下坚实的基础。1仪器与试药1.1仪器高效液相色谱仪(LC-10ATvp型日本岛津)；蒸发光检测仪（ELSD-6000美国奥泰）；工作站(LCsolutionLite日本)；电子天平(XS105型梅特勒-托利多）；超声仪（2 50 W，频率为40 KHz昆山市超声仪器有限公司）。收稿日期：2 0 2 2-0 7-0 3基金项目：吉林省科技发展计划项目（2 0 2 0 0 40 40 7 1YY）作者简介：张红岩（196 4-），男，吉林长春人，大学本科，主任药师，主要从事中药化学及开发研究。通讯作者：杨振（198 2-），男，吉林德惠人，大学本科，副主任药师，主要从事中药化学及新药开发研究。第5期1.2试药盐酸水苏碱对照品（中检院，批号：110 7 12-2 0 1916，96.9%，供含量测定）；黄芪甲苷对照品（中检院，批号：110781-201717，96.9%，供含量测定）；大黄对照药材（中检院，批号：12 0 90 2-2 0 1311）；参芪颗粒（吉林紫鑫药业股份有限公司，3批参芪颗粒样品批号：2 0 2 10 7 0 1、20210702、2 0 2 10 7 0 3）；乙腈（液相流动相组成）为色谱纯；其他试剂为分析纯。2方法与结果2.1薄薄层色谱鉴别2.1.1黄芪薄层色谱鉴别钵中，研磨成粉末，加入含4%浓氨试液的8 0%甲醇溶液6 0 mL，30 m in 超声处理，过滤得滤液，将滤液蒸干，加入2 0 mL水使残渣溶解，以水饱和正丁醇为提取溶剂，2 0 mL/次，提取2 次，提取完成后合并正丁醇液，再使用30 mL正丁醇饱和水洗1次，蒸干正丁醇液，用1mL80%甲醇溶解残渣，即得供试品溶液。另使用80%甲醇为溶剂配制成1mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液。取不含黄芪的阴性样品10 g，按供试品制备方法制得阴性对照溶液。按薄层色谱法（中国药典2 0 2 0年版四部通则0 50 2）试验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液各5L、对照品溶液2 L，分别点于同一硅胶G薄层板点样，展开剂为三氯甲烷一甲醇一水（13:7:2)，展开完成后，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇试液显色，在10 5烘烤至斑点显色清晰。供试品色谱中，与黄芪甲苷对照品色谱对应的位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，薄层结果，见图1。2345注：1.黄芪甲苷对照品；2、3、4.供试品分别为批号2 10 7 0 1、2 10 7 0 2、2 10 7 0 3；5.阴性对照。Note:1.Astragaloside IV reference substance;2.3.4.Sample were batch num-ber 210701.210702.210703;5.The negative sample.Fig.1 TLC chromatogram of Astragalus张红岩，等：参芪颗粒质量标准研究2.1.2大黄薄层色谱鉴别取参芪颗粒10 g，置于研钵中,研磨成粉末，加入8 0 mL甲醇，进行30 min超声处理，过滤得滤液，将滤液蒸干，加水2 0 mL使残渣溶解,加盐酸2 mL后回流30 min，随即立即冷却，以三氯甲烷为提取溶剂进行提取，2 0 mL/次，提取2 次，提取完成后合并三氯甲烷液，蒸干，使用1mL三氯甲烷溶解残渣，即得供试品溶液。另取2 g大黄对照药材，按上述方法制得对照药材溶液。再取不含大黄的阴性样品10 g，同法制得阴性对照溶液。按薄层色谱法（中国药典2 0 2 0 年版四部通则0 50 2)试验，吸取上述取参芪颗粒10 g，置于研3种溶液各5L，于同一个硅胶G薄层板上点样，展开剂为石油醚（30 6 0)-甲酸乙酯-甲酸（15:5:1)的上层溶液，展开完成后，取出，晾干，置紫外光灯(36 5nm)下检视。供试品色谱中，与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色4个荧光斑点，阴性对照无干扰，薄层结果，见图2。2注：1.大黄对照药材；2、3、4.供试品分别为批号2 10 7 0 1、2 10 7 0 2、2 10 7 0 3；5.阴性对照。Note:1.Rheum palmatum reference drug;2.3.4.sample were batch number210701.210702.210703;5.The negative sample.Fig.2 TLC chromatogram of Rheum palmatum2.1.3益母草薄层色谱鉴别取参芪颗粒10 g，置于研钵中，研磨成粉末，加7 0%乙醇50 mL，超声处理30min，滤过，滤液浓缩至5mL，放冷，通过样品柱（采用中性氧化铝3g装柱），以50 mL70%乙醇溶液进行洗脱，并将洗脱液蒸干，以1mL无水乙醇为溶剂溶解残渣，即得供试品溶液。另取盐酸水苏碱对照品，以无水乙醇为溶剂制成1mg/mL的对照品溶液。再取不含益母草的阴性样品10 g，同法制得阴性对照溶液。按薄层色谱法（中国药典2 0 2 0 年版四部通则0 50 2）试图1黄芪TLC鉴别验，分别吸取10 L供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液，分别点于同一个硅胶G薄层板上，以丙酮一14334图2 大黄TLC鉴别5144无水乙醇一盐酸（10:6:1)为展开剂展开，取出，晾干，在10 5加热15min，放冷，喷以稀碘化铋钾试液和三氯化铁试液（10:1)混合溶液至斑点清晰显色。从薄层板斑点显色结果可看出，供试品与对照品色谱在相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，薄层结果见图3。特产研究试液及阴性对照液，按上述色谱条件测定，阴性无杂峰干扰，达到很好分离，见图4。1000150250.01802023年第45卷第5期2.66.07.5A10.012.5mn100寸500.0150100502.55.07.5B10.012.5min0.023注：1.盐酸水苏碱对照品；2、3、4.供试品分别为批号2 10 7 0 1、2 10 7 0 2、2 10 7 0 3；5.阴性对照。Note:1.Stachydrine hydrochloride reference substance;2.3.4.Sample werebatch number 210701.210702.210703;5.The negative sample.Fig.3TLC chromatogram of Leonurus japonicus2.2含量测定2.2.1 色谱条件色谱柱:YWC-C18(4.6mmx150mm,5m）；流动相：乙：水（50:50)；柱温：30；蒸发光散射检测器检测；液相漂移管温度：10 0，空气泵空气流速：2.8 L/min。理论板数按黄芪甲苷峰计算,不得低于40 0 0。2.2.2对照品溶液的制备取黄芪甲苷对照品（中检院，批号：110 7 8 1-2 0 17 17)适量，以8 0%甲醇为溶剂进行溶解，制成每1mL含0.2 5mg的溶液，即得。2.2.3供试品溶液的制备取参芪颗粒，置于研钵中，研磨成粉末,取1g,精密称定,置2 5mL量瓶中，加含4%浓氨试液的8 0%甲醇溶液2 0 mL，随后进行超声处理（2 50 w，40 k H z），40 m i n 后取出，放冷，用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液15mL，蒸干，残渣加水2 0 mL使溶解，用水饱和正丁醇提取，10mL/次，提取5次，将正丁醇液合并后蒸干，残渣用80%甲醇溶解并转移至5mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.2.4方法学考察2.2.4.1专属性试验取参芪颗粒中除去黄芪外其余药材，按工艺制成阴性样品，以上述拟定的方法制成供2.545图3益母草TLC鉴别5.0注：A.黄芪甲苷对照品；B.供试品；C.阴性；“1 为黄芪甲苷对照品。Note:A.Astragaloside IV reference substance;B.Sample;C.Negative sample;I Astragaloside IV reference substance.Fig.4HPLC chromatogram of Shenqi granules2.2.4.2线性范围考察取黄芪甲苷对照品，加8 0%甲醇制成0.498 1mg/mL的溶液,分别吸取0.5mL、1m L、3mL、5m L、7 m L和9 mL，分别放入10 mL瓶中,用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取上述对照品溶液各2 0 L，按2.2.1条件进行测定。以黄芪甲苷g数的Log值为横坐标,色谱峰峰面积积分值的Log值为纵坐标,绘制标准曲线。结果表明,在 0.498 1 8.96 52 g范围内，黄芪甲苷量的Log值与峰面积积分值的Log值为良好线性关系。回归方程为y=1.77x+5.54,相关系数 r=0.998 2。2.2.4.3精密度考察精密吸取2.2.3项下供试品溶液2 0 L，且连续进样6 次，测定峰面积积分值为373004、38 6 46 4、37 8 2 8 2、37 346 5、36 37 15 和37 6 7 59,RSD为1.42%，表明仪器精密度良好。2.2.4.4稳定性试验精密吸取2.2.3项下中同一份供试品溶液2 0 L,在不同时间点进样，进样时间0 h、2h、4h、8 h、12 h、2 4h、36 h、48 h。对应不同时间点测得得峰面积积分值分别为36 110 7、359 436、352 151、350201、359 6 11、36 36 2 2 和36 9 2 6 6。结果表明，黄芪甲苷峰面积积分值的RSD为1.8 2%，证明48 h内供试品溶液基本稳定。2.2.4.5重复性试验对同一批次参芪颗粒样品按2.2.3项下方法制备供试品溶液，共6 份，按照方法测定，6次测定结果分别0.6 0 16 mg/g0.6105mg/g.0.6024mg/g、7.5C图4参芪颗粒高效液相色谱图10.012.5第5期0.5975mg/g.0.5892mg/g 和 0.5996 mg/g,RSD=1.15%,测定结果表明，本方法重复性良好。2.2.4.6加样回收率试验取已知含量参芪颗粒样品6份（黄芪甲苷含量为0.6 0 2 mg/g），分别精密加入一样品号取样量/gSample No.Sample weight回收率11.015 8回收率21.003 2回收率30.989 8回收率41.000 2回收率50.9989回收率61.006 52.2.4.7木样品测定对中试规模制备的3批参芪颗粒样品中黄芪甲苷含量进行了测定，见表2。表2 参芪颗粒中黄芪甲苷含量测定结果Table 2 Content determination results of astragaloside IVin Shenqigranules批号Batch number2021070120210702202107033讨论3.1薄层色谱鉴别3.1.1黄芪鉴别黄芪为临床治疗的一味常见中药材,味甘，性微温，归肺、脾经，其主要功效为补气升阳、利水消肿、固表止汗、托毒排脓和生津养血等，在临床上多用于气虚乏力、纳差便塘及中气下陷等的治疗。根据研究表明，黄芪化学成分种类多样，多糖类、黄酮类和皂苷类等是主要化学成分，其中，黄芪甲苷是主要的皂苷类化学成分，在抗衰老、免疫调节、降糖调脂、抗菌和抗辐射等方面发挥重要作用1,2 。中国药典2 0 2 0 版一部黄芪鉴别项下中采用样品经4%浓氨试液的8 0%甲醇提取后进行鉴别，但本品为中药复方制剂，杂质多，若直接采用药典方法制备供试品溶液直接点样进行鉴别，干扰较大，故参考相关研究方法3-6 ,采用将样品的8 0%甲醇提取液蒸干后，经水溶解后用正丁醇提取，用水洗涤方法，可除去大部分色素等杂质，所制备的供试品溶液不黏稠，易于点样。采用药典薄层色谱条件进行鉴别7 ，供试品色谱中特征斑点清晰，杂质斑点少，方法重复性好，可作为制剂中黄芪鉴别方法。3.1.2大黄鉴别大黄其性寒，味苦，归脾胃、大肠、张红岩，等：参芪颗粒质量标准研究定量的黄芪甲苷对照品，按照2.2.3项下方法制备，进样测定并分析，计算回收率，黄芪甲苷平均回收率为98.35%,RSD=1.16%,见表 1。表1加样回收率测定结果Table 1 Recovery determination results含量/mg测得量/mgSample contentFound0.61151.20910.60391.20960.595 81.212 60.602 11.21460.601 31.216 40.60591.215 6黄芪甲苷含量/mg/袋）Astragaloside IV content9.09.59.6145对照品加入量/mg回收率/%AddedRecovery0.619896.420.619897.730.619 899.500.619898.820.619899.240.619898.37肝心包经，临床上主要用于实热积滞便秘、血热吐、目赤肿痛、痈肿疗疮、肠痈腹痛、瘀血经闭、产后瘀阻和跌打损伤等，可泻火攻积、清热泻火、?血解毒、逐瘀通经及利湿退黄。大黄化学成分主要集中在葱醌类、葱醌衍生物类和葱酮类等，同时也包括有机酸、糖类等，其中，葱类、葱酮类是大黄的有效成分8,9。据报道，大黄可在一定程度上治疗肾纤维化，其原理为骨形态发生蛋白-7（BMP-7）的表达因大黄素的存在而被促进，肾间质纤维化被延缓10 。在薄层鉴别试验中，参考药典及文献方法11,对比石油醚(30 6 0)-甲酸乙酯-甲酸（15:5:1)及正已烷-乙酸乙酯一冰醋酸（15:5:0.3)两种展开系统鉴别效果，结果以药典方法中展开系统鉴别效果最佳。3.1.3益母草鉴别益母草成分较复杂，主要为生物碱、黄酮类化学成分12 。鉴别试验中,参考中国药典2020版一部益母草鉴别项下供试品制备方法，增加氧化铝纯化步骤，可更好除去干扰物质，从而使鉴别特征斑点清晰，具有更好的重复性。3.2含量测定3.2.1系统适用性试验色谱条件选择中主要包括色谱柱和流动相选择,并主要参考文献测定方法13-18 ,在试验中，对比了下列色谱条件的分离情况：色谱柱主要包括 YWC-C18(4.6 mm250 mm,5 m)、A g i l e n tZorbax SB-C18(4.6 mmx250 mm,5 m)和 Ultimate-C18(4.6mm250mm,5m）；流动相主要包括：乙腈：水（49:51）、乙腈：水（50:50)和乙腈：水（51:49）。试验结果表明，通过上述3种色谱柱分别与3种不同比例乙：水流动相组成不同的色谱条件，以分离度、色谱峰形状、保留时间等相关因素进行考察，最终以YWC-C18(4.6mm250mm,5m)色谱柱与乙腈:水(50:50)组合，分离效果最好，故选择为色谱条件。平均回收率/%Averagerecovery98.35RSD(%)1.161463.2.2参芪颗粒样品溶液制备方法选择3种溶剂被用于提取考察，结果表明，以乙醇、甲醇和8 0%甲醇为溶剂,超声40 min获得的参芪颗粒样品中黄芪甲苷含量分别为0.4936 mg/g、0.57 7 4mg/g 和0.6 0 32 mg/g,样品中黄芪甲苷含量最高的是8 0%甲醇进一步对超声提取30 min和超声提取50 min获得供试品中黄芪甲苷含量进行了考察，结果分别为0.552 2 mg/g和0.6036mg/g，表明提取40 min，黄芪甲苷可被完全提取。3.2.3耐用性试验取同一批号样品，参照上述测定条件，考察在测定条件有小的变动时对测定结果的影响程度。试验主要考察了不同品牌色谱柱、不同柱温和不同流动相配比等变动因素对测定结果的影响。本试验选用YWC-C18、A g i l e n t ZO RBA XSB-C18、Shimpack-C183个不同品牌的色谱柱测得样品中黄芪甲苷含量分别为：0.6 0 0 1mg/g、0.6 10 1mg/g 和0.598 4mg/g;采用YWC-C18色谱柱，分别在2 5、30、35条件下测得样品中黄芪甲苷含量分别为：0.6 0 6 9mg/g、0.6001mg/g和0.59 6 3mg/g;选择乙腈一水（50:50)、乙腈一水（49:51）、乙一水(51:49)3个比例流动相测得黄芪甲苷含量分别为0.597 5mg/g、0.5937 m g/g 和0.5827mg/g。上述试验结果表明，在色谱条件有微小变化时，样品中黄芪甲苷含量无明显变化，本方法耐用性良好。本研究通过薄层鉴别和高效液相方法建立参芪颗粒质量标准，以期为后续开发新药奠定基础。参考文献1胡妮娜,张晓娟.黄芪的化学成分及药理作用研究进展 .中医药信息,2 0 2 1,38(1)：7 6-8 2.2周家林，慕泽泾，钟国跃，等.黄芪属植物化学成分及生物活性研究进展J.中成药,2 0 2 1,43(7)：18 45-18 51（上接第137 页）13李晓琦，王琪，陈彦.不同产地子中重金属的含量测定及健康风险评估J.中华中医药杂志，2 0 2 2,37(2)：10 41-10 46.14】卜桐，于晓，张欣芮，等.金银花中重金属污染分析及其健康风险评估J.中国中药杂志,2 0 2 2,47(3)：6 43-6 50.15王莹,金红宇,李耀磊，等.何首乌中外源性有害残留物的风险评估与其致肝毒相关性初评J.中国药事，2 0 2 2,36(10)：1134-1146.16蔡元元，徐滨.ICP-MS法测定谷精草中重金属及有害元素残留J.中国医药导刊，2 0 2 2,2 4(5)：50 4-50 7.17王莹,金红宇,李耀磊，等.何首乌中外源性有害残留物的风险评估与其致肝毒相关性初评J.中国药事,2 0 2 2,36(10)：1134-1146.18陈芳芳，李志刚，王晓琳，等.西洋参和铁皮石斛中重金属元素的污染情况及健康风险评估J.预防医学论坛,2 0 2 2,2 8(10):730-733.特产研究3崔亚玲，胡北,姚东，等.补阳还五颗粒质量标准研究J.实用药物与临床,2 0 19,2 2(9):9 6 4-9 6 7.4方春雪,高梓漠,王法宇，等.祛湿健脾颗粒薄层鉴别研究J.中国中医药现代远程教育，2 0 19,17(2 2)：112-114.5陈平，米完完，应园园，等.复方健肾颗粒的质量控制研究 .中国现代医生，2 0 19,57(36)：37-43.6王艺璇,李海涛,刘顺,等.参葵通脉颗粒的质量标准研究J.中药新药与临床药理，2 0 2 0,31(8):98 4-98 9.7国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部S.北京：中国医药科技出版社，2 0 2 0:315-316.8杨滢.大黄药效成分及其药理活性研究进展J.中医临床研究,2 0 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