茶多酚的经皮渗透特征及其对UVA致HSF氧化损伤的保护作用.pdf

第 53 卷 第 9 期2023 年 9 月Vol.53 No.9Sep.20231035 日 用 化 学 工 业（中英文）China Surfactant Detergent&Cosmetics Received:August 11,2022;Revised:August 29,2023.*Corresponding author.Tel.:[phone],E-mail:.湖州市科技特派员项目（2021KT06）DOI：10.3969/j.issn.2097-2806.2023.09.006Percutaneous permeation characteristics of tea polyphenols and its protective effect on human skin fibroblasts under the oxidative damage of ultraviolet AYixinShen1,LirongTang2,HuiZhang1,*（1.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou,Zhejiang 310058,China;2.Hangzhou Qiandao Lake Tianxin Co.,Ltd.,Hangzhou,Zhejiang 310058,China）Abstract:The aim was to study the transdermal penetration characteristics of tea polyphenols and explore the protective effect of tea polyphenols on UVA-induced oxidative damage in human skin fibroblasts（HSF）.Using the Franz diffusion cell with rat skin as a barrier,a well-performed detection method was established to detect the percutaneous penetration indexes of catechin,epicatechin,epicatechin gallate and epigallocatechin gallate in tea polyphenols by high performance liquid chromatography（HPLC）.The model of HSF damaged by UVA was established to explore the effect of tea polyphenols on the content of reactive oxygen species（ROS）,the level of malondialdehyde（MDA）,the enzymatic activity of superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH-Px）in cells.The results show that the detection method has good specificity,precision and average recovery.The transdermal permeability of catechin and epicatechin increase gradually with the increase of time,and the infiltration rate of epicatechin is greater than that of catechin.However,the transdermal permeability of epicatechin galate and epigallocatechin galate can not be detected in the 24 h experiment,but the two substances remain more in the skin,indicating that the four substances in tea polyphenols can be applied to the skin well.Besides,tea polyphenols have significant protective effect on UVA-induced oxidative damage in HSF by reducing the content of ROS and the level of MDA,increasing the enzymatic activity of SOD and GSH-Px.Key words:tea polyphenols;percutaneous penetration;ultraviolet A radiation;human skin fibroblasts;oxidative damageDiffusion poolRatskinReceivingpoolFranz transdermal diffuserTea polyphenolsHumanskinfibroblastsCorium layerSubcutaneous tissueTea polyphenolsCatechinEpicatechinEpicatechin gallateEpigallocatechin gallateROSTPUVBUVAEpidermis layer1036第 53 卷开发与应用日 用 化 学 工 业（中英文）茶多酚是茶叶中多羟基酚类化合物的总称，其主体成分儿茶素类化合物约占茶多酚总量的60%80%。目前，茶多酚应用于化妆品中已成为国内外研究和市场开发的重点，相关研究1-11发现茶多酚具有抗氧化、抗炎、吸收紫外线、抗衰老、保护肌肤弹性等功能，具有十分广泛的研究价值和应用前景。皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成，是具有通透性的屏障，皮肤的吸附、渗透和吸收作用是复杂的，活性物质经皮渗透吸收后，可发挥其功能性作用12。物质作用于皮肤并发挥相关作用的关键是该物质需渗透皮肤并维持一段时间。因此，为探索茶多酚作用于皮肤上的功效机制，研究其经皮渗透特征至关重要。紫外线是日常生活中最常见的射线，根据不同波长范围，紫外线可分为短波紫外线（UVC）（200 290 nm）、中波紫外线（UVB）（290320 nm）和长波紫外线（UVA）（320400 nm），其中UVA到达人体皮肤的能量占紫外线总能量的90%，其穿透能力强，可直达皮肤真皮层，损伤人皮肤成纤维细胞（Human skin fibroblasts，HSF）13。此外，UVA辐射诱导产生的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）可进一步引起蛋白质、脂类和碳水化合物的氧化损伤，诱导细胞凋亡，介导炎症反应等14，从而引起皮肤的氧化损伤。茶多酚对人体皮肤有显著的保护作用，研 究15表明，与紫外线照射组相比，绿茶多酚可以减少细胞DNA损伤。表没食子儿茶素没食子酸酯是茶多酚中重要的功能成分之一，外用可有效抑制受试者皮肤炎症、细胞脂质过氧化和皮肤细胞DNA损伤16。表儿茶素没食子酸酯还能预防UVB和UVA诱导的细胞毒性，减少细胞凋亡，对皮肤紫外损伤老化有很好的预防作用17。本研究通过建立特异性、精密度和准确度高的经皮渗透检测方法，通过检测茶多酚的经皮渗透量、经皮渗透率、皮内滞留量等指标，探究茶多酚中各组分的经皮渗透特征，为茶多酚后期应用提供理论依据。通过建立UVA损伤HSF细胞模型，结合研究HSF细胞中氧化与抗氧化系统的相关指标水平变化，探究茶多酚对UVA致HSF细胞氧化损伤的保护作用机理。1 实验部分1.1 主要材料、试剂与仪器SPF级SD雄性大鼠，体质量（20020）g，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，合格证编号为NO.202118551；人皮肤成纤维（HSF）细胞，上海青旗生物技术发展有限公司。茶多酚（TP90%），长兴三聚生物科技有限公司；甲醇（HPLC，99.9%）、冰乙酸（HPLC，99.9%）、二甲基亚砜，上海阿拉丁公司；EDTA二钠、聚乙二醇400（PEG400）、儿茶素对照品（HPLC，98%）、表儿茶素对照品（HPLC，98%）、表儿茶素没食子酸酯对照品（HPLC，98%）、表没食子儿茶素没食子酸酯对照品（HPLC，98%），上海源叶生物科技有限公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素-链霉素溶液，大连美仑生茶多酚的经皮渗透特征及其对UVA致HSF氧化损伤的 保护作用沈轶昕 1，唐礼荣 2，张 辉 1,*（1.浙江大学 生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058；2.杭州千岛湖天鑫有限公司，浙江 杭州 310058）摘要：研究了茶多酚的经皮渗透特征，探究茶多酚对长波紫外线（UVA）诱导的人皮肤成纤维细胞氧化损伤的保护作用机理。采用Franz扩散池，以大鼠皮肤为屏障，建立了完善的检测方法，用高效液相色谱检测茶多酚中儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯的经皮渗透指标；通过建立UVA损伤HSF细胞模型，探究了茶多酚对细胞活性氧含量、丙二醛水平、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响。结果表明该检测方法具有较好的专属性、精密度和加样回收率，且茶多酚中的儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯4种物质均可较好地作用于皮肤，其中表儿茶素在透皮释放方面具有明显优势。茶多酚通过降低UVA辐照后HSF细胞中的ROS含量和MDA水平，可提高细胞内SOD和GSH-Px活力，对UVA诱导的HSF细胞氧化损伤具有良好的保护作用。关键词：茶多酚；经皮渗透；长波紫外线辐射；人皮肤成纤维细胞；氧化损伤中图分类号：TQ658 文献标识码：A 文章编号：2097-2806（2023）09-1035-091037第 9 期开发与应用沈轶昕，等：茶多酚的经皮渗透特征及其对UVA致HSF氧化损伤的保护作用 物技术有限公司；CCK-8细胞活力检测试剂盒、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）测试试剂盒、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）测试试剂盒、蛋白定量测试试剂盒、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）测试试剂盒和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）测试试剂盒，南京建成科技有限公司；细胞裂解液（无抑制剂），碧云天生物技术有限公司。分析天平，Mettler Toledo公司；台式高速离心机，Cence湘仪公司；高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；药物透皮扩散试验仪，上海黄海药检仪器有限公司；Infinite M2000酶标仪，瑞士Tecan公司；UVA辐照设备，深圳冠雅光电科技有限公司。1.2 茶多酚经皮渗透特征实验1.2.1 样品处理茶多酚用供药池所用溶液（含10%PEG的0.9%生理盐水）溶解，制备2 mg/mL的茶多酚样品。取200 L样品溶液通过0.22 m滤膜，装入进样瓶待测。1.2.2 色谱条件色谱柱：Hedera ODS-2（250 mm4.6 mm，5 m）。流动相A：0.1%EDTA二钠，0.2%乙酸水；流动相B：0.1%EDTA二钠，0.2%乙酸甲醇。采用梯度洗脱方法，具体洗脱程序见表1，流速：1.0 mL/min；进样量：10 L；柱温：35；检测波长：278 nm。表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedure时间/min（A）/%（B）/%0.0095 5 5.00703011.00821825.00505028.0095 530.0095 51.2.3 线性关系考察分别将对照品儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯以超纯水定容，配制成500，250，100，50，25，10，5，1，0.5 g/mL 的标准工作液，高效液相色谱测定峰面积。以峰面积为纵坐标（y），质量浓度为横坐标（x）拟合标准曲线，得到标准曲线回归方程及相关系数（R）。1.2.4 方法学考察方法参照国标GB/T 278182011和中华人民共和国药典。精密称量对照品儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯10 mg，在10 mL容量瓶中以接收液（含10%PEG的0.9%生理盐水）定容，稀释成50 g/mL的混合对照品溶液。取阴性溶液（空白透皮接收液）、混合对照品溶液与茶多酚样品溶液，用高效液相色谱进行检测，考察方法的专属性；取混合对照品溶液，重复进样 6次，计算相对标准偏差RSD值，以考察仪器的精密度；茶多酚样品溶液稀释10倍后，间隔0，6，12，24 h进样，以样品质量浓度为指标计算RSD值，考察样品的稳定性；配制25，50，75 g/mL质量浓度的混合对照品溶液，将上述溶液重复进样3次，分析计算各物质质量浓度，考察各物质的加样回收率。1.2.5 离体皮肤制备大鼠以断颈法处死后剃净背部毛发，剥离背部皮肤，去净皮下脂肪组织，剪至合适大小，生理盐水冲洗干净后即刻使用。1.2.6 体外经皮渗透试验用滤纸吸干皮肤表面多余水分，然后将皮肤固定在FRANZ扩散池上，角质层面向扩散池，真皮层面向接收池并且与接收液紧密接触至无气泡。接收池中加入已排净气泡并预热至32 的接收液（10%PEG400，90%生理盐水）。吸取2 mL样品溶液于扩散池中，用封口膜密封扩散池开口处，开启透皮仪，扩散仪恒温（32.00.5），磁子转速200 r/min，试验开始后1，2，4，6，8，12，16，24 h取样，每次取样0.5 mL（并补充相同温度相同体积的接收液），过0.22 m滤膜，4 密封待测。试验24 h后，吸取扩散池中样品1 mL，过0.22 m滤膜，进行待测物含量测定。将鼠皮沿有效扩散面积剪下，用5 mL甲醇超声提取1 h，室温冷却，经12 000 r/min离心后，取上清液过0.22 m滤膜待测。以上收集的样品溶液用高效液相色谱进行检测分析，计算样品累积渗透量Qn（g/cm2），计算公式 如下：式中：A为有效扩散面积（cm2），V0为接收液总体积（mL），V为取样体积（mL），n为第n次取样点测得的样品质量浓度（g/mL），i为第i次取样点测得的样品质量浓度（g/mL）。以样品的累计渗透量Qn为纵坐标，透过时间t为横坐标，绘制累计渗透曲线。取曲线中的直线部分进行线性回归，所得斜率为样品的稳态渗透速率 Js（g/（cm2 h）。直线部分反向延长线与X轴的交点即为时滞时间（h）。（n V0+iV）An-1i=1?Qn=1038第 53 卷开发与应用日 用 化 学 工 业（中英文）1.3 茶多酚对UVA致HSF细胞氧化损伤保护作用实验1.3.1 HSF细胞培养将人皮肤成纤维细胞（HSF）复苏，用DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清，1%双抗），于37，5%CO2的培养箱内进行培养。待细胞铺满培养皿的80%90%时，HSF细胞呈现为细长梭形，此时可进行传代处理。1.3.2 UVA辐照剂量的确定选择对数生长期的HSF细胞，胰酶消化离心弃上清液，调整细胞悬浮液浓度为5104 个/mL，每孔200 L细胞悬浮液接种于96孔板，置于37，5%CO2的培养箱内培养24 h。UVA细胞辐照剂量分别为1.8，3.6，7.2，14.4，28.8 J/cm2，辐照后于37，5%CO2的培养箱内培养24 h。加入10 L CCK-8溶液，5%CO2，37 恒温培养箱中培养3 h。酶标仪检测450 nm处的吸光度值，计算细胞增殖率以确定合适的辐照剂量，细胞增殖率计算公式如下：式中：A1表示UVA辐照，含有细胞、CCK-8溶液的孔的吸光度；A2表示含有CCK-8溶液，没有细胞的孔的吸光度；A3表示含有细胞、CCK-8溶液的孔的吸光度。1.3.3 茶多酚对HSF细胞安全剂量的确定用含不同质量浓度（10，50，100和500 g/mL）茶多酚的DMEM培养基（不含胎牛血清、双抗）处理细胞，置于37，5%CO2的培养箱内培养24 h。按“1.3.2”中CCK-8法测定细胞增殖率。1.3.4 茶多酚对UVA致HSF细胞氧化损伤的指标 检测选择对数生长期的HSF细胞，胰酶消化离心弃上清液，调整细胞悬浮液浓度为1105 个/mL，每孔200 L细胞悬浮液接种于12孔板，置于37，5%CO2的培养箱内培养24 h。吸出旧培养基，用不同质量浓度（10，50，100 g/mL）茶多酚的DMEM培养基（不含胎牛血清、双抗）处理2 h。用辐照剂量为14.4 J/cm2的UVA辐照细胞，辐照后吸出旧培养基，加入含不同质量浓度的茶多酚的DMEM培养基（不含胎牛血清、双抗）于37，5%CO2的培养箱内培养24 h。实验分组：空白对照组（不经UVA辐照、不加茶多酚）；UVA辐照模型组（14.4 J/cm2 UVA辐照细胞，不加茶多酚）、药物组（14.4 J/cm2 UVA辐照细胞，不A3-A2A1-A2细胞增殖率=100%同质量浓度茶多酚无血清培养基处理）。收集细胞，按照ROS测定试剂盒、MDA测定试剂盒、蛋白定量测定试剂盒、SOD测定试剂盒和GSH-Px测定试剂盒中的测定方法，检测细胞内ROS和MDA水平，SOD和GSH-Px的酶活性变化。1.4 数据处理所有实验重复进行3次，用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析和Duncan多重比较，结果表示为平均 值标准差，当P0.05时表示结果间差异显著。绘图采用Origin 9.0软件。2 结果与讨论2.1 茶多酚经皮渗透特征试验2.1.1 各组分线性关系如表2所示，儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯在相应的质量浓度范围内，r值均为0.999 9，呈良好的线性关系，符合标准。表2 各组分线性关系Tab.2 Linear relationship of each component对照品回归方程r线性范围/（g/mL）儿茶素y=6 498.2x+1 122.90.999 91500表儿茶素y=7 213.9x-237.090.999 91500表 儿茶素没食子酸酯y=16 399x-2 703.40.999 91500表 没食子儿茶素没食子酸酯y=11 322x-869.780.999 915002.1.2 方法学考察结果儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯在茶多酚中的含量占比分别为7%，8%，16%和55%。如图1所示，茶多酚中各组分与对照品组分保持一致，且各组分间均实现很好的分离度，阴性溶液对茶多酚中各组分的检测无干扰。如表3所示，在仪器精密度和加样回收率检测中，儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯的RSD值均小于3%，说明该方法的仪器精密度和回收率良好；在样品稳定性检测中，茶多酚中的儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯的RSD值均小于3%，说明茶多酚中的儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯在24 h内稳定性良好，而茶多酚中的表没食子儿茶素没食子酸酯的RSD值为12.22%，说明茶多酚中的表没食子儿茶素没食子酸酯在24 h内较1039第 9 期开发与应用沈轶昕，等：茶多酚的经皮渗透特征及其对UVA致HSF氧化损伤的保护作用 不稳定，这与表没食子儿茶素没食子酸酯结构中有 6个酚羟基，易发生降解、氧化及异构化等有关18。表3 仪 器精密度、样品稳定性、加样回收率考察结果（RSD值，n=3）Tab.3 Re sults of instrument precision,sample stability and recovery rate（RSD,n=3）组分仪器精密度/%样品稳定性/%加样回收率/%儿茶素0.97 0.450.32表儿茶素0.77 2.630.53表 儿茶素没食子酸酯0.42 0.480.27表 没食子儿茶素没食子酸酯0.6712.220.392.1.3 茶多酚经皮渗透动力学方程如图2所示，茶多酚中的儿茶素和表儿茶素从8 h开始可在接收池中检测到，且其经皮渗透量随着时间的增加逐步增加，而表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯在24 h的检测时间内，不能透过皮肤在接收池中检测到。根据曲线进行拟合，得到各组分的透皮参数如表4所示，表儿茶素的渗透速率大于儿茶素，且表儿茶素的时滞小于儿茶素，说明茶多酚中的表儿茶素在透皮释放方面具有优势。表4 茶多酚中各组分的透皮参数Tab.4 Transdermal parameters of tea polyphenols组分稳态渗透速率方程渗透速率/（g/（cm2 h）时滞/h儿茶素y=1.406x-10.881.4067.74表儿茶素y=2.614 1x-19.3522.614 17.40表 儿茶素没食子酸酯表 没食子儿茶素没食子酸酯2.1.4 茶多酚扩散池残留量、皮内滞留量和经皮累积渗透量表5为茶多酚中各组分的透皮扩散分布量。儿茶素和表儿茶素大部分残留在扩散池中，而表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯大部分残留在皮肤内，说明表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯可较好地停留在皮肤内发挥作用。表儿茶素的经皮累积渗透量大于儿茶素，而表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯无经皮累积渗透量，说明表儿茶素的透皮扩散效果较好。表没食子儿茶素没食子酸酯的总体回收率小于80%，这与“2.1.2”中表没食子儿茶素没食子酸酯在24 h内不稳定 有关。图1 对 照品溶液（a）、茶多酚溶液（b）、阴性溶液（c）的高效液相色谱图（1.儿茶素；2.表没食子儿茶素没食子酸酯；3.表儿茶素；4.表儿茶素没食子酸酯）Fig.1 HP LC Chromatograms of reference solution（a）,tea polyphenol solution（b）,negative solution（c）（1.Catechin;2.Epigallocatechin gallate;3.Epicatechin;4.Epicatechin gallate）0?/min12344321302520151050?/min302520151050?/min?30252015105图2 茶多酚中各组分的透皮扩散曲线Fig.2 Transdermal diffusion curves of tea polyphenols605040302010012468121624?/h?1040第 53 卷开发与应用日 用 化 学 工 业（中英文）2.2 茶多酚对UVA致HSF细胞氧化损伤的保护作用2.2.1 UVA辐照剂量的确定如图3所示，分别用1.8，3.6，7.2，14.4，28.8 J/cm2 剂量的UVA辐照HSF细胞，实验结果发现，随着UVA辐照剂量的增加，HSF细胞的增殖率逐渐降低，呈现出显著的剂量依赖性（P0.05），说明UVA辐照会诱导细胞凋亡。14.4 J/cm2剂量的UVA辐照细胞后，HSF细胞增殖率为50%，因此确定UVA辐照HSF细胞的半致死剂量为14.4 J/cm2，并采用该剂量进行后续茶多酚对UVA致HSF细胞氧化损伤的保护作用研究23。2.2.2 茶多酚对HSF细胞增殖率的影响如图4所示，随着茶多酚质量浓度的增加，HSF细胞的增殖率逐渐降低。当茶多酚质量浓度为500 g/mL时，HSF细胞的增殖率在40%以下，说明高质量浓度的茶多酚对HSF细胞有一定的细胞毒性。当茶多酚质量浓度在100 g/mL以下时，HSF细胞增殖率在85%以上，故选用10，50，100 g/mL的茶多酚进行后续实验研究。2.2.3 茶多酚对UVA损伤HSF细胞内ROS相对含量的影响ROS包括羟自由基、超氧阴离子自由基，单线态图3 UV A辐照对HSF细胞增殖率的影响（a，b，c，d，e表示不同组之间的差异性，P0.05）Fig.3 Ce ll proliferation rate of UVA on HSF（a,b,c,d and e represent differences among different groups,P0.05）100a8060402001.83.67.214.428.8UVA/(J/cm2)?/%bcde氧和过氧化物。ROS的升高可激活细胞内信号通路，导致细胞氧化应激的产生19，当ROS在细胞中大量积累时，会造成细胞DNA损伤，加速细胞的衰老20。而UVA可通过激活NADPH酶21和糖化产物的光敏反应产生超氧阴离子自由基22，也可通过与HSF细胞内生色团如卟啉发生光敏反应生成单线态氧23。如图5所示，UVA辐照诱导HSF细胞内ROS含量显著上表5 茶多酚中各组分的透皮扩散分布量Tab.5 Transdermal diffusion distribution of tea polyphenols组分扩散池残留量/（g/cm2）皮内滞留量/（g/cm2）经皮累积渗透量/（g/cm2）儿茶素 54.5821.07 12.355.2022.805.96表儿茶素 80.3729.43 16.996.2542.988.40 表儿茶素没食子酸酯 80.2444.92 94.8233.64 0.000.00表没食子儿茶素没食子酸酯215.62134.63233.5489.92 0.000.00图4 不 同质量浓度的茶多酚对HSF细胞增殖率的影响（a，b，c表示不同组之间的差异性，P0.05）Fig.4 Ce ll proliferation rate of different mass concentrations of tea polyphenols on HSF（a,b and c represent differences among different groups,P0.05）100120a8060402001050100500?/(g/mL)?/%abc图5 茶 多酚对UVA辐照HSF细胞ROS的影响（a，b表示不同组之间的差异性，P0.05）Fig.5 Ef fect of tea polyphenols on ROS in HSF treated by UVA（a and b represent differences among different groups,P0.05）100120140160180200b806040200?ROS?/%aaab10 g/mL 50 g/mL 100 g/mL?1041第 9 期开发与应用沈轶昕，等：茶多酚的经皮渗透特征及其对UVA致HSF氧化损伤的保护作用 升（P0.05），辐照后HSF细胞内ROS相对含量增加至166%，100 g/mL的茶多酚可显著降低UVA辐照后HSF内ROS的含量（P0.05），说明茶多酚可以通过降低细胞内ROS含量，保护细胞并减少UVA导致的氧化损伤。2.2.4 茶多酚对UVA损伤HSF细胞内MDA含量的影响细胞内MDA的含量可反映细胞氧化损伤的程度。如图6所示，UVA辐照导致HSF细胞内MDA含量从31 nmol/（mg prot）显著升高至48 nmol/（mg prot）（P0.05）。随着茶多酚质量浓度的升高，细胞内MDA含量逐渐下降，呈浓度依赖性，100 g/mL的茶多酚作用于细胞后，HSF细胞内MDA含量从48 nmol/（mg prot）显著降低至32 nmol/（mg prot）（P0.05）。细胞内ROS的过量积累诱导细胞发生氧化应激，导致细胞内脂质发生过氧化生成MDA等物质，这其中包括ROS破坏细胞膜中的磷脂，引发膜脂质过氧化的链式反 应24，而茶多酚处理可以抑制UVA辐照导致HSF细胞内MDA含量的升高，减少细胞氧化应激反应带来的 损伤。2.2.5 茶多酚对UVA损伤HSF细胞内SOD活性的 影响如图7所示，HSF细胞内SOD活力经UVA辐照诱导后从21 U/（mg prot）显著下降至13 U/（mg prot）（P0.05）。在10，50，100 g/mL的茶多酚干预后，HSF细胞中的SOD活性有所提高，呈现一定的剂量依赖性，且100 g/mL的茶多酚组显著提高至17 U/（mg prot）（P0.05）。HSF细胞中有完善的氧化与抗氧化酶系，如SOD及GSH-Px等，它们可以清除细胞内ROS，图6 茶 多酚对UVA辐照HSF细胞MDA的影响（a，b表示不同组之间的差异性，P0.05）Fig.6 Ef fect of tea polyphenols on MDA in HSF treated by UVA（a and b represent differences among different groups,P0.05）5060b403020100?MDA?/(nmol/(mg prot)aababb10 g/mL 50 g/mL 100 g/mL?减少细胞的氧化损伤，维持细胞内环境的稳定和氧化平衡25。SOD是HSF细胞中的金属蛋白酶，可以催化ROS的歧化反应，降低ROS对细胞的损伤。因此，研究结果表明茶多酚处理可有效恢复辐照细胞的抗氧化能力，从而降低细胞的氧化损伤。2.2.6 茶多酚对UVA损伤HSF细胞内GSH-Px活性的影响GSH-Px是存在于HSF细胞中的一种催化过氧化氢分解的酶，可以保护细胞膜的结构完整和功能正 常26，其活力可以反映HSF细胞的抗氧化应激状态。如图8所示，UVA辐照导致HSF细胞内GSH-Px活力从63 U/（mg prot）显著下降至44 U/（mg prot）（P0.05），而茶多酚可以提高HSF细胞内GSH-Px活力，且随着茶多酚质量浓度提高至100 g/mL，细胞内GSH-Px活力图7 茶 多酚对UVA辐照HSF细胞SOD的影响（a，b，c表示不同组之间的差异性，P0.05）Fig.7 Ef fect of tea polyphenols on SOD in HSF treated by UVA（a,b and c represent differences among different groups,P0.05）2025a151050?SOD?/(U/(mg prot)ccbcb10 g/mL 50 g/mL 100 g/mL?图8 茶 多酚对UVA辐照HSF细胞GSH-Px的影响（a，b，c表示不同组之间的差异性，P0.05）Fig.8 Ef fect of tea polyphenols on GSH-Px in HSF treated by UVA（a,b and c represent differences among different groups,P0.05）6070a50402030100?GSH-Px?/(U/(mg prot)ccbcb10 g/mL 50 g/mL 100 g/mL?1042第 53 卷开发与应用日 用 化 学 工 业（中英文）从44 U/（mg prot）提高至55 U/（mg prot），具有良好的质量浓度依赖性。因此，茶多酚可有效地提高UVA辐照后HSF内GSH-Px活力，促使细胞内积累的过氧化物还原为无毒的羟基化合物，减少细胞因UVA辐照导致的氧化损伤。3 结论茶多酚中含儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯，其中表没食子儿茶素没食子酸酯在24 h检测环境内较不稳定。本文通过建立方法专属性好、仪器精密度高、样品回收率高的检测方法，研究了茶多酚中各组分的经皮渗透特征。实验结果显示儿茶素和表儿茶素可在24 h实验中检测到经皮渗透量，且经皮渗透量随着时间的增加逐步增加，表儿茶素的渗透速率大于儿茶素。而表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯在24 h实验中不能检测到经皮渗透量，但两种物质较多残留在皮内，说明茶多酚中的这四种物质均可较好地作用于皮肤，进而发挥相应的作用。此外，探究了茶多酚对UVA致HSF细胞氧化损伤的保护作用机理。结果发现，UVA辐照可诱导HSF细胞发生氧化应激反应，而茶多酚处理后，通过减少UVA辐照后HSF细胞中的ROS含量，降低细胞内脂质氧化水平，并提高细胞内SOD，GSH-Px活力，从而提升HSF细胞抵抗氧化应激的能力，有效地降低了UVA辐射导致的细胞氧化损伤程度。综上所述，茶多酚作为活性功效成分，可较好地渗透并作用于皮肤，改善皮肤细胞氧化损伤，在化妆品、保健品等相关领域中具有良好的应用前景。参考文献：1 Roh E,Kim J E,Kwon J Y,et al.Molecular mechanisms of green tea polyphenols with protective effects against skin photoaging J.Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2017,57（8）:1631-1637.2 Vergne M J,Patras A,Bhullar M S,et al.UV C Irradiation on the quality of green tea:Effect on catechins,antioxidant activity,and cytotoxicity J.Journal of Food Science,2018,83（5）:1258-1264.3 Kaewkod T,Bovonsombut S,Tragoolpua Y.Efficacy of kombucha obtained from green,oolong,and black teas on inhibition of pathogenic bacteria,antioxidation,and toxicity on colorectal cancer cell line J.Microorganisms,2019,7（12）:700.4 Sun L,Zhang Y,Zhang W,et al.Green tea and black tea inhibit proliferation and migration of HepG2 cells via the PI3K/Akt and MMPs signalling pathway J.Biomedicine&Pharmacotherapy,2020,125:109893.5 Liu J,Hao W,He Z,et al.Beneficial effects of tea water extracts on the body weight and gut microbiota in C57BL/6J mice fed with a high-fat diet J.Food&Function,2019,10（5）:2847-2860.6 Brand R M,Wipf P,Durham A,et al.Targeting mitochondrial oxidative stress to mitigate UV-induced skin damage J.Frontiers in Pharmacology,2018,9:920.7 Megow I,Darvin M E,Meinke M C,et al.A randomized controlled trial of green tea beverages on the in vivo radical scavenging activity in human skin J.Skin Pharmacology and Physiology,2017,30（5）:225-233.8 Pires F,Geraldo V P N,Antunes A,et