产琥珀酸放线杆菌利用甘薯粉产丁二酸发酵条件优化.pdf

李时勇，韦秋丽，覃琼慧，等.产琥珀酸放线杆菌利用甘薯粉产丁二酸发酵条件优化 J.食品工业科技，2023，44（20）：108115.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120045LIShiyong,WEIQiuli,QINQionghui,etal.OptimizationofSuccinicAcidProductionfromSweetPotatoPowderbyActinobacillussuccinogenesJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(20):108115.(in Chinese with English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120045 生物工程 产琥珀酸放线杆菌利用甘薯粉产丁二酸产琥珀酸放线杆菌利用甘薯粉产丁二酸发酵条件优化发酵条件优化李时勇1，韦秋丽1，覃琼慧1，李枢妍1，陈福慧1，宋超东1，张红岩1，秦艳2，梁戈2，姜明国1，申乃坤1,*（1.广西民族大学海洋与生物技术学院，广西多糖材料与改性重点实验室，广西南宁530008；2.广西科学院，广西南宁530007）摘要：为了优化产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）发酵甘薯粉生产丁二酸的发酵培养基，提高丁二酸产量，降低生产成本，本研究首先通过单因素实验对甘薯粉发酵产丁二酸的甘薯粉、MgCO3、液化酶、糖化酶、氮源浓度和发酵时间进行了优化，再利用正交试验确定重要参数的最佳水平，最后利用 2L 发酵罐对获得最佳发酵工艺进行放大实验。结果表明，混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2）可满足甘薯粉丁二酸发酵营养需求，影响丁二酸产量的重要参数是甘薯粉、MgCO3、液化酶、糖化酶、混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2）的浓度。各因素最佳水平为：甘薯粉 115g/L、MgCO360g/L，液化酶 0.008KUN-S/g 底物，糖化酶 3.09AGU/g 底物，混合氮源33g/L。优化后丁二酸产量可达 69.89g/L，与优化前相比（42.46g/L），丁二酸浓度提高了 64.6%。2L 发酵罐发酵 72h，丁二酸可达 71.42g/L，丁二酸产率为 79.87%，生产强度为 0.99g/（Lh）。因此，利用A.succinogenes发酵甘薯粉产丁二酸具有较好的工业化应用前景。关键词：产琥珀酸放线杆菌，丁二酸，甘薯粉，发酵培养基，配方优化本文网刊:中图分类号：TS201.1文献标识码：A文章编号：10020306（2023）20010808DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022120045OptimizationofSuccinicAcidProductionfromSweetPotatoPowderbyActinobacillussuccinogenesLIShiyong1，WEIQiuli1，QINQionghui1，LIShuyan1，CHENFuhui1，SONGChaodong1，ZHANGHongyan1，QINYan2，LIANGGe2，JIANGMingguo1，SHENNaikun1,*（1.GuangxiKeyLaboratoryforPolysaccharideMaterialsandModifications,SchoolofMarineSciencesandBiotechnology,GuangxiMinzuUniversity,Nanning530008,China；2.GuangxiAcademyofSciences,Nanning530007,China）Abstract：Inordertoraiseyieldsandreduceproductioncosts,thefermentationmediumofsuccinicacidproductionbyActinobacillus succinogenesfromsweetpotatopowder.First,theeffectsofsweetpotatopowderconcentration,MgCO3concentration,liquefactionenzymedose,saccharifyingenzymedose,nitrogensourceconcentrationandfermentationtimeonsuccinicacidproductionwereinvestigatedbysinglefactorexperimentsinthisstudy.Then,theoptimumvaluesoftheparameterswereobtainedbyorthogonalexperimentdesign.Finally，theoptimalfermentationconditionswereamplifiedby2Lstirredbioreactor.Theresultsshowedthatmixednitrogensource(yeastpowder:cornsteepliquor=1:2)wasusedasapropernutrientinthesuccinicacidproductionfromsweetpotatopowder.Theformulaoptimizationresultsshowedthattheimportantparametersweresweetpotatopowder,MgCO3,liquifyingenzymedose,glucoamylasedoseandmixednitrogen收稿日期：20221215基金项目：广西科技重点研发计划项目（AB19110041，AB21196019，AB21220020）；国家自然科学基金（32160017，32060020）；广西研究生教育创新计划项目（YCSW2022256）；广西民族大学高层次人才引进科研项目（2018KJQD17）；广西民族大学相思湖青年学者创新团队资助项目（2017-6）作者简介：李时勇（1997），男，硕士研究生，研究方向：微生物发酵，E-mail：。*通信作者：申乃坤（1980），男，博士，教授，研究方向：微生物学及酶工程，E-mail：。第44卷第20期食品工业科技Vol.44No.202023年10月ScienceandTechnologyofFoodIndustryOct.2023source.Theoptimumconditionwasasfollows:Sweetpotatopowder115g/L,MgCO360g/L,liquifyingenzymedose0.008KUN-S/gsubstrate,glucoamylasedose3.09AGU/gsubstrate,mixednitrogensource33g/L.Succinicacidyieldreached 69.89 g/L at the optimal condition,which was increased by 64.60%compared to that before optimization(42.46g/L).Approximately71.42g/Lofsuccinicacidcontentwithayieldof79.87%andaproductivityof0.99g/(Lh)wasobtainedafter72hina2Lbioreactor.Therefore,sweetpotatopowdercouldbeapromisingfeedstockfortheeconomicalandefficientproductionofsuccinicacidthroughfermentationbyA.succinogenes.Keywords：Actinobacillus succinogenes；succinicacid；sweetpotatopowder；fermentationmedium；formulaoptimization作为大宗商品化合物，丁二酸被广泛应用于医药、食品和纺织等领域12。在食品行业中，丁二酸可作为风味增强剂、强化剂和乳化剂等3。同时，丁二酸还是丁内酯、己二酸和生物可降解的聚丁烯丁二酸（Polymersbutylenesuccinate,PBS）等重要化学品的合成前体。预计到 2025 年，全球丁二酸市场可达 18 亿美元，年复合增长率为 27.4%4。目前，丁二酸主要以石油类产品为原料化学合成法生产，生产过程中需要高温、高压反应环境，且排出大量废液、废气。但随着石化资源的短缺，全球环境污染的加剧和人们关于绿色环保、可持续发展意识的增强，化学合成法生产受到限制。而微生物发酵法，具有利用廉价碳源和绿色环保等优点，成为近些年的研究热点5。丁二酸的生产菌株主要有产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes），产琥珀酸厌氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens），大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cere-visiae）等67。其中，产琥珀酸放线杆菌（A.succino-genes）因其具有高产丁二酸，固定温室气体（CO2）和利用多种碳源等能力，成为最有前景的产丁二酸的菌株之一8。先前的研究中，常以葡萄糖为碳源利用 A.succinogenes 发酵生产丁二酸，这极大地增加了生产成本，不利于工业化的大规模生产910。为降低成本，研究人员探究了以廉价可再生资源（玉米秸秆、甘蔗渣等）替代葡萄糖为碳源来生产丁二酸的方法。Jiang 等11以甘蔗渣纤维素水解物为底物，利用 A.succinogenesNJ113 发酵产丁二酸，丁二酸浓度可达20.0g/L。在厌氧分批发酵中，棉花秸秆水解液被用于生产丁二酸，最终丁二酸产量为 15.8g/L，产率为1.23g/g 葡萄糖12。在以玉米纤维为原料的研究中，考察了玉米纤维水解条件对总糖得率的影响，并利用 CaCO3中和结合活性炭吸附的方法去除水解液中的糠醛，最终丁二酸产量可达 35.4g/L，丁二酸产率可达 72.5%13。以上结果可知，纤维素原料虽然可以作为碳源生产丁二酸，但其存在预处理成本高，且丁二酸产量低的缺点，而利用玉米、小麦等粮食原料生产丁二酸会存在“与人争粮”问题，影响粮食安全。因此，亟需寻找一种含淀粉质的“非主粮”类进行丁二酸生产。甘薯（又叫红薯，地瓜等）具有易种植，产量大，淀粉含量高（占鲜重 15%-30%），价格低等优点，是一种理想的微生物发酵原料14。目前，已有许多以甘薯为底物进行生物发酵的报道，利用甘薯粉和甘薯渣来生产生物能源和有机酸等高附加值产品。Cheng 等15对乳酸乳球菌同步糖化发酵甘薯淀粉产乳酸和乳酸链球菌肽进行研究，对淀粉浓度、糖化酶用量等进行了优化，最终乳酸和乳酸链球菌肽产量分别可达37.06g/L 和 2516.41IU/mL。在甘薯生产生物乙醇的研究中，酿酒酵母 LPB1-93 发酵 100g 甘薯获得的乙醇含量可达 25.74g/L16。甘薯饮料残渣和花生壳可以作为底物，利用米曲霉和枯草芽孢杆菌发酵生产动物蛋白饲料，经优化最终蛋白质含量最高可达15.58%17。然而，目前关于 A.succinogenes 利用甘薯粉发酵产丁二酸的报道相对较少。本试验通过单因素实验和正交试验优化 A.succinogenes 发酵甘薯粉产丁二酸的最佳工艺参数，同时在 2L 的发酵罐中进行放大实验，以期为之后的大规模工业化生产奠定基础。1材料与方法1.1材料与仪器产琥珀酸放线杆菌（A.succinogenes）GXAS137（CCTCCM2011399）本实验室前期筛选获得18；甘薯干粉（淀粉含量可达 73%以上19）市购；耐高温淀粉酶 LiquozymeSC（标准酶活力为 120KNU-S/g）、糖化酶 SuhongGA（标准酶活为 500AGU/g）诺维信（中国）有限公司；丁二酸标准品分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸标准品分析纯，重庆川东化工（集团）有限公司；甲醇色谱纯，美国 TEDIA 公司；其他试剂均为分析纯或生化试剂；营养琼脂培养基（g/L）：葡萄糖 30，酵母粉 10，玉米浆 5，NaHCO32，NaCl2，NaH2PO48.5，K2HPO415.5，琼脂 15，pH 自然，121 灭菌 20min。种子培养基（g/L）：葡萄糖 30，酵母粉 10，玉米浆 5，NaHCO32，NaCl2，NaH2PO48.5，K2HPO415.5，pH 自然，121灭菌 20min。初始甘薯粉发酵培养基（g/L）：甘薯粉80，酵母粉5，玉米浆10，NaHCO32，MgCl26H2O1，CaCl2 0.3,MnCl2 0.06,ZnSO4 0.06，碱式 MgCO370，pH 自然，121 灭菌 20min。LC100 高效液相色谱仪上海伍丰科学仪器有限公司；Epoch 酶标仪美国 BioTek 公司；BSP-150 生化培养箱上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；DG250 小型厌氧工作站英国 DonWhitleyScientific 公司；BLBIO-XABC-D2L 发酵罐上海百伦生物科技有限公司；AG252.5L 厌氧罐英国OXOID 公司。第44卷第20期李时勇，等：产琥珀酸放线杆菌利用甘薯粉产丁二酸发酵条件优化1091.2实验方法1.2.1A.succinogenesGXAS137 种子液的制备菌株的活化：将甘油保藏管中 A.succinogenesGXAS137划线接种到营养琼脂培养基，平板放置于厌氧罐中，37 静置培养 2d。种子液的制备：将活化后的单菌落接种到种子培养基中，37 静置培养 16h。1.2.2甘薯粉的糖化甘薯粉先糖化后发酵（Sepa-ratehydrolysisandfermentation，SHF）20：将甘薯粉与蒸馏水混合，用 1mol/LHCl 调节 pH 至 5.5，添加高温淀粉酶，8590 水浴液化 30min；迅速冷却，将 pH 调为 4.24.5，再加入糖化酶，在 60 水浴锅中糖化 2h，最后添加其他营养成分及碳酸镁，其含量与初始甘薯粉发酵培养基一致，121 高压灭菌20min，接种发酵。1.2.3单因素实验1.2.3.1甘薯粉浓度的选择固定接种量为 5%（v/v），MgCO3添加量为 70g/L，液化酶用量为 0.376KNU-S/g 底物，糖化酶用量为 5.07AGU/g 底物，混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2）为 15g/L，初始甘薯粉浓度为80、90、100、110 和 120g/L，在 37 培养 48h，收集 1mL 发酵液，以 12000r/min 离心 10min 取上清液，用于有机酸含量的测定。每组设置三个平行。1.2.3.2MgCO3添加量的选择固定接种量为 5%（v/v），底物浓度为 100g/L，液化酶用量为 0.376KNU-S/g 底物，糖化酶用量为 5.07AGU/g 底物，混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2）为 15g/L，初始 MgCO3添加量为 30、40、50、60、70 和 80g/L，在 37 培养 48h，收集 1mL 发酵液，以 12000r/min 离心 10min 取上清液，用于有机酸含量的测定。每组设置三个平行。1.2.3.3液化酶用量的选择固定接种量为 5%（v/v），底物浓度为 100g/L，MgCO3添加量为 60g/L，糖化酶用量为 5.07AGU/g 底物，混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2）为 15g/L，初始液化酶用量为 0.008、0.037、0.188、0.376 和 0.564KNU-S/g 底物，在 37 培养48h，收集 1mL 发酵液，以 12000r/min 离心 10min取上清液，用于有机酸含量的测定。每组设置三个平行。1.2.3.4糖化酶用量的选择固定接种量为 5%（v/v），底物浓度为 100g/L，MgCO3添加量为 60g/L，液化酶用量为 0.037KNU-S/g 底物，混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2）为 15g/L，初始糖化酶用量为 0、1.69、3.38、5.07 和 6.75AGU/g 底物，在 37 培养 48h，收集 1mL 发酵液，以 12000r/min 离心 10min 取上清液，用于有机酸含量的测定。每组设置三个平行。1.2.3.5氮源种类及浓度的选择固定接种量为 5%（v/v），底物浓度为 100g/L，MgCO3添加量为 60g/L，液化酶用量为 0.037KNU-S/g 底物，糖化酶用量为1.69AGU/g 底物，设定总氮含量为 1.4g/L，分别选取混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2，15g/L）、混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:3，15.72g/L）、酵母粉（10.92g/L）、玉米浆（18.45g/L）、牛肉膏（10.42g/L）、蛋白胨（10.75g/L）、尿素（2.92g/L）作为氮源，并设置对照组（不添加任何氮源），在 37 培养 48h，收集 1mL发酵液，以 12000r/min 离心 10min 取上清液，用于有机酸含量的测定。每组设置三个平行。在最佳氮源的基础上，其他条件不变，以 3、9、15、21、27 和33g/L 的浓度进行优化，选出最适氮源浓度。1.2.3.6发酵时间的选择固定接种量为 5%（v/v），底物浓度为 100g/L，MgCO3添加量为 60g/L，液化酶用量为 0.037KNU-S/g 底物，糖化酶用量为1.69AGU/g 底物，混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2）为27g/L，发酵时间为 36、48、60、72 和 84h，在 37环境下进行培养。收集发酵液离心取上清液，测定有机酸含量。每组设置三个平行。1.2.4正交试验在单因素实验的基础上，对丁二酸发酵有较大影响的 5 个因素：甘薯粉（A）、混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2）（B）、液化酶（C）、糖化酶（D）和 MgCO3（E）进行优化，选用 L16（45）正交设计表进行试验。正交试验因素及水平见表 1。表1正交试验因子与水平Table1Orthogonaltestfactorsandlevels水平甘薯粉（A）（g/L）混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2）（B）（g/L）液化酶（C）（KUN-S/g底物）糖化酶（D）（AGU/g底物）碳酸镁（E）（g/L）170150.0080.2950285210.0371.69603100270.0663.09704115330.0954.49801.2.52L 发酵罐放大试验在 2L 发酵罐中进行厌氧发酵，装液量为 1.5L，所用培养基成分与正交试验优化后的培养基一致。发酵温度设为 37，接种量为 5%（v/v），搅拌转速 150r/min，以 0.2L/min 的通气量通入 100%CO2，发酵 72h，并对样品进行测定。1.2.6分析测定方法1.2.6.1样品处理取 1mL 发酵液 12000r/min 离心10min，取上清，再使用 0.22m 孔径无菌滤膜过滤。1.2.6.2有机酸测定使用高效液相色谱法21（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）检测发酵液中有机酸含量（丁二酸、乙酸）。其中，乙酸是 A.succinogenes 丁二酸发酵时产生的主要副产物，对其含量的检测有利于了解该菌株利用甘薯粉水解液生产丁二酸的效率。色谱条件为：色谱柱（UltimateLP-C184.6250mm），流动相 0.05mol/LNa2HPO412H2O，等度洗脱，pH1.8（使用磷酸调 pH），柱温22，进样量 20L，流速 1.0mL/min，紫外检测波长 210nm。110食品工业科技2023 年10月1.2.6.3还原糖含量测定使用 3,5-二硝基水杨酸法22（3,5-Dinitrosalicylicacid，DNS）测定还原糖含量。1.2.6.4丁二酸产率的计算根据公式（1）计算丁二酸产率，计算公式如下：丁二酸产率(%)=CC1100式（1）式中：C最终的丁二酸浓度，g/L；C1经甘薯粉糖化后产生的初始糖浓度，g/L。1.2.6.5丁二酸生产强度的计算根据公式（2）计算丁二酸生产强度，计算公式如下：丁二酸生产强度(%)=Ct100式（2）式中：C最终的丁二酸浓度，g/L；t发酵过程的总时间，h。1.2.6.6糖利用率的计算根据公式（3）计算糖利用率，计算公式如下：糖利用率(%)=C1C2C1100式（3）式中：C1经甘薯粉糖化后产生的初始糖浓度，g/L；C2发酵后的剩余的糖浓度，g/L。1.3数据处理本研究使用 Microsoft2021Excel 进行数据整理，用 IBMSPSSstatistics21.0 对试验数据进行方差分析和显著性分析，用 GraphPadPrism8 进行图形的绘制，每个实验均设三次平行。2结果与分析2.1丁二酸和乙酸的标准曲线分别将不同浓度的丁二酸和乙酸标准品溶液进样，通过 HPLC 进行分析。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果如表 2 所示。表2丁二酸、乙酸的线性范围、标准曲线及决定系数Table2Linearrange,standardcurveanddeterminationcoefficientofsuccinicacidandaceticacid化合物线性范围（mg/mL）标准曲线决定系数（R2）丁二酸0.510.0Y=687.69X31.080.9999乙酸0.510.0Y=659.89X+14.9111.02.2甘薯粉浓度对发酵产丁二酸的影响甘薯粉作为唯一碳源，为菌体的生长和代谢过程提供重要的能量和物质。如图 1 所示，随着甘薯粉浓度的增加，丁二酸产量呈先增后降的趋势，而副产物乙酸产量也呈增长趋势。当甘薯粉的浓度为100g/L 时，丁二酸产量最高为 42.46g/L，乙酸产量为 11.39g/L，此时丁二酸/乙酸比值最大为 3.73，而对应糖浓度为 62.91g/L。当甘薯粉浓度过低（低于100g/L），随着甘薯粉浓度的增加，丁二酸和乙酸产量呈上升趋势；当甘薯粉浓度过高（超过 100g/L），随甘薯粉浓度的增加，丁二酸产量呈下降趋势，而乙酸产量也稍有降低。这可能是当甘薯粉浓度过高时，在酶水解作用下产生的糖增加，从而使发酵液中的渗透压和粘度升高，导致菌体细胞失水和萎缩，从而抑制了菌体生长并降低丁二酸的产量23。李亿等24研究也表明，当糖浓度超过 60g/L 后会对菌株生长和丁二酸形成产生抑制作用。因此，甘薯粉丁二酸发酵的适宜浓度为 100g/L。60483624120有机酸含量(g/L)丁二酸乙酸8090100110120甘薯粉浓度(g/L)cbaabABBCCCA图1甘薯粉浓度对丁二酸发酵的影响Fig.1Effectofsweetpotatopowderconcentrationonsuccinicacidfermentation注：不同大小写字母代表组别之间显著性差异（P0.05），而乙酸产量依旧在增加，这可能是当 MgCO3添加量超过 60g/L 后，发酵液中的溶解性 CO2浓度达到饱和，即使再增加MgCO3的含量也不会显著提高丁二酸的产量27。因此，MgCO3的适宜添加量为 60g/L。2.4液化酶对甘薯粉发酵产丁二酸的影响淀粉质原料糖化过程中，需要添加适量的液化酶和糖化酶进行双酶水解。液化酶可以切割淀粉分子间的-1,4-糖苷键，在液化酶的作用下大分子的淀粉物质被降解为小分子的-糊精和糖类，同时降低溶液粘度28。从图 3 可以看出，当液化酶添加量低于 0.037KNU-S/g 底物时，丁二酸和乙酸的产量随着液化酶量的增加而增加，而当液化酶添加量高于0.037KNU-S/g 底物时，丁二酸和乙酸浓度随液化酶量的增加而降低并趋于不变。这是因为当液化酶添加量过低时，甘薯淀粉酶解不充分，水解液粘度高，不利于后续的糖化过程，导致丁二酸含量偏低。而当液化酶添加量过高时，过量的液化酶在水解淀粉的过程中，会产生超短链分子糖（如麦芽三糖，极限糊精等），这类糖与糖化酶结合困难，因而无法被糖化酶进一步水解为被菌株利用的葡萄糖，从而影响最终的丁二酸产量29。因此，液化酶的适宜用量为 0.037KNU-S/g底物。6040503020100有机酸含量(g/L)丁二酸乙酸0.0080.0370.1880.3760.564液化酶用量(KNU-S/g 底物)caabbABABACBC图3液化酶添加量对丁二酸发酵的影响Fig.3Effectofliquefactionenzymedoseonsuccinicacidfermentation2.5糖化酶对甘薯粉发酵产丁二酸的影响糖化是淀粉水解产生葡萄糖的主要步骤，在糖化酶的作用下将糊精等类低聚寡糖水解为葡萄糖，用于后续发酵产丁二酸的过程30。如图 4 所示，当糖化酶量低于 1.69AGU/g 底物时，丁二酸和乙酸浓度随糖化酶添加量的增加而增加，而当糖化酶量高于1.69AGU/g底物时，丁二酸的产量没有显著性差异（P0.05），而乙酸产量呈先降低后趋于不变的趋势。这说明当糖化酶量过低（低于 1.69AGU/g 底物）时，醪液糖化程度过低，产生的糖不足以供应菌体的生产及代谢，因此随着糖化酶用量的增加，丁二酸的产量也随之增大。而当糖化酶过多时（高于 1.69AGU/g 底物）时，醪液中的低聚糖被充分降解，因而添加更多的糖化酶只会增加发酵的成本，而不会使丁二酸的产量有显著增加31。因此，糖化酶的适宜用量为 1.69AGU/g底物。6040503020100有机酸含量(g/L)丁二酸乙酸01.693.385.076.75糖化酶用量(AGU/g 底物)baaaaBCBACC图4糖化酶添加量对丁二酸发酵的影响Fig.4Effectofsaccharifyingenzymeconcentrationdoseonsuccinicacidfermentation2.6氮源对甘薯粉发酵产丁二酸的影响氮源物质不仅为微生物提供氮元素，用于合成细胞中必需的含氮物质，如蛋白质、核酸等，同时还可为微生物补充生产所需的氨基酸、生物素和烟酸等生长因子32。先前的研究表明丁二酸发酵的最佳氮源是酵母粉，但其价格昂贵，不利于丁二酸的工业化大规模生产，因而寻找可替代酵母粉的廉价氮源是非常必要的。如图 5 所示，混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2）丁二酸产量为 45.81g/L，且乙酸产量为 14.28g/L，与酵母粉相比（丁二酸为 47.16g/L，乙酸为 16.47g/L），丁二酸和乙酸产量没有显著性差异（P0.05），混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:3）的丁二酸产量为 41.85g/L，而单以玉米浆作为氮源时，丁二酸产量仅为 27.95g/L。以尿素为氮源时，丁二酸产量仅有 6.81g/L，略高于对照组（6.54g/L）。由此可知，虽然玉米浆无法完全替代酵母粉作为氮源，但使用玉米浆与酵母粉作为混合氮源也可以极大的节约生产成本。在先前的文献中，Xi 等33探究了以玉米浆为氮源取代酵母粉进行60aacdeffEEDDCABCABb483624120有机酸含量(g/L)丁二酸乙酸酵母粉:玉米浆=1:2酵母粉:玉米浆=1:3酵母粉玉米浆牛肉膏蛋白胨尿素对照组氮源图5不同氮源对丁二酸发酵的影响Fig.5Effectsofdifferentnitrogensourcesonsuccinicacidfermentation112食品工业科技2023 年10月发酵，在含有血红素的情况下，A.succinogenesNJ113利用50g/L 的葡萄糖进行发酵，最终丁二酸产量可达 37.9g/L，与酵母粉相比，丁二酸产量十分接近。因此，适宜的氮源为混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2）。在此基础上，考察不同质量浓度（3、9、15、21、27、33g/L）的混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2）对产丁二酸的影响。由图 6 可知，随着氮源浓度的增加，丁二酸产量呈先增加而后保持不变的趋势，而副产物乙酸含量呈增加趋势。当氮源浓度低于 27g/L 时，丁二酸和乙酸产量随氮源浓度的增加而增加，而当氮源浓度高于 27g/L 时，乙酸浓度依然随氮源浓度的增加而增加，但丁二酸产量没有显著性差异（P0.05）。因此，100g/L 甘薯粉经双酶解后产生的糖（82.14g/L），至少需要添加 27g/L 的混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2）才能被完全利用，此时丁二酸浓度可达54.85g/L。所以，混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2）的适宜添加量为 27g/L。丁二酸乙酸7260483624120有机酸含量(g/L)混合氮源(酵母粉:玉米浆=1:2,(g/L)3edcbaaFEDCBA915212733图6氮源浓度对丁二酸发酵的影响Fig.6Effectofnitrogensourceconcentrationonsuccinicacidfermentation2.7发酵时间对甘薯粉发酵产丁二酸的影响发酵时间对于丁二酸和乙酸的产量有显著（P0.05）。这可能是由于发酵 72h 后，培养基中的糖基本被消耗完。因此，适宜的发酵时间为 72h。2.8正交试验结果在单因素实验结果的基础上设计 L16（45）正交试验，选取对丁二酸发酵有较大影响的 5 个因素：甘薯粉（A）、混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2）（B）、液化酶（C）、糖化酶（D）和 MgCO3（E）进行优化，设计了16 组实验，每组设三个平行重复。正交试验结果见表 3，方差分析结果见表 4。表3L16（45）正交试验结果Table3OrthogonalexperimentalresultsofL16(45)实验号ABCDE丁二酸（g/L）11111136.050.0521222245.0301431333347.060.9441444447.162.3752123444.721.0762214354.870.7972341238.000.2982432154.210.3593134257.010.42103243157.930.28113312460.210.65123421337.790.72134142352.731.57144231446.090.84154324160.360.14164413269.890.59K143.8347.6355.2639.4852.14K247.9550.9846.9853.0552.48K353.2451.4151.1054.9048.11K457.2752.2648.9654.8549.55R13.444.638.2915.424.37主次因素DACBE最优水平A4B4C1D3E2表4A.succinogenes 菌株正交实验方差分析Table4OrthogonalexperimentalanalysisofvarianceofA.succinogenesstrain方差来源平方和自由度均方值F值显著性A1252.1353417.378481.7540.01B148.792349.59757.2470.01C452.9813150.994174.2830.01D1992.7773664.259766.7130.01E158.451352.81760.963ACBE，即糖化酶添加量甘薯粉浓度液化酶添加量混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2）浓度碳酸镁添加量。根据表 2 可知，最佳发酵条件为 A4B4C1D3E2，即甘薯粉浓度为 115g/L，混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2）浓度为 33g/L，液化酶添加量为 0.008KUN-S/g丁二酸乙酸糖利用率(%)80706050403020100有机酸含量(g/L)1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10.0糖利用率(%)36ddccbbaaaADABBCCDa48607284发酵时间(h)图7发酵时间对丁二酸发酵的影响Fig.7Effectoffermentationtimeonsuccinicacidfermentation第44卷第20期李时勇，等：产琥珀酸放线杆菌利用甘薯粉产丁二酸发酵条件优化113底物，糖化酶添加量为 3.09AGU/g底物，碳酸镁添加量为 60g/L。此组合在正交表中，且丁二酸含量最高为 69.89g/L，生产强度为 0.97g/（Lh），经优化后与初始条件相比（42.46g/L），丁二酸浓度提高了64.6%。进一步对最优组合进行了揺瓶发酵验证实验，丁二酸产量达 70.240.31g/L，与正交表中结果无显著差异，优化结果可信。在先前报道的利用 A.succinogenes 发酵不同廉价碳源（角豆树豆荚、大型海藻和甘蔗糖蜜）产丁二酸的研究中，丁二酸浓度和生产强度的范围分别为 18.9755.2g/L 和 0.703.9g/（Lh）3436。与之相比，利用红薯粉为碳源发酵有较高的丁二酸产量。所以，甘薯粉可作为 A.succino-genes 的一种淀粉质的“非主粮”类发酵底物，具有良好的发展前景。2.92L 发酵罐放大试验为更好地探究甘薯粉深层发酵的规律，在 2L 发酵罐中进行放大试验。由图 8 可知，随着糖的不断消耗，丁二酸及副产物乙酸浓度在不断增加。当发酵时间超过 64h 后，丁二酸及乙酸含量基本保持不变，此时葡萄糖基本耗尽。丁二酸的浓度最高可达 71.42g/L，乙酸浓度为 18.74g/L，丁二酸产率可达 79.87%，生产强度 0.99g/（Lh）。相较于在厌氧瓶中培养结果，丁二酸的浓度和生产强度都有所提高，这可能是由于发酵过程中连续泵入的 CO2直接渗透到细胞膜，并与磷酸烯醇式丙酮酸进行羧基化反应生成草酰乙酸，随后草酰乙酸通过还原性三羧酸循环转化为丁二酸37。同时，发酵罐的搅拌和混合能力促进了菌体对营养物质的吸收和代谢，从而提高丁二酸的产量。这为后续的中试试验及大规模工业化发酵提供了一定的数据支持。丁二酸乙酸残糖9080706050403020100丁二酸、乙酸及残糖含量(g/L)04812162024283236404448525660646872发酵时间(h)abbccdeffdeffhijjklmngggh edcba a akjkijkijkhijghihiijjkl l l图8甘薯粉发酵产丁二酸 2L 发酵罐放大实验过程曲线Fig.8Experimentalprocesscurveof2Lfermenterforsuccinicacidproductionbyfermentationofsweetpotatopowder3结论本研究以甘薯粉为底物，对A.succinogenesGXAS137 发酵产丁二酸的培养基进行了优化。在单因素实验的基础上，进行正交试验优化，获得最佳培养参数分别为：甘薯粉 115g/L，混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2）33g/L，液化酶 0.008KUN-S/g底物，糖化酶 3.09AGU/g底物，碳酸镁 60g/L。在最优条件下，厌氧瓶中丁二酸浓度可达 69.89g/L，与初始条件相比（42.46g/L），丁二酸浓度提高了 64.6%。之后，在 2L 发酵罐中进行放大试验，丁二酸产量最终为 71.42g/L，丁二酸产率可达 79.87%，生产强度0.99g/（Lh）。以甘薯粉作为底物，具有原料成本低、易获取、丁二酸产量高等优点；此外，混合氮源（酵母粉:玉米浆=1:2）的使用也可以大大的减少生产成本。我国作为甘薯种植大国，至 2014 年以后，每年甘薯产量维持在 7000 万吨以上38。其中，甘薯消费结构主要在饲料、鲜食和加工方面，而工业应用不多，尤其是用于丁二酸的发酵生产。本研究证明甘薯粉可作为 A.succinogenes 发酵的优良底物，用于丁二酸的生产，具有工业生产的前景。但是，后续的发酵罐放大培养及中试实验都未进行，相关培养条件及参数还需进一步的研究。参考文献1SILLAPARASSAMEEO,CHINWETKITVANICH