沉默Tspan1基因表达通过抑制细胞自噬逆转结直肠癌细胞对奥沙利铂的耐药性.pdf

中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023，39（8）：1415-1421杂志网址：http:/沉默Tspan1基因表达通过抑制细胞自噬逆转结直肠癌细胞对奥沙利铂的耐药性*李孝平，周红见，高芳芳，李伟（武汉市第三医院肝胆胰甲状腺胃肠外科，湖北 武汉 430074）摘要 目的：探讨沉默四次跨膜蛋白1（Tspan1）基因表达对结直肠癌（CRC）细胞奥沙利铂（OXA）耐药的影响及作用机制。方法：收集31例OXA化疗敏感（OXA敏感组）和26例OXA化疗耐药（OXA耐药组）的CRC患者肿瘤组织，RT-qPCR和Western blot检测肿瘤组织中Tspan1 mRNA和蛋白表达水平。采用OXA浓度递增刺激法建立OXA耐药细胞株HCT116/OXA，MTT法检测耐药细胞株增殖活性，计算半数抑制浓度（IC50）和耐药指数（RI）；RT-qPCR 和 Western blot 检测耐药细胞株及其亲本细胞中 Tspan1 mRNA 和蛋白表达水平。通过 siRNA 技术沉默HCT116/OXA细胞中Tspan1基因表达，RT-qPCR和Western blot检测转染后耐药细胞株中Tspan1 mRNA和蛋白表达水平。采用不同浓度OXA干预转染后的耐药细胞株，MTT法检测细胞增殖活性并计算IC50值，流式细胞术检测细胞凋亡；免疫荧光实验检测自噬指标蛋白LC3B表达情况；Western blot检测细胞中LC3、beclin-1、P62等自噬蛋白的表达水平。结果：与OXA敏感组比较，OXA耐药组患者肿瘤组织中Tspan1 mRNA和蛋白表达水平升高（P0.01）。不同浓度OXA处理48 h后，耐药细胞株HCT116/OXA及其亲本HCT116细胞的IC50值分别为（101.62.7）和（16.00.5）mg/L，RI值为6.4。耐药细胞株HCT116/OXA中Tspan1表达水平较其亲本HCT116细胞显著升高（P0.01）。Tspan1基因沉默可显著降低HCT116/OXA细胞中Tspan1 mRNA和蛋白表达水平及其对OXA的耐药性（P0.05），提高OXA暴露下HCT116/OXA细胞的凋亡率（P0.05），降低细胞中LC3B蛋白荧光强度及细胞中LC3-II/LC3-I蛋白比值和beclin-1蛋白表达水平（P0.05），增加P62蛋白的表达（P0.05）。结论：沉默Tspan1基因表达可通过抑制细胞自噬逆转结直肠癌细胞OXA耐药。关键词 四次跨膜蛋白1；结直肠癌；奥沙利铂；耐药性；自噬中图分类号 R735.3；R363 文献标志码 A doi：10.3969/j.issn.1000-4718.2023.08.009Silencing of Tspan1 gene expression reverses resistance of colorectal cancer cells to oxaliplatin by inhibiting autophagyLI Xiaoping，ZHOU Hongjian，GAO Fangfang，LI Wei（Department of Hepatobiliary Pancreatic Thyroid Gastrointestinal Surgery，Wuhan 430074，China.E-mail：）ABSTRACT AIM：To examine the impact of inhibiting the expression of the tetraspanin 1（Tspan1）gene on the resistance of colorectal cancer（CRC）cells to oxaliplatin（OXA），as well as to elucidate the underlying mechanism.METHODS：This study involved the collection of cancer tissues from two groups of patients with CRC：one group comprising 31 patients who exhibited sensitivity to OXA chemotherapy（referred to as the OXA sensitive group），and the other group comprising 26 patients who showed resistance to OXA chemotherapy（referred to as the OXA resistant group）.The mRNA and protein expression levels of Tspan1 in the cancer tissues were measured using quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-qPCR）and Western blot analysis.To establish an OXA-resistant cell line，HCT116/OXA，the concentration of OXA was incrementally increased.The proliferation activity of the drug-resistant cell lines was assessed using the MTT assay，and the half inhibitory concentration（IC50）and drug resistance index（RI）were calculated.The mRNA and protein expression levels of Tspan1 were measured in both the drug-resistant HCT116/OXA cells and the parent HCT116 cells using RT-qPCR and Western blot analysis.Small interfering RNA（siRNA）technology was em文章编号 1000-4718（2023）08-1415-07 收稿日期 2023-03-13 修回日期 2023-07-07*基金项目 武汉市医学科研项目（No.WX20D26）通讯作者 Tel：[phone]；E-mail：1415ployed to silence the expression of the Tspan1 gene in HCT116/OXA cells，and the mRNA and protein expression levels of Tspan1 were measured in the transfected drug-resistant cell lines.Various concentrations of OXA were administered to the transfected drug-resistant cell lines，and the MTT assay was employed to assess cell proliferation activity and calculate the IC50 value.Cell apoptosis was examined using flow cytometry.The immunofluorescence intensity of the autophagy index LC3B was determined using an immunofluorescence assay，and the expression levels of autophagy-related proteins such as LC3，beclin-1，and P62 were evaluated using Western blot analysis.RESULTS：In comparison to the OXA sensitive group，the expression levels of Tspan1 mRNA and protein in the cancer tissues of patients in the OXA resistant group were significantly elevated（P0.01）.Likewise，the HCT116/OXA cells demonstrated higher mRNA and protein expression levels of Tspan1 compared to the HCT116 cells（P0.01）.The IC50 values of the drug-resistant cell line HCT116/OXA and its parent HCT116 cells were（101.62.7）and（16.00.5）mg/L，respectively，resulting in an RI value of 6.4 after 48 h of treatment with various OXA concentrations.The mRNA and protein expression levels of Tspan1 in the drug-resistant HCT116/OXA cell line was significantly greater than that in the parent HCT116 cell line（P0.01）.Silencing the expression of the Tspan1 gene significantly reduced the mRNA and protein expression levels of Tspan1 and reversed the drug resistance to OXA in HCT116/OXA cells（P0.05）.It also increased the rate of apoptosis in HCT116/OXA cells when exposed to OXA（P0.05）.Additionally，it led to a decrease in the fluorescence intensity of the LC3B protein，a downregulation of the LC3-II/LC3-I protein ratio and the expression level of beclin-1 protein in cells（P0.05），and an increase in the expression of the P62 protein（P0.05）.CONCLUSION：Inhibiting autophagy through the silencing of Tspan1 gene expression effectively reversed OXA resistance in CRC cells.KEY WORDS tetraspanin 1；colorectal cancer；oxaliplatin；drug resistance；autophagy结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球范围内较为常见的恶性肿瘤之一，而且发病率逐年上升1-2。奥沙利铂（oxaliplatin，OXA）是广泛用于CRC治疗的一线化疗药物，而耐药性的产生成为影响其治疗效果的主要原因3-4。自噬是一种细胞存活的生理机制，被肿瘤细胞有效利用以避免细胞死亡和诱导耐药性5-6。证据表明，调节自噬活性可以增强许多抗肿瘤药物的作用，其中就包括OXA3。因此，调控自噬逆转CRC细胞的OXA耐药性对CRC治疗显得尤为重要。四次跨膜蛋白 1（tetraspanin 1，Tspan1）是一个具有四个跨膜结构域的蛋白，在细胞增殖、分化和迁移中发挥重要作用，已被证明参与调控多种肿瘤的进展和转移7-10。研究报道，Tspan1基因在CRC中高表达，而降低Tspan1表达可以抑制CRC细胞生长、侵袭和细胞周期进程11-12。另有研究报道，Tspan1作为自噬体成熟的一个新型正向调控因子，通过与LC3直接结合，促进自噬小体的成熟，提高自噬水平13。然而，Tspan1是否可以通过调控细胞自噬，来影响OXA耐药性CRC细胞对OXA的敏感性还有待于研究。因此，本研究分析Tspan1在OXA化疗耐药组织中的表达水平，并探讨沉默Tspan1基因表达与细胞自噬逆转CRC细胞OXA耐药的关系。材料和方法1研究对象收集57例于2018年4月2020年10月在武汉市第三医院肝胆胰甲状腺胃肠外科以 OXA为一线化疗药物的 CRC患者肿瘤组织及临床资料。将 OXA治疗后达到完全临床缓解或化疗半年内无复发的患者（31例）纳入OXA敏感组，将在OXA治疗期间病情持续进展或者化疗后半年内出现复发的患者（26例）纳入OXA耐药组。其中OXA敏感组：男15例，女16例；年龄3574岁，平均年龄（59.210.7）岁；组织分化程度：高/中分化14例，低分化17例；转移部位：肝转移7例，肺转移18例，多部位转移6例。OXA耐药组：男 14 例，女 12 例；年龄 3779 岁，平均年龄（57.911.1）岁；组织分化程度：高/中分化13例，低分化13例；转移部位：肝转移13例，肺转移9例，多部位转移4例。本研究所有患者签署知情同意书，并经伦理委员会批准。2实验材料人结肠癌细胞系 HCT116 购自 ATCC；RPMI-1640 培养液购自 Corning；胎牛血清购自 Hyclone；OXA购自齐鲁制药有限公司；Tspan1基因siRNA干扰质粒（si-Tspan1）及其阴性干扰质粒（si-NC）和所有引物序列购自苏州市金唯智生物科技有限公司；MTT、DMSO和DAPI购自北京索莱宝科技有限公司；反转录试剂盒和SYBR Green PCR Kit购自Roche；Lipofectamine 3000 和 Trizol 购自 Thermo Fisher；LC3B单克隆抗体购自于 Abcam；Tspan1 抗体、LC3 抗体、beclin-1 抗体、P62 抗体和 GAPDH 抗体购自于 Cell Signaling Technology；抗（标记辣根过氧化物酶）购1416自北京博奥森生物技术有限公司；荧光抗IgG488和凋亡试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。3实验方法3.1细胞培养及耐药细胞株的诱导HCT116细胞加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，并置于37、5%CO2的培养箱中培养。依照相关报道14，取生长状态良好的HCT116细胞，以每孔4105个接种于6孔板，待细胞贴壁后加入初始浓度为0.9 mg/L的 OXA 培养液作用 48 h，弃去培养液；加入不含OXA的新鲜培养液继续培养，待细胞恢复正常生长后，消化传代，再用含终质量浓度为2.7 mg/L的OXA培养液作用细胞48 h。如此反复换液、传代，并逐步提高 OXA 的质量浓度（1.8 2.7 3.6 4.5 5.4 mg/L），当细胞在含5.4 mg/L OXA培养液中稳定生长时，以含加倍质量浓度（10.8 mg/L 21.6 mg/L）大剂量 OXA 培养液对 HCT116 细胞进行间断诱导，最终获得对OXA耐药的HCT116细胞株，并命名为HCT116/OXA。后续实验用的细胞于实验前1周停止OXA处理。3.2 细 胞 转 染 及 分 组 取 生 长 状 态 良 好 的HCT116/OXA细胞以每孔3105个接种于6孔板，待细胞融合度达约80%时，将HCT116/OXA细胞分为阴性对照转染组（si-NC组）和si-Tspan1转染组，并选择不进行转染的HCT116/OXA细胞作为空白对照组（blank 组）。按照 Lipofectamine 3000试剂说明书进行转染，细胞转染48 h用于后续实验。3.3MTT 实验取生长状态良好的耐药细胞株HCT116/OXA和其亲本HCT116细胞以每孔5103个接种于 96 孔板中，不同浓度 OXA（0、7.8、15.6、31.2、62.5、125、250 mg/L）处理48 h。提前4 h每孔加入20 L MTT孵育，弃掉孔内液体，每孔再加150 L DMSO，震荡10 min充分溶解，采用酶标仪在490 nm波长处测定各孔的吸光度值（A490），并以空白孔调零。以A490值代表增殖活性，并计算细胞IC50值和耐药指数（RI=HCT116/OXA 细胞的 IC50值/HCT116 细胞的IC50值）。此外，取各组转染后的细胞铺板，重复上述操作，并计算各组细胞IC50值。3.4RT-qPCR取CRC组织、耐药细胞株HCT116/OXA 及其亲本 HCT116 细胞和转染后的 HCT116/OXA 细胞，分别采用 Trizol 法提取组织或细胞总RNA，定量后使用反转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA，并依照 SYBR Green PCR Kit 说明书进行 RT-qPCR。Tspan1的正向引物序列为5-CCAATAAGCTTATGCAGCTTCAATTAAGA-3，反向引物序列为5-CCAATGAATTCTTGTAGATTGCAGTACAGATACATG-3；GAPDH 的 正 向 引 物 序 列 为 5-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3，反向引物序列为 5-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3。扩 增 条 件：95 3 min；95 30 s，58 30 s，72 30 s，30个循环。以GAPDH为内参照，采用2Ct法计算各组样本中Tspan1 mRNA的相对表达量。3.5Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测取转染后 HCT116/OXA 细胞以每孔 3105个接种至 6 孔板，待细胞贴壁后，加 20 mg/L OXA 处理细胞 48 h。收获细胞，PBS洗涤，取1105个细胞，1 000g离心5 min，弃去上清，180 L缓冲液重悬细胞，加5 L Annexin V-FITC和10 L PI避光孵育20 min，采用流式细胞术检测并分析细胞凋亡情况。3.6免疫荧光染色取转染后 HCT116/OXA 细胞以每孔3105个接种至放无菌盖玻片的6孔板中，待细胞贴壁后，加20 mg/L OXA处理细胞48 h。用PBS洗涤盖玻片上的细胞，4%多聚甲醛室温固定 15 min，0.1%NP-40透化5 min，并用5%山羊血清封闭1 h；加入LC3B单克隆抗体（1 80），室温孵育1 h，再加入荧光抗（1 500）室温避光孵育 1 h。用 DAPI对细胞核进行复染，在载玻片上滴加防淬灭剂后封片，置于荧光显微镜下拍照观察。3.7Western blot检测采用RIPA裂解缓冲液裂解取CRC组织或各组细胞，冰上超声破碎，4、12 000 r/min离心30 min，分离上清，并以考马斯亮蓝法行蛋白定量。各组取30 g蛋白进行SDS-PAGE分离，随后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h，加入抗（Tspan1、LC3、beclin-1、P62 和 GAPDH 抗体，均 1 1 000）4 孵育过夜。次日，加抗（1 8 000）室温避光孵育1 h，向膜上滴加ECL进行显影。以GAPDH为内参照，ImageJ软件对各组蛋白进行定量分析。4统计学处理本研究数据均采用SPSS 22.0统计软件进行分析，并以均数标准差（meanSD）的形式表示。两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，事后两两比较采用LSD-t检验分析。以P0.05为差异有统计学意义。结果1CRC组织中Tspan1表达水平RT-qPCR 结果显示，与 OXA 敏感组比较，OXA耐药组患者肿瘤组织中 Tspan1 mRNA 表达水平（1.00.2）vs（3.60.8）显 著 升 高（P0.01）。Western blot结果显示，与OXA敏感组比较，OXA耐1417药组患者肿瘤组织中Tspan1蛋白表达水平显著升高（P0.01），见图1。2OXA耐药细胞株药敏性鉴定MTT 检测结果显示，耐药细胞株 HCT116/OXA细胞增殖活性均显著高于其亲本 HCT116细胞（P0.01），见图2。亲本HCT116细胞的IC50值为（16.00.5）mg/L，耐 药 细 胞 株 HCT116/OXA 的 IC50值 为（101.62.7）mg/L，RI值为6.4，说明HCT116/OXA细胞对OXA耐药。3OXA耐药细胞株中 Tspan1 mRNA和蛋白表达水平RT-qPCR结果显示，与亲本HCT116细胞比较，OXA耐药细胞株HCT116/OXA中Tspan1 mRNA表达水平显著升高（P0.01），见表1。Western blot结果显示，与亲本 HCT116 细胞比较，OXA 耐药细胞株HCT116/OXA中Tspan1蛋白表达水平显著升高（P0.05），见图3、表1。4Tspan1 基因沉默对 HCT116/OXA 细胞药敏性影响RT-qPCR结果显示，与blank组或si-NC组比较，si-Tspan1组HCT116/OXA细胞中Tspan1 mRNA表达水平显著降低（P0.01），见表 2。Western blot结果显 示，与 blank 组 和 si-NC 组 比 较，si-Tspan1 组 HCT116/OXA 细胞中蛋白表达水平显著降低（P0.01），见图4、表2。MTT结果显示，与blank组或si-NC组比较，si-Tspan1组 HCT116/OXA细胞增殖活性显著降低（P0.01），图 5。此外，blank 组 HCT116/OXA 细 胞 IC50值 为（95.62.2）mg/L，si-NC 组HCT116/OXA 细 胞 IC50值 为（92.85.7）mg/L，si-Tspan1 组 HCT116/OXA 细胞的 IC50值为（29.80.7）mg/L，差异有统计学意义（P0.01）。5Tspan1 基因沉默对 OXA 暴露下 HCT116/OXA细胞凋亡的影响流式细胞术结果显示，si-NC、si-Tspan1、si-NC+Figure 3.Expression of Tspan1 protein in each group图3各组细胞Tspan1蛋白表达情况Figure 1.Expression of Tspan1 protein in CRC.图1CRC组织中Tspan1蛋白表达情况表2转染后各组细胞中Tspan1 mRNA和蛋白表达比较Table 2.Comparison of Tspan1 mRNA and protein expression in the cells of each group after transfection（MeanSD.n=3）GroupBlanksi-NCsi-Tspan1Tspan1 mRNA1.000.03*1.000.04*0.200.03Tspan1 protein0.300.02*0.300.02*0.100.01*P0.01 vs si-Tspan1 group.表1各细胞中Tspan1 mRNA和蛋白表达比较Table 1.Comparison of Tspan1 mRNA and protein expression in each group（MeanSD.n=3）GroupHCT116HCT116/OXATspan1 mRNA1.000.026.200.20*Tspan1 protein0.100.020.400.04*P0.05，*P0.01 vs HCT116 group.Figure 2.Proliferation activity of HCT116 and HCT116/OXA cells.MeanSD.n=3.*P0.01 vs HCT116 group.图2HCT116和HCT116/OXA细胞增殖活性Figure 4.The expression of Tspan1 protein in each group post-transfection.图4转染后各组细胞Tspan1蛋白表达情况1418OXA 及 si-Tspan1+OXA 组细胞凋亡率分别为（7.61.7）%、（17.42.5）%、（9.91.7）%、（36.53.3）%。与 si-NC 组比较，si-Tspan1 组细胞凋亡率升高（P0.05）；与si-NC+OXA组比较，si-Tspan1+OXA组凋亡率显著升高（P0.01），见图6。6Tspan1 基因沉默对 OXA 暴露下 HCT116/OXA细胞自噬的影响免疫荧光结果显示，与 si-NC 组比较，si-Tspan1组细胞中LC3B蛋白荧光强度减弱，而si-NC+OXA组细胞中LC3B蛋白荧光强度增强；与si-NC+OXA组比较，si-Tspan1+OXA组细胞中LC3B蛋白荧光强度减弱，见图7。Western blot 结 果 显 示，与 si-NC 组 比 较，si-Tspan1 组细胞中 LC3II/LC3I 蛋白比值和 beclin-1 蛋白表达量显著降低，P62 蛋白表达量显著升高（P0.05），而 si-NC+OXA 组 LC3II/LC3I 蛋白比值和 beclin-1蛋白表达量显著升高，P62蛋白表达量显著降低（P0.05）；与 si-NC+OXA 组比较，si-Tspan1+OXA组 LC3II/LC3I蛋白比值和 beclin-1 蛋白表达量显著降低，P62 蛋白表达量显著升高（P0.01），见图 8和表3。讨论CRC是世界范围内常见的肿瘤之一，其发病率逐年上升，给社会公共卫生带来沉重的负担1。OXA 是治疗 CRC 的一线化疗药物，然而 CRC 细胞OXA耐药性的产生严重影响其化疗效果3。因此，探究CRC细胞产生OXA耐药性的原因，克服其耐药性，可以增强CRC治疗效果。自噬是一种保守的自我降解系统，在维持细胞稳态中发挥重要作用，其通过降解细胞内底物和受损细胞器，缓解细胞毒剂引起的细胞应激，被肿瘤细胞 有 效 利 用 以 避 免 细 胞 死 亡 及 诱 导 耐 药 性 产生5，15-16。研究报道，CRC 细胞中 miR-135b-5p 表达上调通过MUL1（E3泛素连接酶）/ULK1（自噬激活蛋白1）信号通路诱导保护性自噬，促进OXA耐药性产生17。另有研究报道，CRC细胞中 circHIPK3（环状RNA 同源域相互作用蛋白激酶 3）靶向 miR-637/STAT3/Bcl-2/beclin1轴通过自噬促进OXA耐药性产生18。因此，自噬作为CRC细胞产生OXA耐药性的主要因素之一，可以为克服 OXA 耐药性提供研究方向。四次跨膜蛋白是一个具有四个跨膜结构域的蛋白质家族，存在于大多数有核细胞的表面，可以调节多种生物过程，并在细胞增殖、分化、黏附附和迁移等过程中发挥重要作用，其中Tspan1已被证明会影响多种肿瘤的进展和转移7-8。研究报道，RNA干扰Tspan1基因表达在体外可以抑制结肠癌细胞HCT-8细胞的增殖和侵袭作用19。研究报道，Tspan1作为自噬体成熟的一个新型正向调控因子，其通过两个保守的LC3相互作用区基序与LC3直接结合，促进自噬小体的成熟，从而提高自噬水平13。另有研究报道，在头颈部鳞状细胞肿瘤细胞中，降低Tspan1表Figure 6.Knockdown of Tspan1 gene promoted the apoptosis of HCT116/OXA cells exposed to OXA.图6Tspan1基因沉默促进OXA暴露下HCT116/OXA细胞凋亡Figure 5.Knockdown of Tspan1 gene inhibited the proliferation of HCT116/OXA cells.MeanSD.n=3.*P0.01 vs si-Tspan1 group.图5Tspan1基因沉默抑制HCT116/OXA细胞增殖活性1419达，可以促进细胞凋亡，抑制自噬，并增加耐药细胞对顺铂的敏感性20。然而，Tspan1是否可以通过调控细胞自噬，来影响CRC细胞对化疗药物OXA的敏感性鲜有报道。本 研 究 显 示，OXA 耐 药 CRC 组 织 中 Tspan1 mRNA高表达。通过OXA浓度递增刺激法成功建立OXA 耐药细胞株 HCT116/OXA，其细胞中 Tspan1表达水显著升高。Tspan1基因表达受到多种miRNA调控，如miR-194-5p10和miRNA-63812。研究报道，一种含有 OXA的化疗方案在治疗胰腺导管腺癌一个周期后，可以降低患者血清中miR-194-5p的表达水平21。这些研究提示，在 HCT116/OXA 耐药株建立过程，OXA可能通过抑制miR-194-5p等miRNA水平上升从而促进 Tspan1表达。此外，HCT116/OXA 细胞增殖活性显著高于亲本 HCT116 细胞，而干扰Tspan1 表达后，HCT116/OXA 细胞增殖活性显著降低。结果提示，沉默 Tspan1表达可以降低 HCT116/OXA细胞对OXA的耐药性。进一步用 20 g/mL OXA 处理转染后细胞。结果显示，沉默 Tspan1 表达可直接导致 HCT116/OXA细胞凋亡率显著升高，同时可以促进OXA诱导的细胞凋亡。进一步实验显示，OXA可以促进HCT116/OXA细胞自噬水平提高，而沉默Tspan1基因表达可以抑制 HCT116/OXA细胞自噬水平，同时可以抑制OXA诱导自细胞噬水平增加。本实验也存在一定局限性，未验证自噬诱导剂诱导 HCT116/OXA细胞发生自噬后，是否会增强沉默Tspan1基因表达后的细Figure 7.Knockdown of Tspan1 gene decreased the immunofluorescence intensity of LC3B protein in HCT116/OXA cells exposed to OXA.图7Tspan1基因沉默减弱OXA暴露下HCT116/OXA细胞中LC3B蛋白免疫荧光强度表3HCT116/OXA细胞中自噬蛋白表达比较Table 3.Comparison of autophagy protein expression in HCT116/OXA cells（MeanSD.n=3）Groupsi-NCsi-Tspan1si-NC+OXAsi-Tspan1+OXALC3-II/LC3-I0.700.040.600.040.880.040.400.02#Beclin-10.200.020.100.020.700.04*0.040.02#P620.200.020.300.02*0.020.01*0.600.03#*P0.05，*P0.01 vs si-NC group；#P0.01 vs si-NC+OXA group.Figure 8.Expression levels of autophagy-related proteins were evaluated in HCT116/OXA cells from each group.图8各组HCT116/OXA细胞自噬蛋白表达水平1420胞对OXA的耐药性，进而佐证沉默Tspan1基因表达通过抑制细胞自噬逆转CRC细胞的OXA耐药性。综上所述，Tspan1在OXA耐药CRC组织中高表达，而沉默Tspan1基因表达通过抑制细胞自噬逆转CRC细胞OXA耐药的作用。这对克服OXA耐药，改善CRC治疗效果具有一定参考价值。本研究下一步计划在动物水平验证沉默 Tspan1 基因表达对 OXA耐药CRC细胞的影响。参考文献1Xi Y，Xu P.Global colorectal cancer burden in 2020 and projections to 2040J.Transl Oncol，2021，14（10）：101174.2Zygulska AL，Pierzchalski P.Novel diagnostic biomarkers in colorectal cancer J.Int J Mol Sci，2022，23（2）：852.3Sun W，Li J，Zhou L，et al.The c-Myc/miR-27b-3p/ATG10 regulatory axis regulates 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