SN∕T 4849.5-2017 出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法 实时荧光PCR法 第5部分：蔓越莓和蓝莓(出入境检验检疫).pdf

书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光犘犆犚法第部分：蔓越莓和蓝莓犐 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳狋 犺 犲犻 狀 犵 狉 犲 犱 犻 犲 狀 狋 狊狅 犳犮 狅犿犿狅 狀狊犿犪 犾 犾犫 犲 狉 狉 狔犳 狉 狌 犻 狋 狊犻 狀犳 狅 狅 犱犪 狀 犱犼 狌 犻 犮 犲犳 狅 狉犲 狓 狆 狅 狉 狋犚犲 犪 犾 狋 犻 犿犲犘犆犚犿犲 狋 犺 狅 犱犘 犪 狉 狋 ：犆 狉 犪 狀 犫 犲 狉 狉 狔犫 犾 狌 犲 犫 犲 狉 狉 狔 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书前言 出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光法系列标准共分为部分： 第部分：蓝莓； 第部分：树莓； 第部分：黑加仑； 第部分：桑葚； 第部分：蔓越莓和蓝莓； 第部分：猕猴桃。本部分为 的第部分。本部分按照 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：吴亚君、陈颖、杨艳歌、黄文胜、韩建勋、张九凯、邓婷婷、王斌、刘鸣畅。犛犖犜 出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光犘犆犚法第部分：蔓越莓和蓝莓范围 的本部分规定了出口食品及饮料中蔓越莓和蓝莓成分的检测方法实时荧光法。本部分适用于鲜果、冷冻果、蜜饯、鲜榨果汁、果肉型果汁、混浊汁、果干、果酱、及其他以蔓越莓和蓝莓为原辅料的食品及饮料中蔓越莓和蓝莓成分的定性检测（清汁及果酒除外） 。本部分所规定方法的最低检出限（）为（体积比） 。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验方法 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 蓝莓术语、定义和缩略语 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 小浆果狊犿犪 犾 犾犫 犲 狉 狉 狔犳 狉 狌 犻 狋 狊浆果是指由一个子房或联合其他花器发育成的柔软多汁的肉质单果，由一个或几个心皮形成。小浆果则泛指果实较小、多汁的一类浆果。 蔓越莓犮 狉 犪 狀 犫 犲 狉 狉 狔杜鹃花科越橘属红莓苔子亚属，一种表皮及果肉都是鲜红色的圆形小浆果的俗称，别名：蔓越橘、小红莓，酸果蔓、蔓越梅、鹤莓。拉丁学名：犗狓狔 犮 狅 犮 犮 狅 狊。分为大果红莓苔子（美洲蔓越橘） （犞犪 犮 犮 犻 狀 犻 狌犿犿犪 犮 狉 狅 犮 犪 狉 狆 狅 狀） ，小果红莓苔子（毛蒿豆）（犞犪 犮 犮 犻 狀 犻 狌犿犿犻 犮 狉 狅 犮 犪 狉 狆狌犿） ，红莓苔子（北方蔓越橘）（犞犪 犮 犮 犻 狀 犻 狌犿狅 狓狔 犮 狅 犮 犮 狌 狊） ，红果扁枝越橘（南方蔓越橘） （犞犪 犮 犮 犻 狀 犻 狌犿犲 狉 狔 狋 犺 狉 狅 犮 犪 狉 狆狌犿）个品种群。 蓝莓犫 犾 狌 犲 犫 犲 狉 狉 狔根据 描述，蓝莓是杜鹃花科越橘属植物中蓝果类型的果实，小浆果，近圆形或圆扁形，并披一层白色果粉，果肉细腻，种子极小。拉丁学名：犞犪 犮 犮 犻 狀 犻 狌犿 ，分为兔眼蓝莓（犞犪 犮 犮 犻 狀 犻 狌犿狏 犻 狉 犵 犪 狋 狌犿） 、高丛蓝莓（犞犪 犮 犮 犻 狀 犻 狌犿犮 狅 狉 狔犿犫 狅 狊 狌犿） （分：南高丛蓝莓、北高丛蓝莓） 、半高丛蓝莓（犞犪 犮 犮 犻 狀 犻 狌犿犪 狀 犵 狌 狊 狋犛犖犜 犻 犳 狅 犾 犻 狌犿犞犪 犮 犮 犻 狀 犻 狌犿犮 狅 狉 狔犿犫 狅 狊 狌犿） 、矮丛蓝莓（犞犪 犮 犮 犻 狀 犻 狌犿犪 狀 犵 狌 狊 狋 犻 犳 狅 犾 犻 狌犿）五个品种群。 缩略语下列缩略语适用于本文件。：脱氧核糖核酸（ ） 。：聚合酶链式反应（ ） 。 值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。：脱氧核苷酸三磷酸（ ） 。：脱氧腺苷三磷酸（ ） 。：脱氧胞苷三磷酸（ ） 。：脱氧鸟苷三磷酸（ ） 。：脱氧胸苷三磷酸（ ） 。：尿嘧啶 糖基化酶（ ） 。：十六烷基三甲基溴化铵（ ） 。 ：三羟甲基氨基甲烷 （ ） 。：乙二胺四乙酸（ ） 。犜犪 狇：水生栖热菌（犜犺 犲 狉犿狌 狊犪 狇 狌 犪 狋 犻 犮 狌 狊） 。：光度密度（ ） 。方法提要果实样品直接粉碎离心，果汁样品直接离心，提取沉淀，果干、果酱、蜜饯先用蒸馏水清洗再提取。以蔓越莓或蓝莓果实为阳性对照，以其他水果为阴性对照，无菌水作为空白对照。使用特异性引物进行实时荧光扩增，通过实时荧光信号曲线判定是否存在蔓越莓或蓝莓成分。试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 的要求。所有试剂均用无酶污染的容器分装。 检测用引物和探针：蔓越莓和蓝莓成分扩增引物和探针、内参照（显花植物基因）引物和探针详见表。蔓越莓和蓝莓扩增靶标序列参见附录。表蔓越莓和蓝莓序列引物探针物种名称引物探针序列（ ）扩增片段长度靶基因内参照： （狀犱犺犅） 蔓越莓和蓝莓： （犿犪 狋犓） 犛犖犜 三氯甲烷（氯仿） 。 异丙醇。 提取缓冲液： ， ， ， ， 。 沉淀液：， 。 乙醇（体积分数） 。 溶液（ ） 。 蛋白酶（ ） 。 实时荧光反应混合液： 反应体系包括：（ ，酶学单位）的犜犪 狇酶、 、 的、 的酶、 的（，） 、 、 染料。 缓冲液： （ ） ， ， 。仪器设备 实时荧光仪。 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 恒温水浴锅。 离心机：离心力 犵。 微量移液器： ， ， ， 。 粉碎装置。 涡旋震荡器。 计。 量筒：容量 。 烘箱。检测步骤 样品前处理鲜果、冷冻果样品直接粉碎， 离心，取沉淀物部分。果干、果酱、蜜饯类样品先用蒸馏水浸泡清洗次，再粉碎。果汁样品取适量 离心 ，取沉淀部分。 犇犖犃提取取 样品，加入提取缓冲液，同时加入 倍体积的 蛋白酶， 温育，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加入适量提取缓冲液；取出后 离心 ，转移上清至离心管中，加入 倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀， 转速下离心 ；转移上清至另一灭菌的离心管中，再加入 倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温下 离心 ；转移上清至干净离心管中，加入等体积的沉淀液混匀，室温沉淀； 的转速离心 ；弃上清，加入 溶液，充分溶解沉淀；加入 倍体积的异丙醇或倍体积 冰箱中预冷的无水乙醇混匀， 放置 ， 离心 ，弃上清，用 乙醇洗涤沉淀一次， 犵离心 ，弃上清，室温下晾干。加入 双蒸水，室温 ，混匀，犛犖犜 保存。上述模板均可用等效提取试剂盒提取。 犇犖犃浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 和 处的吸光值犃 和犃 。的浓度按照式（）计算：犮犃犖 （）式中：犮 浓度，单位为微克每微升（） ；犃 处的吸光值；犖 核酸稀释倍数。当犃 犃 比值在 之间时，适宜于扩增。 实时荧光犘犆犚扩增 每个试样反应应设置次重复。 实时荧光反应体系见表。表实时荧光犘犆犚反应体系试剂体积实时荧光反应混合液 正向引物（ ） 反向引物（ ） 探针（ ） 模板（ ） 灭菌 实时荧光反应程序按如下条件进行：）内参照基因： ； 预变性 ； ， ， 个循环。）蔓越莓和蓝莓犿犪 狋 犽基因： ； 预变性 ； ， ， 个循环。 对照反应 所有试样均应同时设置平行的内参照检测与蔓越莓和蓝莓特异性检测，各体系中除引物探针外，其余组分及反应条件均与 一致。 在试样反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照，各对照反应体系中，除模板外，其余组分及反应条件应与 一致。质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效：）空白对照：无荧光对数增长，相应的 值 。犛犖犜 ）阴性对照：无荧光对数增长，相应的 值 。）阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 值 。结果判断与表述 结果判定在符合第章的情况下，结果判定如下：） 值 ，则判定为阳性。） 值 ，则重复实验一次。再次扩增后， 值 ，应查看相应的扩增曲线并结合荧光信号判定结果； 值 ，则判定为阴性。） 值 ，则判定为阴性。 结果表述 内参照阴性，目标成分阴性，表述为“未提取到植物组分” 。 内参照阳性，目标成分阳性，表述为“检出蔓越莓或蓝莓成分” 。 内参照阳性，目标成分阴性，表述为“未检出蔓越莓和蓝莓成分” 。 检测过程中防止交叉污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施按照 中附录的规定执行。犛犖犜 附录犃（资料性附录）基因扩增靶标参考序列犃 蔓越莓犿犪 狋 犓基因扩增靶标参考序列（ ： ）犃 蓝莓犿犪 狋 犓基因扩增靶标参考序列（ ： ）犛犖犜