草食动物免疫球蛋白表达谱及其多样性机制研究进展.pdf

中国畜牧兽医 ,():C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y&V e t e r i n a r yM e d i c i n e草食动物免疫球蛋白表达谱及其多样性机制研究进展雷逸辰,王紫腾,江钧益,王淑辉,孙秀柱(西北农林科技大学动物科技学院,杨凌 ;西北农林科技大学草业与草原学院,杨凌 )摘要:草食动物的抗病育种研究正由传统育种转向分子水平,其免疫系统中的抗体具有十分独特的结构和多样性产生机制,丰富的抗体库是草食动物抗病力形成的重要基础.抗体由免疫球蛋白构成,免疫球蛋白具有重链和轻链,并且各个草食动物的免疫球蛋白结构和多样性机制存在一定差异.虽然草食动物免疫球蛋白基因数量有限,但是多种形式的多样性机制促成了其丰富抗体库的形成,进一步增强了动物的免疫能力.目前草食动物在养殖场中的病死率较高,其免疫水平的提升迫在眉睫,因此对其免疫球蛋白结构和多样性机制的研究十分重要.作者介绍了免疫球蛋白的基本结构和几种不同的类型,并简述了牛、羊、兔、骆驼这种草食动物免疫球蛋白的基因结构及其表达多样性机制,旨在为其抗病育种研究提供相关的理论依据和研究思路.关键词:草食动物;免疫球蛋白;表达谱;表达机制;纳米抗体中图分类号:S 文献标识码:AD o i:/j c n k i 开放科学(资源服务)标识码(O S I D):收稿日期:基金项目:国家自然科学基金面上项目()联系方式:雷逸辰,E m a i l:q q c o m.通信作者孙秀柱,E m a i l:s u n x i u z h u n w a f u e d u c nA d v a n c e s o nE x p r e s s i o nP r o f i l e a n dD i v e r s i t yM e c h a n i s m s o f I m m u n o g l o b u l i n s i nH e r b i v o r eL E IY i c h e n,WANGZ i t e n g,J I ANGJ u n y i,WANGS h u h u i,S UNX i u z h u(C o l l e g e o fA n i m a lS c i e n c e sa n dT e c h n o l o g y,N o r t h w e s tA&FU n i v e r s i t y,Y a n g l i n g ,C h i n a;C o l l e g e o fG r a s s l a n dA g r i c u l t u r e,N o r t h w e s tA&FU n i v e r s i t y,Y a n g l i n g ,C h i n a)A b s t r a c t:T h er e s e a r c ho nd i s e a s er e s i s t a n c eb r e e d i n go fh e r b i v o r e si ss h i f t i n gf r o mt r a d i t i o n a lb r e e d i n gt om o l e c u l a r l e v e l T h e a n t i b o d i e s i n t h e i mm u n e s y s t e mo f h e r b i v o r e sh a v e av e r yu n i q u es t r u c t u r ea n dd i v e r s i t yg e n e r a t i o nm e c h a n i s m,a n dt h er i c ha n t i b o d yl i b r a r yi sa ni m p o r t a n tb a s i sf o rt h ef o r m a t i o no fd i s e a s er e s i s t a n c eo fh e r b i v o r e s A n t i b o d yi sc o m p o s e do f i mm u n o g l o b u l i n,w h i c h h a s h e a v y c h a i n a n d l i g h t c h a i n,a n d t h e s t r u c t u r e a n d d i v e r s i t y m e c h a n i s m o fi mm u n o g l o b u l i na r ed i f f e r e n ta m o n gh e r b i v o r e s A l t h o u g ht h en u m b e ro f i mm u n o g l o b u l i ng e n e si nh e r b i v o r e s i sl i m i t e d,t h ed i v e r s em e c h a n i s m s i nv a r i o u sf o r m sc o n t r i b u t et ot h ef o r m a t i o no fr i c ha n t i b o d y l i b r a r i e s,w h i c h f u r t h e r e n h a n c e t h e i mm u n e c a p a c i t yo f a n i m a l s A t p r e s e n t,t h e c a s ef a t a l i t yr a t eo fh e r b i v o r e s i nf a r m s i s r e l a t i v e l yh i g h,a n dt h e i m p r o v e m e n to f t h e i r i mm u n e l e v e l si su r g e n t T h e r e f o r e,i t i sv e r yi m p o r t a n t t os t u d yt h es t r u c t u r ea n dd i v e r s i t ym e c h a n i s mo f t h e i ri mm u n o g l o b u l i n T h e a u t h o r i n t r o d u c e s t h e b a s i c s t r u c t u r e a n d d i f f e r e n t t y p e s o fi mm u n o g l o b u l i n,a n db r i e f l yd e s c r i b et h eg e n es t r u c t u r ea n de x p r e s s i o nd i v e r s i t ym e c h a n i s mo fi mm u n o g l o b u l i n i nf o u rh e r b i v o r e s:C a t t l e,s h e e p,r a b b i ta n dc a m e l,i no r d e rt op r o v i d er e l e v a n tt h e o r e t i c a lb a s i sa n dr e s e a r c h i d e a s f o r t h eb r e e d i n go fd i s e a s er e s i s t a n c e K e yw o r d s:h e r b i v o r e;i mm u n o g l o b u l i n;e x p r e s s i o np r o f i l e;e x p r e s s i o nm e c h a n i s m;n a n oa n t i b o d i e s中国畜牧兽医 卷抗体由免疫球蛋白(i mm u n o g l o b u l i n,I g)构成,在动物机体的免疫防御系统中发挥着至关重要的作用.草食动物在养殖场中的病死率较高,因此提升其免疫水平的需求也越来越高.丰富的抗体库是草食动物抗病力形成的重要基础,而抗体的多样性机制决定了其结构的多变性.目前,人们对牛、羊、兔、骆驼的免疫球蛋白基本结构已经有所了解,但是其多样性的遗传学机制仍存在很大空白.文章旨在综述种草食动物免疫球蛋白结构和多样性机制的研究进展,为在分子水平上丰富其抗体库提供理论依据和研究基础.免疫球蛋白简介 免疫球蛋白分子基本结构作为适应性免疫的标志之一,免疫球蛋白最早出现于约亿年前,伴随着有颌脊椎动物的出现.免疫球蛋白从B淋巴细胞中产生,它是针对病原体的免疫防御系统重要的组成部分,可以识别和清除外来抗原.所有免疫球蛋白分子都具有相同的基本结构,如I g G分子(图),即具有条相同的重(h e a v y,H)链和条相同的轻(l i g h t,L)链,其中,重链包含个 序 列 高 度 可 变 的N 端 可 变 域,称 为 可 变(v a r i a b l e,V)区,以及个或个恒定(c o n s t a n t,C)区;轻链具有个N 端可变域和个C 端恒定域,全部由二硫键连接.轻链和重链的可变N 端结构域一起形成个抗原结合位点,并与CH 和轻链恒定结构域一起形成称为片段抗原结合域(f r a g m e n to fa n t i g e nb i n d i n g,F a b)的部分.免疫球蛋白重链和轻链的C 端区域,在同一物种不同个体中只有少数连续变异,因此称为恒定区域.CH 和CH(I g M和I g E中的CH )结构域共同形成C区.不同免疫球蛋白同种型的C区由不同的外显子簇编码.由于免疫球蛋白抗原结合部分具有高度多样性,因此能够识别几乎所有类型的抗原,在免疫反应中发挥着重要作用.重链编码V区的外显子称为可变区基因、多样性(d i v e r s i t y,D)基因和连接性(j o i n i n g,J)基因,而与重链不同的是,轻链基因座中不存在D片段.V、D、J片段在染色体上以多拷贝阵列的形式存在.这些基因通过V(D)J重组组装在发育中的B淋巴细胞中,形成完整的免疫球蛋白.图 I g G分子的结构示意图F i g S c h e m a t i cd i a g r a mo f t h e s t r u c t u r eo f I g Gm o l e c u l e s 免疫球蛋白基因的类型已知哺乳动物有种免疫球蛋白同种型:I g M、I g D、I g A、I g G和I g E,它们的重链对应于不同类型,称为、.不同免疫球蛋白之间的长度和序列结构差异很大,以多种分子形式存在.值得注意的是,重链I g、I g 和I g 具有个CH,而I g和I g 包括个CH.轻链仅有或类型,其相对比例因物种而异,存在一定的使用偏好性.与的比率从人类的 到小鼠的 不等.I g M是一种很早就存在的抗体类,在所有脊椎动物的进化过程中都保存了下来.单体I g M由条重()链和条轻链组成,链恒定区包含个域(C C C C)和个C 端尾件.链中的C域取代了I g G、I g D和I g A重链中的铰链区,为这些重链中的F a b域提供了旋转灵活性.I g M通常通过连接链组装成二聚体或五聚体.值得注意的是,I g M和I g A这两种同种型可以通过单个免疫球蛋白分子的H链之间的二硫键形成多聚体.I g D于约亿年前就存在了,对灵长动物的研究发现,在猿猴中没有发现I g D;在阔鼻卷尾猴中,每个免疫球蛋白类别都有个基因,但I g D没有CH 外 显 子.I g D的 铰 链 比I g M更 长、更 灵活;然而与I g M(在进化过程中保持稳定)相反,CH编码外延和替代R NA拼接数量的差异使得I g D在脊椎动物中表现出相当大的结构可塑性.I g A的 重 链 恒 定 区(h e a v y c h a i n c o n s t a n t期雷逸辰等:草食动物免疫球蛋白表达谱及其多样性机制研究进展r e g i o n,HC)包括C 、C 和C .其每个结构域折叠成相似的球状二级结构,而位于每个HC的C 和C 域之间灵活的铰链区保证了I g A分子的灵活性,有助于I g A的活性.有趣的是,I g A在不同物种之间的长度和序列差异很大.与其他I g类别不同,I g A以多种分子形式存在:在人血清中主要形式是单体,而在黏膜表面发现的I g A为分泌型I g A(S I g A),是多聚体形式.I g G的个亚类I g G、I g G、I g G 和I g G 的二硫键结构被称为经典二硫键结构,但是在结构上有一定差异.I g G共含有 个链内二硫键;每个二硫键都与个单独的I g G结构域相关联.两条重链通过数量可变的二硫键在J区连接:I g G 和I g G 有个,I g G 有个,而I g G 有 个.I g E的重链由个恒定域组成.I g E分子(I g E F c)的F c区与I g E特异性受体F c R I和C D 相互作用并结合.I g E F c由个结构域组成:C 、C 和C .I g Y作为最丰富的血清抗体存在于鸟类、爬行动物、两栖动物和肺鱼中,却仅存在于哺乳动物I g G和I g E的进化前体中.I g Y的域架构与I g M和I g E相同,缺乏铰链区.种草食动物免疫球蛋白表达谱及其表达机制研究进展虽同为哺乳动物,但是牛、羊、兔、骆驼这种草食动物的免疫球蛋白基因座结构多种多样,这导致其功能与表达各不相同,并且不同动物体内有着不同的多样性机制,产生了大小不一的库的多样性.牛免疫球蛋白表达谱及其表达机制 牛免疫球蛋白表达谱研究表明,牛的免疫球蛋白重链由 个VH基因、个DH基因和 个JH基因组成.牛免疫球蛋白的轻链位于 号染色体,具有 个V基因(个是有免疫功能的),个J C 成对依次排列在下游.牛的HC基 因 座 位 于 第 号 染 色 体 上(q q ),全长约 k b,各种CH的排列顺序为 C C C C C C C .牛有至少个免 疫 球 蛋 白 轻 链 恒 定 区(i mm u n o g l o b u l i nl i g h tc h a i nc o n s t a n t r e g i o n,I G L C)基因,长度约为 k b,其中I G L C 和I G L C 是有功能的,而I G L C 优先在牛中表达,另外个(I G L C 和I G L C)是假基因 .而牛中轻链基因位于 号染色体,包含个V区和个J区基因片段,链表达很少,链占主要优势().奶牛免疫球蛋白重链基因座有 个功能性VH、个DH和个JH基因片段,而人类有 个VH、个DH和个JH基因片段.这意味着,理论上人类有多达 种可能的V(D)J组合,而奶牛只有 种,因此奶牛的抗体组合多样性要少得多.在人和小鼠中发现的典型抗体通常具有较短的重链 第三互补决 定区(c o m p l e m e n t a r i t yd e t e r m i n i n gr e g i o no f h e a v yc h a i n,C D RH)和平坦的结合表面,然而,奶牛拥有超长C D R H,具有多个半胱氨酸残基,其范围可达 个氨基酸,并与典型的抗原结合位点不同,其具备独特的“茎”和“旋钮”结构,凹表位有可能结合抗原.与其他物种相比,它的C D R H 还可以对人类免疫缺陷病毒(h u m a ni mm u n o d e f i c i e n c yv i r u s,H I V)包 膜 蛋 白(e n v e l o p ep r o t e i n,E NV)等不易中和的抗原提供有效的反应.这在一定程度上弥补了奶牛抗体库的多样性.偶蹄动物如猪、牛、骆驼的胚系DH和J H的数目很有限,但是在牛的重链基因座位中,已发现的个DH基因片段都很长,且有研究者通过系统发育分析表明牛的DH基因最接近兔和鸡.根据编码序列的长度和同一性,基因座中 个免疫球蛋白重链D片段(i mm u n o g l o b u l i nh e a v yc h a i nd i v e r s i t yr e g i o n,I GHD)被 鉴 定 出 来,并 被 分 为个 亚 组(I GHD I GHD).除I GHD 的个成员(大小为 n t)外,所有其他功能性I GHD片段均长于 n t,其中I GHD基因(b p)最长.牛免疫球蛋白多样性机制免疫球蛋白的基本结构由V(D)J基因片段组成,而V(D)J重组过程会产生大量抗体,是多样性抗体库形成的关键机制.多个V、D和J基因片段在V D和D J连接处以额外的连接多样性重组,并且通过重链和轻链配对出现更多的组合可能性,这促成了脊椎动物免疫系统中丰富的免疫球蛋白多样性.然而,在牛轻链V J重组时对 个功能V基因的使用有很强的偏好性,主要是V 和J C 参与重组,对其他的基因使用较少,这在一定程度上限制了轻链的重组多样性.而且牛具有很少的VH区,因此种系组合多样性有限,但其抗体具有长的C D R H 区,是丰富的氨基酸和二硫键结合的环.二硫键不仅有助于超长C D RH 牛抗体的多样性,而且在较短的C D R H 牛抗体多样性中也起作用,在牛抗原抗体结合位点提供新的结构互补位.而且半胱氨酸中国畜牧兽医 卷的突变也有助于提高超长C D R H 多样性,这种核苷酸突变可以发生在体细胞上,可能通过牛体内的胞嘧啶脱氨酶(A I D)介导的碱基对变化或基因转换(g e n ec o n v e r s i o n,G C)事件产生.体细胞超突变(s o m a t i ch y p e r m u t a t i o n,S HM)是免疫球蛋白在经历V(D)J重组后随后经历的基因修饰,完成V(D)J连接后,B细胞在抗原的刺激下移动到外周淋巴器官进行高频突变.S HM可以在重排的V区引入高频点突变,但插入或缺失碱基相对较少 ,进一步驱动了免疫球蛋白的多样化过程.由于V(D)J重组在奶牛中产生超长C D R H 抗体的过程中使用有限,牛超长抗体库的多样性也依赖于A I D诱导的编码整个旋钮区域的I GHD 基因的突变.值得注意的是,免疫球蛋 白 重 链 可 变 区(i mm u n o g l o b u l i n h e a v yc h a i nv a r i a b l er e g i o n,I GHV)突变的数量与A I D表达也是相关的.A I D在胎牛回肠P e y e r斑和脾脏中强烈表达,但在胎儿骨髓中却没有表达.活化诱导的A I D在抗体库多样化方面具有公认的作用,它被证明在接触抗原之前和之后诱导牛免疫球蛋白基因的S HM.西藏牦牛有很强的免疫力,其I g H、I g 和I g 的组合多样性与普通牛相似,与人和小鼠相比,对抗体谱系的贡献很小.Wu等 通过分析免疫球蛋白表达多样性,表明了牦牛的免疫谱系绝大多数是通过I g H重排中的连锁多样性产生的;并证实S HM对牦牛免疫球蛋白多样性的影响大于山羊和绵羊,除了C D R,框架区(f r a m e w o r kr e g i o n,F R)中的一些基因座也显示出高频突变;发现牦牛通过连接多样性和超长C D R H多样性弥补了V(D)J重组多样性的不足,这为牦牛免疫球蛋白的多样化表达提供了更多的贡献.种系遗传因素和S HM过程似乎都参与了牛超长C D R H的多样化.在 年,D e i s s等 通过分析牛抗体VH结构域的序列,发现了超长C D R 的亚群仅使用单个可变基因I GHV 重排为最长的多样性基因I GHD .I GHV 末端的个核苷酸重复编码更长的V区,产生扩展的链,有助于重排C D R 中的茎.在C D R 和C D R 中观察到低氨基酸变异性,证实了该亚群的抗原结合很可能仅取决于C D R.重要的是,该研究团队发现了一种新颖的、潜在的、A I D介导的牛VH超长C D R 旋钮的缺失多样化机制,其中I GHD 区域的内部密码子被移除,同时保持旋钮和茎的整体结构成分.这些缺失有助于进一步使半胱氨酸位置多样化,从而使二硫键合环多样化.羊免疫球蛋白表达谱及其表达机制 羊免疫球蛋白表达谱位于 号染色体的山羊免疫球蛋白链包含至少 个V基因片段(个潜在功能基因,个开放阅读框(o p e nr e a d i n gf r a m e,O R F)和 个假基因),个J C 簇排列成V()J C J C 模 式,支 架 上 有 另 一 个C .而其基因座包含 个V基因(个潜在功能基因,个O R F和个假基因片段),个J基因和个C基因,以V()J()C 有序模式定位于 号染色体上.同样位于 号染色体上的绵羊链由 个V 片段(个潜在功能基因、个O R F和 个假基因)、个J基因和个C基因组成.相比之下,号染色体上的绵羊I g 基因座仅包含个C基因、个J 片段和 个V 片段(个潜在功能基因和个假基因).与啮齿动物相比,反刍动物牛、羊的免疫球蛋白HC在结构上更类似于人,因为它们都共享个CH结构域和个相对较长的铰链段,该铰链段由个独立的外显子编码.山羊I g H含有个VH基因、个DH基因和个JH基因,但是只有个VH基因、个DH基因和个JH基因参与了V(D)J重组.其个DH片段和个J H片段位于基因组S c a f f o l d 上,DH基因呈 DH DH DH 结 构 排 列,全 部 为 功 能 基 因.JH基 因 以 J H J H J H J H J H J H 结 构 排 列,其中JH和JH为功能基因,JH、JH、JH和JH是假基因;而重链可变区基因分布在个基因组S c a f f o l d片段上,共个基因序列,根据核苷酸相似性分成个家族,其中第一家族包括个潜在功能基因、个O R F片段和个假基因片段,与绵羊第一基因家族和小鼠第二家族基因亲缘关系较近;第二家族包含个假基因片段.绵羊和山羊的I g H组成相似,但种系基因数量远少于牛.绵羊的JH基因座位于C上游约k b处,长约 k b,有个片段,排列情况与牛 号染色体上的J H非常相似.目前认为至少存在个假基因(末端缺少重组和剪切的必要序列);个功能基因JH和JH序列相似度大于,分别编码 和 个氨基酸,它们在所有发育阶段的免疫球蛋白可变区均有表达,但是J H 的表达偏好性更强 .绵羊C D R 环的范围为 个氨基酸.绵羊C D R 环在 个氨基酸中含有 个期雷逸辰等:草食动物免疫球蛋白表达谱及其多样性机制研究进展半胱氨酸残基().羊免疫球蛋白多样性机制与牛一样,山羊I GHV和I GHV亚群基因都没有功能,因此山羊I g H库的多样性在种系水平上受到严格限制,而且山羊体内缺乏像牛中能够产生超长C D RH 的I GHD基因,这表明该物种的重链多样性必须在很大程度上由重组后机制驱动.VH、DH 和J H 节段最常用于免疫球蛋白可变区的表达,以及由S HM引入的点突变是这些表达的可变区中存在的主要突变.值得注意的是,S HM过程中碱基发生转换突变的频率均高于颠换,其中以AG的突变数目最多,其次为GA;总体嘌呤发生替换的比例是嘧啶的倍左右;不同区段的替换数表现为:C D R 区 高 于C D R 区,F R 区 高 于F R 和F R 区.碱基的插入/缺失主要在C D R s区,数目多为或者的倍数.与重链相反,山羊的免疫球蛋白可用库中潜在的轻链多样性高于牛.有研究通过分析I g 和I g 的克隆进一步发现,V&V 、V&V 分别用于和链的表达.链比链显示出更多的连接多样性.此外,免疫球蛋白轻链中频率较高的S HM是山羊抗体库多样性的主要机制.不同于重链更偏向进行转换,链存在更高程度的颠换.与重链相比,山羊轻链的碱基插入和缺失频率更高,链频率最高,与马相同.这表明抗原对重链和轻链的选择强度不同.此外,G C广泛存在于牛羊等偶蹄类动物中.在V(D)J基因重排之后,利用上游V序列作为G C供体对重排的V元件进行基因转换.添加N核苷酸的大部分VH D J H重组具有框外连接,而G C这种同源D NA重组事件,倾向于促成框内替换和延伸.与S HM相似,G C是一种激活诱导的脱氨酶依赖性D NA修复途径,它可以利用未表达的VH基因的D NA片段替换长的核酸序列延伸,以使免疫球蛋白基因多样化.因此,其实大多数不可表达的VH基因在重链多样化中发挥着重要作用.有研究表明山羊链(/)和链(/)中大量的假基因提供了遗传转化的可能性,由此推测山羊应该存在大量的G C.绵羊同样使用S HM结合G C来形成多样性抗体库.有研究对重组轻链V J转录本的连接进行分析,表明尽管有更多潜在的种系编码组合多样性,但受限的V J C 重组和V k J k C 重组分别编码了绵羊中的大部分和链抗体库.兔免疫球蛋白表达谱及其表达机制 兔免疫球蛋白表达谱兔免疫球蛋白显示出独特的结构特征.兔V 序列和其他物种的轻链之间存在重大差异,特别是兔链在F R C D R 连接点附近有额外的个氨基酸,但是同一区域也与人D 种系小基因序列具有显著的同源性,尤其是先前发现的与人重链C D R 序列同源的 个核苷酸序列.轻链基因在家兔中的表达比率较低.兔基因组织更类似于鼠系统(有个不同的C基因,每个基因都位于其J段的两侧).兔轻链基因家族的特点是存在个C基因,可能是由于重复产生的.其表达存在很大差异,C 基因主要编码兔免疫球蛋白轻链的恒定区,链的表达量高达 ,并显示出不寻常的复杂多态性,已在家兔中观察到种 轻链同种异型b、b、b 和b ,这个主要的 等位基因在杂合兔的 基因座上的表达不均;而C 基因在家兔中并不表达或表达极少,其表达在突变或实验性同种异型抑制动物中增加.基因座中 增强子的缺少可以解释 同种型的优先利用.然而在C 基因下游约k b处存在个强大的增强子活性区域,该区域的序列在兔、人和小鼠之间高度保守,与 基因座相比,基因座的恒定区在进化过程中表现出很强的保守性.种系I g V基因显示C y s 编码区 UT R的不同长度,范围为 个氨基酸,导致功能性V J 序列之间的C D R 长度异质性范围为 个氨基酸.此外,有研究通过基因组测序鉴定了兔超过 个I g V和 个I g V功能基因,而且I g V库比小鼠和人更加多样化.兔I g G轻链分子域的组成包括个C D R和个恒定结构域.重链由个N 端可变结构域组成,也具有个C D R,而与轻链不同的是,其包含个恒定结构域(CH、CH 和CH);CH 和CH 通过个灵活的铰链区连接,该铰链区具有氨基酸序 列A P S T C S K P T C P(或 同 种 异 型 变 体 中 的A P S T C S K PMC P)并锚定I g G分子的个二硫键(橙色).更常见的轻链 包含个连接V区和C区的额外二硫键(图).有研究发现常用的新西兰白兔具有约 的I g G ()、约 的I g G ().中国畜牧兽医 卷图兔不同亚型免疫球蛋白结构图 F i g S t r u c t u r ed i a g r a mo fd i f f e r e n t s u b t y p e so f i mm u n o g l o b u l i n s i nr a b b i t 兔基因组包含个C基因、个C基因和多至 个C基因,其中至少有 个可以表达,且各种单倍型兔重链的C、C和C基因存在限制性位点多态性 .值得注意的是,兔有个h s,个增强子,位于I g H基因簇的 端,它可以显著增强S V 和VH启动子的活性,可能构成调节I g H基因表达的顺式元件之一.虽然其重链基因座包含至少 个I g H可变种系基因,但是,其中超过 被发现无功能.兔免疫球蛋白多样性机制与其他物种相比,兔VH库的多样性更为有限.在小鼠和人中,通过在免疫球蛋白重排中使用不同的重链和轻链可变区基因产生组合多样性是抗体库的主要贡献者,而在兔中,组合机制对重链多样性的贡献很小,因为只有少数I g HV基因被重新排列和表达.兔主要重排重链,然后是轻链.而兔轻链的一些V J 连接点添加了N和P核苷酸,因此,与其重链的有限组合多样性相比,兔可以利用多样化的种系I g V基因来丰富抗体库.免疫球蛋白基因的V(D)J重排在兔中随着成熟而减少 .在牛、羊、兔中,S HM和G C、类别转化重组起着更重要的作用.有限的新生兔抗体库在出生后第周之间进一步多样化,形成一抗库.两种主要机制正是G C和S HM,这两者都已被证明依赖于幼稚B细胞库对肠道微生物群的暴露.兔中V(D)J基因的 端 突 变 是 由S HM引 起 的,有 研 究 发 现 在 兔V(D)J基 因 下 游 的 前 b p内 有 高 突 变 频 率(),且该频率随着V(D)J基因距 端距离的增加而迅速下降.兔VH区域积累的突变比相应的人或小鼠VH区域多 以上.此外,兔V 区域存在S HM,尤其是在框架区域F R 和F R 中.与人和小鼠相比,S HM在兔V 库中的程度更高,也可以补偿用于产生兔功能抗体库的种系基因的有限多样性.兔的抗体多样性不仅是由S HM产生的,而且也由G C产生.G C在鸡和兔大量存在,高通量测序表明,与人()和小鼠()重链相比,这种G C机制在兔()中更占优势.兔的基因转换频率为I g G序列的,平均基因转换区长度为()b p.在新生儿B细胞库重排后,兔轻链基因也经历G C和S HM以使初级B细胞库多样化.与兔重链相比,兔轻链中的G C更常见.骆驼免疫球蛋白表达谱及其表达机制骆驼是高度适应极端沙漠生态系统的驯养动物,与来自同一地理区域的许多其他物种相比,对各种病原体的抵抗力相对较高,因此人们对骆驼免疫学领域的兴趣日益增加.骆驼免疫球蛋白表达谱重链I g G是所有骆驼科动物的特征,是初乳的主要分泌性免疫球蛋白.骆驼科动物(体液免疫系统双峰驼)的特殊性在于,除了有由二硫键连接的条相同的重链和条相同的轻链组成的常规四聚体I g G(I g G 亚类)外,还包括功能性同源二聚体I g G(I g G 和I g G 亚类),其C区(CHH)缺少通常与L链结合的第一个结构域CH,且缺乏轻链,仅包含条相同的重链,称为重链抗体(HC A b)(图).四聚体和同源二聚体I g G具有不同的重链,h C A b内的重链由个而不是个球状结构域组成.C D R 向其N端延伸了另外个最有可能参与抗原识别的氨基酸;C D R 环结构尽管保留了关键残基,但与VH中的规范环结构几乎不同;C D R 环更长,向后折叠以覆盖之前的V L接口 ,而扩展的C D R H 区域是骆驼VHH结构域的一个关键特征.为了期雷逸辰等:草食动物免疫球蛋白表达谱及其多样性机制研究进展将它们与常规抗体重链可变区VH区分开来,重链抗体的可变区被表示为VHH.J i r i m u t u等 报道了双峰驼的 个重链可变区基因,其V区基因使用率可能相对较高.单峰骆驼与双峰骆驼不同的是其免疫球蛋白结构具有轻链.单峰骆驼有 个I g V和 个I g V基因,轻链和的V基因的使用率偏低,下限分别约为和.单峰骆驼有 个重链可变区基因,即VH()和VHH()基因.与I g H V 序列相比,VH()序列中C D R H 长度通常较短,最常见的是 个残基.利用存在于铰链区的高序列同一性,将序列划分为I g G a和I g G b同种型.与I g G b的 个残基铰链相比,I g G a同种型具有 个氨基酸铰链.在个铰链的 端有一个保守C(X)C P K C P基序,这类似于在人铰链区观察到的基序.单峰和双峰骆驼的VH()序列聚类最接近人氏族;而其VH()序列与人氏族、人VH()和鼠VH()和VH()聚类.图骆驼常规I g G 和非常规I g G 和I g G 的一般结构示意图 F i g S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o no f t h eg e n e r a l s t r u c t u r eo f c o n v e n t i o n a l I g G a n du n c o n v e n t i o n a l I g G a n dI g G i nc a m e l 骆驼免疫球蛋白多样性机制缺乏轻链的骆驼HC A b的主要抗体结合库组合多样性依赖于原始的VHH种系片段数量和序列多样性,以及连接多样性.单峰骆驼和美洲驼物种中,VH()、D和J区与常规HC A b恒定区进行重组以产生功能抗体.而在C D R 区域观察到更广泛的序列变异,可能是由于基因重组过程中VJ基因的不精确连接导致.值得注意的是,七聚体样序列(免疫球蛋 白 重 组 信 号(r e c o m b i n a t i o ns i g n a ls e q u e n c e,R S S)的一个组成部分)的高发生率是VHH序列的一个独特特征.VH基因片段编码C D R 和C D R;C D R 是由V D J加入生成的.在这个连接过程中,通过在V D和D J连接处添加非模板核苷酸(连接多样性)引发了巨大的序列变异.VH和V L(组合多样性)的随机关联产生了极其多样化的抗体库.此外,骆驼可以通过S HM 和G C 实现库的额外多样化.单峰骆驼和轻链在框架区域F R 中显示出最大的位置变异性.在F R 和F R 中,残基变异几乎完全可以由单碱基突变来解释,这表明S HM比V基因的使用占优势.而链C D R中的序列保守性大于链;双峰骆驼VHH外显子由不同的V(D)J基因片段组装而成.重排的VHH s通过S HM过程广泛多样化,导致额外的高变区和核苷酸插入或缺失的高发生率,然而,从m u类转换到专用g a mm a同种型的时间和实际机制仍然难以捉摸.VHH中的突变模式比在VH中更多,尤其是在C D R环内以及框架区域中 .突变目标偏向于G和C碱基和(A/G/T)G(C/T)(A/T)基序,或D G YW.有研究进行了序列比较,表明VHH s在VH亚组中进化.然而,VHH种系片段高度多样化,导中国畜牧兽医 卷致抗原结合环的结构广泛.VHH s的H 区具有显著的高变性.个VHH亚家族被识别,其中个被证实在体内表达.这些多样化过程是由包含在影响F a b的VHH种系基因中的超突变和重组热点驱动的.一个家族中种系VHH s的较高复杂性不光是由于在环构象的关键位点存在新残基,还取决于C D R 的可变长度以及位于位置、的额外C y s的存在.单峰骆驼VHH结构库很容易通过引入额外的二硫键、核苷酸I n s/D e l s的高发生率、G C和广泛的S HM而多样化.重要的是,I n s/D e l s不是随机分布的,而是经常出现在互补位附近或内部.这些特定机制的出现也促成了与传统抗体不同的新互补位,这可以解释大部分HC A b作为竞争性酶抑制剂的现象.在VHH中具有高发生率的特定D NA信号触发了这些抗体多样化机制.骆驼轻链的缺失可能提 供了使这 些变化 成 为 可 能 并 允 许VHH出现新结构的机会.小结与展望不同草食动物的免疫球蛋白及其不同亚型在基因座结构和多样性机制上存在一定差异性,而其免疫球蛋白的独特结构也决定了自身多样性机制的特殊性.在有颌脊椎动物中,V(D)J重排是从少数基因产生抗原特异性受体以及免疫球蛋白多样性的主要机制.在初级淋巴器官中建立了初始多样性之后,在连接多样性的基础上由轻链、重链随机组合,以及其他多样性机制来额外丰富抗体库,如S HM、G C等.尽管有这些多样性机制存在,草食动物最终抗体的整体结构在很大程度上是保守的.与人和小鼠不同的是,牛中主要抗体组成的多样性不光受到数量和多样性有限的单个种系VH基因的限制,还有受重组时对特定功能V基因使用的强偏好性的影响,早期种系基因V(D)J重排产生有限的抗体基因多样性,因此牛采用