β-羟基丁酸抑制肺腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用机制.pdf

近年来，癌症的发病数和死亡数呈逐年递增趋势，其中肺癌的发病数和死亡数均居所有癌症之首 1。临床上将肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，约85%的肺癌都属于非小细胞肺癌，其中肺腺癌的发病率最高，占所有类型肺癌的40%以上 2。肺腺癌一般采用化疗进行治疗，然而，肺腺癌容易对化疗药产生耐药性，限制了化疗在肺腺癌中的应用 3。靶向药治疗肺腺癌近年得到较大的发展 4，但其高昂的价格也限制了使用。目前已有很多临床前研究表明生酮饮食（KD）可以抑制多种癌症，涉及的机制包括调控Warburg效应、炎症、MMP-9、组蛋白乙酰化、糖酵解，抑制p53突变以及激活AMPK途径 5,6。有研究报道KD可抑制小鼠肺癌细胞增殖并增强对化疗药物的敏感性，但也有其他学者通过临床研究指出KD并不能改善肺癌患者的预后，其可能原因是肺癌患者对KD治疗方案的依从性差 7-10。同时，由于KD是一种饮食方式，在不同的肿瘤环境下，KD发挥作用的成分和机制可能不同。因此，探索KD饮食发挥抗肿瘤作用的小分子化合物及其具体作用机制，发现用于治疗肺癌的新药物，有助于解决KD直接用于临床肺癌治疗的局限性。-羟基丁酸（BHB）是长时间运动、饥饿或缺乏碳水化合物的情况下，葡萄糖的供应不足以满足身体的能量需求时，在肝脏肿由脂肪酸合成并从肝脏向外周组织输送能量的基本载体。有研究指出KD的摄入能明显提升血液中BHB的浓度 11。有临床研究表明，KD提高了-羟基丁酸抑制肺腺癌细胞增殖羟基丁酸抑制肺腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用机制迁移及侵袭的作用机制黄云龙1，朱玉峰2，石 瑾2，刘 蓉1，曾 婷1，韩良辅11佛山复星禅诚医院肿瘤中心，广东 佛山 528041；2南方医科大学南方医院，广东 广州 510515GPR109Apartlymediatesinhibitoryeffectsof-hydroxybutyricacidonlungadenocarcinoma cell proliferation,migration and invasionHUANG Yunlong1,ZHU Yufeng2,SHI Jin2,LIU Rong1,ZENG Ting1,HAN Liangfu11Cancer Center,Chancheng Hospital,Foshan 528041,China;2Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China摘要：目的 探究-羟基丁酸（BHB）对肺腺癌细胞（A549细胞、LLC细胞）的作用及其调控机制。方法 分别用0 mmol/L（PBS）、5 mmol/L、10 mmol/L的BHB处理人肺腺癌A549细胞和LLC细胞，用CCK-8、EdU染色、细胞划痕和transwell实验检测细胞的活性、增殖、迁移和侵袭。GEPIA在线分析GPR109A在正常和肺腺癌样本之间的表达差异。RT-PCR和Western blot检测不同剂量BHB处理对GPR109A表达的影响。敲低GPR109A后观察A549细胞和LLC细胞对BHB的反应，探究GPR109A是否参与介导BHB的抑癌作用。在裸鼠和Balb/c小鼠右腋皮下分别接种A549细胞、LLC细胞及相应系的GPR109A敲低细胞，给予BHB或等体积无菌水灌胃21 d，观察肿瘤生长情况。结果 BHB以浓度依赖方式抑制A549细胞和LLC细胞的活性、增殖、迁移和侵袭（P0.05）。GEPIA在线分析发现GPR109A在肺腺癌病人中表达下调，且体外验证发现GPR109A的mRNA表达量和蛋白表达量随BHB浓度升高而上升（P0.05）。BHB对A549细胞和LLC细胞的抑制作用是由GPR109A部分介导，体内实验结果进一步显示BHB可通过介导GPR109A的表达来抑制裸鼠和balb/c小鼠体内肿瘤的生长（P0.05）。结论 BHB可部分介导GPR109A的表达来抑制肺腺癌细胞的恶性行为，并抑制小鼠体内的肿瘤生长。关键词：肺腺癌；-羟基丁酸；G蛋白偶联受体；GPR109A；A549细胞Abstract:Objective To explore the mechanism that mediates the inhibitory effects of-hydroxybutyrate(BHB)on lungadenocarcinoma cells.Methods A549 and LLC cell lines treated with 5 or 10 mmol/L BHB were examined for changes in cellviability,proliferation,migration,and invasion using CCK-8 assay,EdU staining,scratch assay,and Transwell assay.Thedifferential expression of GPR109A in lung adenocarcinoma and normal lung tissue was analyzed using GEPIA database.GPR109A expressions in BHB-treated lung adenocarcinoma cells were determined using RT-PCR and Western blotting.Thechanges in IC50of BHB were examined in A549 and LLC cells with GPR109A knockdown.The effect of BHB administered viagavage for 21 days on tumor growth was evaluated in nude mouse and Balb/c mouse models bearing xenografts derived A549and LLC cells with or without GPR109A knockdown.Results Treatment with BHB concentration-dependently repressed theviability,proliferation,migration and invasion of A549 and LLC cells.GPR109A expression was significantly decreased in lungadenocarcinoma tissues and A549 and LLC cell lines(P0.05).Loss of function experiments showed that the inhibitory effectsof BHB on A549 and LLC cells were partly mediated by GPR109A,and in the tumor-bearing mouse models,BHB significantlyinhibited tumor growth partly by regulating GPR109A expression(P0.05).Conclusion BHB can repress the malignantbehaviors of A549 and LLC cells and inhibit tumor growth in mice,and these effects are mediated partly by regulatingGPR109Aexpression.Keywords:lung adenocarcinoma;-hydroxybutyrate;G protein coupled receptor;GPR109A;A549 cells收稿日期：2023-02-06基金项目：佛山市卫生健康局医学科研课题（20230816A010085）作者简介/通信作者：黄云龙，主治医师，E-mail:f_doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2023.10.12J South Med Univ,2023,43(10):1744-17511744放疗患者的空腹BHB浓度，也改善了患者身体组分和生活质量 12。这提示BHB可能是KD发挥抗肿瘤作用的小分子化合物。GPR109A是一种G蛋白偶联受体，被报导可作为BHB的受体被激活，进一步上调抑癌基因Hopx的表达，发挥抑制结肠癌进展的作用 13,14。有研究指出，KD或者BHB可通过GPR109A激活巨噬细胞的神经保护亚群发挥了神经保护的作用 15。这提示 BHB 和GPR109A之间密切的联系，但目前BHB与GPR109A在肺癌中的作用还未有报道，因此本研究尝试探究BHB对肺腺癌A549细胞的作用及其调控机制，为BHB的临床应用和肺癌治疗提供理论依据。1 材料和方法1.1 材料人肺腺癌细胞A549，小鼠肺癌细胞LLC，F-12K培养基，LLC 细胞专用培养基（普诺赛）；胎牛血清（Gibco）；BHB（MACKLIN）；EdU细胞增殖检测试剂盒，CCK-8 试剂盒（碧云天生物）；Transwell 小室，Matrigel基质胶（Corning）；BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物）；GPR109A一抗、actin 一抗、HRP标记二抗（ThermoFisher）。1.2 方法1.2.1 细胞培养 本研究选择肺腺癌细胞系A549和LLC（普诺赛），A549细胞所用培养基为含10%胎牛血清的F-12K培养基，LLC细胞使用专用培养基，培养温度为37，培养箱气体为95%的空气和5%的CO2。1.2.2 细胞增殖测定 取处于对数期的A549细胞或LLC细胞，以2105/孔接种于6孔板，细胞贴壁后饥饿4 h，分组设置为0、5、10 mmol/L 3组，0 mmol/L组加入PBS，其他两组分别加入5、10 mmol/L的BHB处理，36 h后按照试剂说明书进行孵育、固定、通透、洗涤、染色和荧光检测。1.2.3 细胞活性测定 取生长状态良好的细胞制备成一定浓度的细胞悬液，100 L/孔加入96孔细胞培养板中，细胞数目为8000/孔。37 培养箱培养3 h使细胞贴壁，然后加入不同浓度（0、5、10 mmol/L）的BHB处理，处理后不同时间点（0、1、2、3 d）取细胞进行后续实验。取10 L CCK-8溶液加入96孔细胞培养板，在37 培养箱中继续孵育2h，然后测定波长的吸光度A490nm。1.2.4 细胞迁移测定 培养板接种细胞前先用marker笔在6孔板背面画横线标记。细胞消化后以5105/孔种入6孔板，待细胞铺满板底后，用10 L枪头垂直于孔板建立细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。用PBS清洗干净游离细胞，然后分别加入0、5、10 mmol/L的BHB，拍照记录，然后将培养板放入培养箱培养，36 h时拍照记录细胞迁移情况，计算细胞的迁移距离，计算公式为：细胞迁移距离=0h划痕宽度-36h划痕宽度。1.2.5 细胞侵袭测定 对数期细胞在含有10%FBS的培养基中培养23代，待细胞汇合达到80%左右，饥饿处理24 h。铺胶：4 溶解基质胶过夜；4 预冷小室、培养板和枪头；在4 用无血清的冷培养基稀释基质胶，加入到小室的上层，铺匀在膜上；立即将铺好的基质胶的细胞小室至于培养板中，37 孵育1 h。细胞用PBS清洗1次，胰酶消化，然后用含5%BSA的无血清培养基中和，1500 r/min离心10 min。用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度。取上述细胞液加入小室，下室加入含有10%FBS的培养基。37孵育48h。孵育结束后，小心去除细胞小室，吸掉上层培养液，PBS清洗1次，4%多聚甲醛固定5 min，0.5%结晶紫染色20 min。PBS洗掉多余染料，立即用棉签擦去滤膜上层的细胞，室温静置风干，显微镜下观察滤膜下层的细胞，随机选取不同的视野计数并算均值。1.2.6 GEPIA2在线分析 利用GEPIA2在线工具（http:/gepia2.cancer- RT-PCR 样品用1 mL冰PBS洗 1次，加入1 mLTrizol，室温静置20 min。加入0.2 mL氯仿混匀，室温静置5 min，4，12 000 g离心15 min，取上清（约60%体积），加入0.5 mL异丙醇，混匀，室温静置10 min，4，12000g离心10min，弃上清，加入1mL75%乙醇，混匀，4，12000g离心5min，弃上清，室温下干燥10min。加10 LDEPC水溶解RNA，进行核酸定量，判断RNA纯度，并计算逆转录cDNA时所需RNA体积，在20 L反应体系中 RNA的总量为2 g。根据说明书，取逆转录好cDNA2 L在冰上避光加入事先已经配好的Sybr反应体系中，放入real time PCR仪，95 30 s预变性，95 变性5 s，退火30 s，共40个循环，检查融合曲线，再根据Ct值计算GPR109A的相对表达量，以-actin作为内参（人 GPR109A 引物 Forward：ATGTTGGCTATGAACCGCCAG，Reverse：GCTGCTGTCCGATTGGAGA；人-actin 引物 Forword：CATGTACGTTGCTATCCAGGC，Reverse：CTCCTTAATGTCACGCACGAT；小鼠GPR109A引物 Forward：CTGGAGGTTCGGAGGCATC，Reverse：TCGCCATTTTTGGTCATCATG T；小鼠-actin 引物 Forword：GGCTGTATTCCCCTCCATCG，Reverse：CCAGTTGGTAACAATGCCATGT）。1.2.8 Western blot检测 提取细胞蛋白质，离心后的上清蛋白用BCA法定量后，使每个加样孔道中蛋白量为50 g。每个蛋白样品加入5上样缓冲液（4:1，v/v），95100 煮5 min，离心混匀，上样，进行SDS-PAGE电泳。卸下分离胶覆上PVDF膜电转。电转后浸于1%TBST溶解的5%脱脂奶粉中室温缓慢摇动封闭1 h；封闭完成将膜置于一定稀释比例的特异性一抗在室温缓http:/www.j-J South Med Univ,2023,43(10):1744-17511745慢摇动1 h，放入4 冰箱过夜。室温平衡30 min后用1%TBST洗脱5 min，洗3次。将膜放入HRP标记二抗中室温缓慢摇动孵育1 h，1%TBST洗脱10 min，洗3次。取ECL试剂盒中的发光底物溶液和增强剂溶液（1）各0.5 mL，混匀后加入膜上作用13 min，于ECL成像系统成像，结果用ImageJ软件进行分析。1.2.9 细胞转染与筛选 GPR109A的shRNA质粒委托吉玛基因构建。为扩增质粒，将10 L甘油原菌接种到50 mL加氨苄西林（1 1000稀释）的LB培养基中。转速240 r/min，温度37，培养1416 h。在大肠杆菌DH5a中扩增并使用质粒Midi试剂盒纯化质粒。通过测定280和260 nm处的紫外吸收度来确定浓度和纯度。所有质粒的 A260/A280比值均为 1.92.0。转染前 24 h 将750W细胞置于15 cm板中，使转染时细胞融合达到70%90%。准备两个5 mL无菌试管，标记DNA和PEI。将50 g DNA稀释到2 mLPBS中，150 LPEI原液稀释到2 mLPBS中。一次将稀释的PEI加入稀释的DNA中，然后通过轻轻地上下移液两3次将溶液混合。室温孵育1530 min，使PEI/DNA复合物形成。轻轻滴加2 mL PEI/DNA复合物至培养皿中的细胞。轻轻搅拌混合，在375%CO2培养箱中孵育36h。转染后，除去带有PEI/DNA复合物的旧培养基，每盘加入20 mL新鲜完全培养基。在37 5%CO2的培养箱中孵育1夜。收取细胞用于后续实验。1.2.10 IC50测定取状态良好的细胞接种于96孔板，于37、含5%CO2空气及100%湿度的培养箱中培养24 h。细胞贴壁后分别加入0、5、10、20、40、80 mmol/L的BHB处理。在培养箱中继续培养24 h后，每孔加入10 LCCK-8溶液，继续在培养箱中孵育4 h，最后用酶标仪测定450 nm处的吸光度A，用Graphpad Prism 8软件计算IC50。1.2.11 异种移植实验 选取56周龄的裸鼠12只适应性饲养1周后，随机分为3组：Control组、BHB组、sh-GPR109A+BHB组，6只/组，Control组和BHB组在右腋皮下接种A549细胞，sh-GPR109A+BHB组接种敲低 GPR109A 的 A549 细胞。取 LLC 细胞和敲低GPR109A的LLC细胞以同样的分组在免疫系统正常的balb/c小鼠中进行异种移植瘤实验。细胞接种当天为D0，D0开始，BHB组和GPR109A+BHB组小鼠灌胃给予BHB80 mg/（d 只）连续21 d，Control组灌胃给予同体积无菌水。分别于第9、12、15、18、21天用游标卡尺测量每个小鼠的肿瘤大小，21 d时处死动物，取皮下肿瘤拍照、称重、测量并计算肿瘤体积。肿瘤体积计算公式：体积=（长径短径2）/2。本研究通过南方医院实验动物伦理委员会审查（批号：IACUC-PROJECT-20220624-002）。1.3 统计学分析所有数据采用Graphpad Prism 软件统计分析。计量资料以均数标准差表示，两组之间比较采用独立样本t检验，多组之间比较采用单因素方差分析，以P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 BHB抑制A549细胞和LLC细胞的增殖、迁移以及侵袭经过不同浓度的BHB处理A549细胞后，EdU染色结果显示，与对照组相比，5 mmol/L和10 mmol/LBHB处理能抑制A549细胞的增殖，且10 mmol/LBHB处理的抑制效果更为显著（图1A、B，P0.001）。CCK-8结果显示，BHB以浓度依赖方式降低A459细胞活性（图1C，P0.001）。同样的处理在LLC细胞中产生了一致结果（图1DF，P0.01）。BHB处理同样抑制了A459细胞和LLC细胞的迁移和侵袭，且高浓度BHB处理对A549细胞的抑制效果更显著（图1GN，P0.001）。2.2 BHB可上调A549细胞和LLC细胞中GPR109A的表达在 GEPIA2 数据库中对肺腺癌的数据集进行GPR109A表达差异分析中发现，GPR109A在肺腺癌病人中的表达显下调（图2A，P0.01）。利用A549细胞在体外进行验证，结果显示在用不同浓度的BHB处理A549细胞后，细胞中GPR109A的mRNA和蛋白表达水平均随BHB浓度升高而上升（图2BD，P0.01）。类似结果也在LLC细胞中得到证实（图2EG，P0.01）。2.3 BHB部分通过介导GPR109A抑制A549细胞和LLC细胞的增殖、迁移和侵袭PCR和Western blot结果显示，GPR109A表达量明显降低，GPR109A被成功敲低（图3A、B，P0.001）。CCK-8 结果显示在敲低 GPR109A 后，A549 细胞对BHB的IC50高于对照组（图3C，P0.05）。跟前述结果一致，在sh-NC转染的A549细胞中，BHB能抑制细胞增殖、迁移和侵袭的能力（图3DF，sh-NC vs sh-NC+BHB，P0.001）。当在A549细胞中敲低GPR109A后，BHB对A549细胞增殖，迁移和侵袭的能力的抑制作用被减弱（图3DF，sh-GPR109A#3 vs sh-GPR109A#3+BHB，P0.01）。在LLC细胞中重复这些实验也得到相一致的结果（图4AF，P0.05）。2.4 BHB抑制小鼠体内的肿瘤生长本研究构建了A549细胞裸鼠异种移植模型，进一步验证BHB的体内抗肿瘤作用。结果显示，在第21天时，BHB组的小鼠体内肿瘤质量和体积均明显小于对照组（图5AC，P0.05）。BHB组小鼠肿瘤中GPR109A的mRNA和蛋白表达量也均低于对照组（图5DF，P0.05），但J South Med Univ,2023,43(10):1744-1751http:/www.j-1746图1 BHB对A549细胞和LLC细胞的增殖、活性、迁移以及侵袭的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of BHB on proliferation,viability,migration,and invasion ofA549 and LLC cells.A,B:A549 cell proliferationdetected by EdU staining.C:A549 cell viability detected using CCK-8 assay.D,E:LLC cell proliferation detected by EdU staining.F:LLC cell viability detected using CCK-8 assay.G,H:A549 cell migration detected by scratch assay.I,J:LLC cell migration detectedby scratch assay.K,L:A549 cell invasion detected by Transwell assay.M,N:LLC cell invasion detected by Transwell assay.Scale bar:100m;*P0.01,*P0.001.86420Expression-log2(TPM+1)TumorNormal(n=483)(n=59)图2 BHB对GPR109A表达量的影响Fig.2 Effects of BHB on GPR109A expression in lung adenocarcinoma cells.A:Analysis of GPR109A expression in lungadenocarcinoma and normal control tissues from GEPIA2 database.B:GPR109AmRNAexpression in A549 cells detected byRT-PCR.C,D:Protein levels of GPR109AinA549 cells detected using Western blotting.E:GPR109AmRNAexpression in LLCcellsdetectedbyRT-PCR.F,G:ProteinlevelsofGPR109AinLLCcellsdetectedbyWesternblotting.*P0.01,*P0.05）。由于BHB可能会对机体免疫系统产生影响，本研究进一步利用免疫系统正常的balb/c小鼠构建异种移植模型，实验结果显示BHB在balb/c小鼠体内同样部分通过介导GPR109A抑制肿瘤生长（图5GL，P0.05）。sh-GPR109A#1sh-GPR109A#2sh-GPR109A#31.51.00.50.0Relative mRNAexpressionControlsh-NCA549*A图3 BHB对A549细胞的抑制作用是由GPR109A部分介导的Fig.3 Inhibitory effects of BHB on A549 cells are partly mediated by GPR109A.A,B:Transfection efficiency of shRNAevaluatedusing RT-qPCR and Western blotting.C:Viability of A549 cells with GPR109A knockdown evaluated using CCK-8 assay todetermine the IC50of BHB.D:EdU assay for detecting changes in BHB-induced inhibition of cell proliferation.E:Scratch assay fordetecting changes in BHB-induced inhibition of cell migration;F:Transwell assay for detecting changes in BHB-inducedinhibitionofcellmigration.Scalebar:100m;*P0.05,*P0.001;#P0.01,#P0.001.A54936 h0 hControlsh-NCsh-NC+BHBsh-GPR109A#3sh-GPR109A#3+BHB*Controlsh-NCsh-NC+BHBsh-GPR109A#3sh-GPR109A#3+BHBMigrated distance(m)8006004002000A549#*A549MergedEdUDAPIControlsh-NCsh-NC+BHBsh-GPR109A#3sh-GPR109A#3+BHBControlsh-NCsh-NC+BHBsh-GPR109A#3sh-GPR109A#3+BHB100806040200EuU-positive cell ratio(%)*#A549*Controlsh-NCsh-NC+BHBsh-GPR109A#3sh-GPR109A#3+BHBA549A549Invasive cell number10008006004002000Controlsh-NCsh-NC+BHBsh-GPR109A#3sh-GPR109A#3+BHB#*A549sh-GPR109A#1sh-GPR109A#2sh-GPR109A#3Controlsh-NCGPR109A-actinControlsh-NCsh-GPR109A#1sh-GPR109A#2sh-GPR109A#3Cell viability(%of control)Control IC50=9.658 mol/Lsh-NC IC50=10.26 mol/Lsh-GPR109A#3 IC50=24.44 mol/L-2-1012Log of BHB concentration150100500CA549GPR109Aprotein/-actin1.51.00.50.0*EBDFJ South Med Univ,2023,43(10):1744-1751http:/www.j-17483 讨论在肺癌的多种亚型中，肺腺癌最为常见，而且由于化疗和靶向治疗的局限，患者预后较差 2。除了常用的手术、放疗和化疗之类的治疗手段，KD也被部分研究人员用于干预肺腺癌，例如有研究发现KD可以抑制人肺癌A549细胞裸鼠皮下移植瘤的生长 16。另有研究表明KD可抑制人神经母细胞瘤裸鼠皮下移植瘤的生长，指出其可能的抗肿瘤机制与细胞自噬有关 17。有研究者也指出KD可在结直肠癌荷瘤小鼠体内发挥抗肿瘤效果，而且验证了KD代谢产物BHB体外抑制上皮细胞增殖和肿瘤生长 18。上述研究表明了KD和BHB抑制肿瘤发展的潜力，但是BHB在肺癌中是否有类似作用却sh-GPR109A#1sh-GPR109A#2sh-GPR109A#3Controlsh-NCLLCRelative mRNAexpression1.51.00.50.0*图4 BHB对LLC细胞的抑制作用是由GPR109A部分介导的Fig.4 GPR109A partly mediates the inhibitory effects of BHB on LLC cells.A,B:Transfection efficiency of shRNA evaluated usingRT-qPCR and Western blotting.C:CCK-8 assay for determining viability of LLC cells with GPR109A knockdown to calculate theIC50 of BHB.D:EdU assay for detecting changes in inhibitory effect of BHB on cell proliferation.E:Scratch assay for detectingchanges in inhibitory effect of BHB on cell migration.F:Transwell assay for detecting changes in inhibitory effect of BHB on cellmigration.Scalebar:100m;*P0.05,*P0.01,*P0.001;#P0.001.Controlsh-NCsh-NC+BHBsh-GPR109A#1sh-GPR109A#1+BHBLLC36 h0 hControlsh-NCsh-NC+BHBsh-GPR109A#1sh-GPR109A#1+BHBLLCsh-GPR109A#1sh-GPR109A#2sh-GPR109A#3Controlsh-NCGPR109Aprotein/-actin*1.51.00.50.0LLCsh-GPR109A#3sh-GPR109A#2sh-GPR109A#1sh-NCControlGPR109A-actinCell viability(%of control)Control IC50=8.02 mol/Lsh-NC IC50=7.757 mol/Lsh-GPR109A#1 IC50=15.95 mol/L-2-1012Log of BHB concentration150100500LLCLLCMergedEdUDAPIControlsh-NCsh-NC+BHBsh-GPR109A#1sh-GPR109A#1+BHBControlsh-NCsh-NC+BHBsh-GPR109A#1sh-GPR109A#1+BHBControlsh-NCsh-NC+BHBsh-GPR109A#1sh-GPR109A#1+BHBControlsh-NCsh-NC+BHBsh-GPR109A#1sh-GPR109A#1+BHBLLCLLCLLC#*#*EuU-positive cell ratio(%)100806040200Migrated distance(m)6004002000Invasive cell number5004003002001000DABCEFhttp:/www.j-J South Med Univ,2023,43(10):1744-17511749鲜有研究。本研究结果显示，BHB可在体外抑制肺癌A549细胞和LLC细胞的活性、增殖、迁移和侵袭能力。此外，本研究发现BHB能有效地抑制裸鼠和balb/c小鼠体内移植瘤的生长，结果初步证实了BHB对肺癌的抑制作用。GPR109A是BHB的受体，被报道可在多种疾病中发挥调控作用，如研究发现BHB可在老年小鼠体内通过GPR109A/AMPK通路抑制肝内质网应激和脂质积累，揭示其改善与年龄相关的肝脏脂质积累的潜力 19；有研究发现BHB可部分通过激活GPR109A直接抑制肥大细胞的功能，进而抑制型固有淋巴细胞介导的气道炎症 20；另有发现BHB可通过介导GPR109A调节诸如阿兹海默症、帕金森症、中风及病理性疼痛等神经疾病 21。基于此，本研究进一步探索BHB对A549细胞和LLC细胞的抑制作用是否也是通过GPR109A来介导。通过GEPIA2在线数据库分析GPR109A基因在肺腺癌中的差异化表达以及用不同浓度BHB处理A549细胞和LLC细胞，结果显示GPR109A在肺腺癌病人中的表达明显下降，而BHB处理能上调GPR109A的表达，这表明BHB对A549细胞和LLC细胞的抑制作用可能是由GPR109A介导。接着在A549细胞和LLC细胞中敲低GPR109A，并分别给予不同处理，实验结果进一步确定BHB对A549细胞和LLC细胞的抑制作用是部分通过GPR109A介导的。这些发现首次指出BHB在A549细胞和LLC细胞中部分通过介导GPR109A发挥其抗肿瘤特性的调控机制。目前已有很多临床前研究表明KD可以抑制多种癌症 5,6，但也有报道显示KD可以对肿瘤的发生及发展图5 BHB的体内抗肿瘤作用Fig.5 Antitumor effect of BHB in nude mouse models bearing xenografts derived from A549 and LLC cells with or withoutGPR109Aknockdown.A:Gross observation of the dissected tumors on day 21.B:Comparison of tumor weight.C:Growth curveof the tumors in nude mice.D,F:mRNAand protein expressions of GPR109Ain the tumor samples.G:Gross observation of thedissected tumors from Balb/c mice on day 21.H:Weight of the tumors from Balb/c mice.I:Growth curve of the tumors in Balb/cmice.J,L:mRNAandproteinexpressionofGPR109Ainthetumorsamples.*P0.05,*P0.001;#P0.05,#P0.01,#P0.001.sh-GPR109A+BHBBHBControlA549GPR109A-actinTumor volume(mm3)10008006004002000A549ControlBHBsh-GPR109A+BHB912151821Gavage time(d)*ControlBHBsh-GPR109A+BHBA549ControlBHBsh-GPR109A+BHBTumor weight(g)0.30.20.10.0sh-GPR109A+BHBBHBControlA549#*sh-GPR109A+BHBBHBControlLLCLLC#*Tumor weight(g)0.30.20.10.0sh-GPR109A+BHBBHBControlA549*ControlBHBsh-GPR109A+BHBLLC912151821Gavage time(d)sh-GPR109A+BHBBHBControlRelative GPR109Aexpression43210Tumor volume(mm3)10008006004002000Relative GPR109Aexpression3210LLC#*#sh-GPR109A+BHBBHBControlsh-GPR109A+BHBBHBControlGPR109Aprotein/-actin2.52.01.51.00.50.0GPR109Aprotein/-actin2.01.51.00.50.0sh-GPR109A+BHBBHBControlA549LLCGPR109A-actin#*LLCBGHCDAJEFKLIJ South Med Univ,2023,43(10):1744-1751http:/www.j-1750起到促进作用。例如，生酮饮食增加了血清中酮体之一的乙酰乙酸的水平，导致表达BRAF v600e的人类黑色素瘤细胞在异种移植小鼠模型中的肿瘤生长潜力增强 22。在结节性硬化症大鼠模型中，虽然KD可以通过上调抑癌基因Nrf2、p53和OGG1抑制肾癌的早期生长，但是