MyD88和TRIF在乳房和乳房外Paget病皮损组织中的表达.pdf

中国中西医结合皮肤性病学杂志2023年第22卷第4期通信作者：张士发，E-mail：zhangshifa_MyD88和TRIF在乳房和乳房外Paget病皮损组织中的表达周文文，魏丽萍，王皓敏，王良民，张士发（1.锦州医科大学北部战区总医院研究生培养基地，辽宁 沈阳110016；2.大连医科大学北部战区总医院研究生培养基地，辽宁 沈阳110016；3.东北国际医院，辽宁 沈阳110623）摘要：目的研究髓样分化因子88（MyD88）和-干扰素TIR结构域衔接因子（TRIF）在乳房和乳房外Paget病（MPD和EMPD）中的表达，并在显微镜下观察染色阳性细胞；采用Pearson相关性分析法分析MyD88与TRIF的相关性。方法采集20例MPD和20例EMPD患者皮损组织石蜡标本并经临床及组织病理学确诊。以10例手术患者切除的良性组织病灶外2 cm并经病理学确认为正常皮肤组织作对照，采用免疫组化法检测MyD88和TRIF表达水平。结果MPD和EMPD中MyD88和TRIF的表达均明显高于正常皮肤组织，差异均有统计学意义（均P0.05）。显微镜下可见：Pearson相关性分析显示MyD88和TRIF的表达均无相关性（r分别为-0.114和0.185，P分别为0.632和0.436）。结论MyD88和TRIF通过不同信号通路在MPD和EMPD的发生发展中发挥重要作用。关键词：Paget病；髓样分化因子88；-干扰素TIR结构域衔接因子；免疫组织化学中图分类号：RP737文献标识码：A文章编号：（23）04-3034Expression of MyD88 and TRIF in Mammary and Extramammary Pagets DiseaseZhou Wenwen1，Wei Liping1，Wang Haomin2，Wang Liangmin3，Zhang Shifa31.Post Graduate Training Base of General Hospital of North Theater Command of Jinzhou Medical University，Shenyang110016，Liaoning，China；2.Post Graduate Training Base of General Hospital of North Theater Command of Dalian MedicalUniversity，Shenyang 110016，Liaoning，China；3.Northeast International Hospital，Shenyang 110623，Liaoning，ChinaAbstract:ObjectiveIn order to study the expression of myeloid differentiation factor 88（MyD88）and TIR domain-containing adaptor molecule inducing interferon-（TRIF）in mammary Pagets disease（MPD）and extramammary Pagetsdisease（EMPD）.MethodsParaffin specimens of skin lesions from 20 patients with MPD and 20 patients with EMPD werecollected and confirmed by clinical and histopathologic examination.Ten cases pathologically confirmed as normal skin tissuefrom excised 2 cm outside benign tissue of surgical patients were taken as controls，the expression levels of MyD88 and TRIFwere detected by immunohistochemistry.ResultsThe expression of MyD88 and TRIF were apparently higher in MPD andEMPD than that in normal skin tissues，there were significant statistical differences（all P0.05）.The microscope showed that there was no correlation between theexpression ofMyD88 and TRIF by Pearson correlation analysis（r=-0.114 and 0.185，P=0.632 and 0.436）.ConclusionMyD88and TRIF play an important role in the development of MPD and EMPD through different signaling pathways.Key words:Pagets disease；Myeloid differentiation factor 88；TIR domain-containing adaptor molecule inducing interferon-；ImmunohistochemistryPaget病（Pagets disease，PD）是一种少见的低度恶性的皮肤肿瘤，根据其发病部位分为乳房Paget病（Mammary Pagets disease，MPD）和乳房外Paget病（Extramammary Pagets disease，EMPD）。Toll样受体（TLR）属于模式识别受体，TLR信号转导通路包括髓样分化因子88（Myeloid differentiationfactor 88，MyD88）和-干扰素TIR结构域衔接因子（TIR domain-containing adaptor molecule inducingIFN-，TRIF）依赖的信号通路。许多研究表明，TLR参与了肿瘤的发生发展。本研究通路观察TLR中的2个关键信号通路因子MyD88和TRIF在MPD和EMPD肿瘤组织中表达水平的变化，探讨其在MPD和EMPD发生发展中的作用机制。论著303Chin J Dermato Venerol Integ Trad W Med 2023,Vol.22 No.41资料与方法1.1标本来源采集20例MPD和20例EMPD患者皮损组织石蜡标本并经临床及组织病理学确诊。MPD皮损组织均为女性，年龄3172岁，平均（54.3012.06）岁；EMPD皮损组织男性17例，女性3例；年龄5284岁，平均（71.159.72）岁。所有纳入标本的患者术前均未进行放疗和化疗，无特殊既往史及过敏史。以10例手术患者切除的良性组织病灶外2 cm并经病理学确认为正常皮肤组织作对照，其中男性6例，女性4例；年龄2068岁，平均（44.6016.00）岁。1.2主要试剂兔抗人MyD88单抗、兔抗人TRIF单抗和免疫组化染色试剂盒均来自北京博奥森生物技术有限公司。1.3实验方法采用免疫组化染色法，按免疫组化二步法说明书进行操作。石蜡切片常规脱蜡水化，高压锅修复抗原，分别滴加MyD88、TRIF稀释一抗工作液，工作浓度为1500，4 冰箱过夜（时间12 h），加二抗工作液37 孵育20 min，3，3-二氨基联本胺（DAB）染色液显色，苏木精复染、脱水、透明，中性树胶封片，显微镜下观察。以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。1.4结果判断由2位高年资皮肤病理科医生独立对免疫组化结果进行评估，在显微镜下随机选取5个独立高倍视野（400），结合染色强度和阳性细胞百分比进行结果判断。染色强度评分标准为：0分（无染色或细胞染色与背景无异）、1分（淡黄色-弱染色）、2分（棕黄色-中度染色）、3分（棕褐色-强染色）；阳性细胞百分比：0分（无）、1分（1%25%）、2分（26%50%）、3分（51%75%）、4分（76%100%），以染色强度和阳性细胞百分比的乘积进行结果判定：0分为阴性（-），13分为弱阳性（+），46分为阳性（+），7分为强阳性（+）。其中，将强阳性及阳性定义为高表达，弱阳性定义为低表达1。1.5统计学方法采用SPSS 25.0软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以均数标准差（）表示，采用单因素方差分析，Pearson相关性分析法分析MyD88与TRIF的相关性。以=0.05为检验水准，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1MyD88的表达在MPD皮损组织中MyD88的阳性表达主要位于细胞质和细胞膜上，呈棕黄色或棕褐色颗粒状；在EMPD皮损组织中MyD88的阳性表达主要位于细胞质和细胞核上，亦呈棕黄色或棕褐色颗粒状；在正常组织中MyD88呈弱阳性表达，主要见于角质形成细胞的细胞质上，呈淡黄色颗粒状分布，如图1。MyD88在MPD和EMPD的表达均显著高于正常组织（均P0.05），见表1。2.2TRIF的表达在MPD皮损组织中TRIF的阳性表达主要位于细胞质和细胞膜上，呈棕黄色或棕褐色颗粒状；在EMPD皮损组织中TRIF的阳性表达主要位于细胞质和细胞核上，也呈棕黄色或棕褐色颗粒状；在正常组织中TRIF呈弱阳性表达，主要位于角质形成细胞的细胞质上，呈淡黄色颗粒状，见图2。TRIF在MPD和EMPD的表达均显著高于正常组织（均P0.05），见表1。2.3MyD88与TRIF的相关性分析通过Pearson相关性分析二者的相关性，发现在MPD和EMPD皮损组织中，MyD88和TRIF的表达均无线性相关性图 1MyD88 在 MPD、EMPD 和正常组织中的表达A：MyD88在MPD中阳性表达，主要位于细胞质和细胞膜；B：MyD88在EMPD中阳性表达，主要位于细胞质和细胞核；C：MyD88在正常组织中弱阳性表达，主要位于角质形成细胞的胞质中ABC（DAB染色400）（DAB染色400）（DAB染色400）304中国中西医结合皮肤性病学杂志2023年第22卷第4期表 1MyD88 及 TRIF 在 MPD、EMPD 和正常组织中的表达水平比较样本位置nMPD20EMPD20正常组织10MyD88表达强度5.323.254.963.21a2.402.07abTRIF表达强度4.502.334.602.56a1.672.17ab注：与MPD比较，aP0.05；与EMPD比较，bP0.05。（）（r分别为-0.114和0.185，P分别为0.632和0.436）。3讨论MPD绝大多数累及女性，好发于单侧乳房、乳晕及其周围，平均发病年龄55岁，男性罕见；EMPD大多好发于男性，皮损好发于顶泌汗腺分布部位，如阴囊、会阴、肛周和腋窝等，平均发病年龄大于MPD。有关PD的病因和发病机制较多，但目前尚不完全明确。MyD88是一种衔接蛋白，属于Toll/白细胞介素-1受体（IL-1R）家族和死亡结构域家族成员，在多种肿瘤组织中高表达，但未见其与MPD和EMPD的相关研究。有研究表明，在乳腺癌中TLR4和MyD88的基因和蛋白均高表达，且表达强度与肿瘤大小、分期、淋巴结转移和远处转移显著相关性，在乳腺癌的发生发展过程中发挥着重要的促进作用2。也有研究表明，通过沉默人结肠癌细胞株SW480和HCT116细胞中的MyD88，可以抑制脂多糖（LPS）诱导的结直肠癌迁移、侵袭和增殖，恢复MyD88后，LPS可通过核转录因子B（NF-B）/丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）信号通路促进肿瘤细胞迁移、侵袭和增殖活力3。MyD88在卵巢癌组织中表达也明显升高，且与患者的临床分期及淋巴结转移有关4。本研究表明，MyD88在MPD和EMPD皮损组织中的表达均显著升高，提示MyD88可能通过与乳腺癌、结直肠癌和卵巢癌类似的机制参与了MPD和EMPD疾病进展过程，因为TLR/MyD88信号通路异常激活会产生一系列炎性因子和细胞因子（包括免疫抑制性细胞因子），会引起免疫抑制和免疫逃逸，最终导致肿瘤的生长、侵袭和转移5。由TRIF介导的信号通路被称为MyD88非依赖信号通路，TRIF只能通过TLR3和TLR4通路发挥作用。其中TLR3可以直接绑定TRIF，从而激活下游信号通路。TLR3可以促进头颈部肿瘤的发展，并且可以被顺铂激活，保护顺铂诱导的肿瘤细胞脱氧核糖核酸（DNA）损伤反应，从而导致癌细胞对顺铂产生耐药，进一步证实了TLR3在头颈部肿瘤的发生发展及药物治疗中的作用6。而TLR4需要间接通过TRIF相关的接头分子（TRAM）与TRIF绑定，才能激活下游一系列级联反应。TLR4在乳腺癌中显著上调与晚期肺癌淋巴结转移（TNM）分期相关，其可以通过上调NF-B调节因子的表达，促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制乳腺癌细胞的凋亡7。目前国内外关于TRIF与肿瘤之间关系研究较少。有研究显示，乳腺癌组织中TRIF基因和蛋白表达水平均显著升高，而且在乳腺癌不同阶段的表达出现差异化，认为TRIF的表达与乳腺肿瘤的增殖和分化密切相关8，其作用机制也应该是通过TLR3和TLR4介导而实现6-7。本研究表明，TRIF在MPD和EMPD肿瘤组织中的表达均显著升高，提示TRIF的异常激活可能通过TLR3和TLR4通路造成了型干扰素的过多表达和NF-B的过度活化，传递出肿瘤生长信号，引起了肿瘤细胞的生长和抗凋亡蛋白的表达，从而促进了肿瘤的发展进程9。图 2TRIF 在 MPD、EMPD 和正常组织中的表达A：TRIF在MPD中阳性表达，主要位于细胞质和细胞膜；B：TRIF在EMPD中阳性表达，主要位于细胞质和细胞核；C：TRIF在正常组织中弱阳性表达，主要位于角质形成细胞的胞质中ABC（DAB染色400）（DAB染色400）（DAB染色400）305Chin J Dermato Venerol Integ Trad W Med 2023,Vol.22 No.4?欢 迎 订 阅欢 迎 投 稿本研究表明，在MPD皮损组织中MyD88和TRIF阳性表达于肿瘤细胞的细胞质和细胞膜上，说明二者能在MPD细胞的胞质和胞膜上与不同的TLR（包括内涵体内和细胞膜上）结合，激活下游通路，促进肿瘤的进展；在EMPD皮损组织中MyD88和TRIF阳性表达于肿瘤细胞的细胞质和细胞核上，说明二者可分布于EMPD细胞的细胞质和细胞核上，活化相关因子，从而发挥相应的促癌作用。MyD88在MPD和EMPD细胞中阳性表达的部位的研究，国内外尚未见报告，TRIF也是如此，因此关于二者在Paget细胞中的表达部位情况还有待进一步研究和探索。本研究还表明，MyD88在MPD与EMPD皮损组织中的表达强度差异无统计学意义，提示MyD88在MPD和EMPD的病理过程中可能通过相同的信号通路发挥促癌作用。TRIF与MyD88类似，在MPD和EMPD皮损组织中的表达强度差异也无统计学意义，提示TRIF在MPD和EMPD中皮损组织也均发挥促癌作用，而与PD的发病部位无关。关于MyD88与TRIF在MPD和EMPD发生发展中的详细作用机制，还有待进一步探讨。有关MyD88和TRIF在恶性肿瘤中表达相关性的研究，国内外鲜有报告。本研究表明，在MPD和EMPD皮损组织中，MyD88和TRIF的表达均无相关性。在TLR信号转导通路中，MyD88可以被除TLR3以外所有的TLR所介导（包括TLR4），而TRIF只能被TLR3和TLR4所介导，TLR4是唯一可以同时激活MyD88和TRIF 2条信号转导通路的TLR，2条信号通路可共同激活下游肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）分子，引起NF-B的活化和释放，导致大量炎性因子和细胞因子的表达，进而促进肿瘤的进程5，表明MyD88和TRIF可以通过TLR4信号通路相互联系，由此推测二者可能有一定的相关性。但是MyD88还可以由其他TLR（除TLR3和TLR4）介导而激活下游通路发挥作用，而TRIF可以由TLR3介导而激活下游通路发挥作用，此时MyD88和TRIF可以没有相关性。因此MyD88和TRIF的表达强度可以不呈线性相关关系，其详细作用机制仍有待进一步探讨。参考文献：1于萍，步宏，王华，等.免疫组化结果的图像分析与人工计数方法的对比研究J.生物医学工程学杂志，2003，20（2）：288-290.2Chen X，Zhao F，Zhang H，et al.Significance of TLR4/MyD88expression in breast cancerJ.Int J Clin Exp Pathol，2015，8：7 034-7 039.3Zhu G，Cheng Z，Lin C，et al.MyD88 regulates LPS-inducedNF-B/MAPK cytokines and promotes inflammation and malignancyin colorectal cancer cellsJ.Cancer Genomics Proteomics，2019，16：409-419.4陈秀玲，陈秀慧.髓样分化因子88在卵巢癌组织中的表达及其临床意义J.中国临床药理学杂志，2016，32（24）：2 250-2 252，2 256.5Wang JQ，Jeelall YS，Ferguson LL，et al.Toll-like receptors andcancer：MYD88 mutation and inflammationJ.Front Immunol，2014，5：367.6Chuang HC，Chou HM，Chien CY，et al.Triggering TLR3 pathwaypromotes tumor growth and cisplatin resistance in head and neckcancer cellsJ.Oral 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