LncRNA LINC00342通过靶向miR-596促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭.pdf

LncLncRNA LINCRNA LINC0034200342通过靶向通过靶向miR-miR-596596促进胃癌细胞的增殖促进胃癌细胞的增殖、迁移迁移和侵袭和侵袭辛宝山，刘 刚，张成雄，汪 兵，史良会皖南医学院第一附属医院弋矶山医院胃肠外科，安徽 芜湖 241001LncRNA LINC00342 regulates gastric cancer cell proliferation,migration and invasion bytargeting miR-596XIN Baoshan,LIU Gang,ZHANG Chengxiong,WANG Bing,SHI LianghuiDepartment of Gastrointestinal Surgery,Affiliated Yijishan Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China摘要：目的 研究LINC00342在胃癌组织、细胞中的表达水平及影响胃癌细胞生物学功能的具体通路。方法 运用生物信息学技术，通过GEO数据库及相关预测软件，进行相关筛选及文献查询后，确定所研究的LncRNA及其下游所调控的miRNA；采用qRT-PCR检测LINC00342、miR-596在胃癌细胞系及人胃黏膜细胞中、胃癌组织及相应癌旁组织中的表达差异；细胞生物学功能上，过表达胃癌BGC-823细胞系中的LINC00342，将其分为pcDNA-LINC00342组和pcDNA组；过表达胃癌MGC-803细胞系中的miR-596，将其分为miR-596-mimic组及mimic-NC组；敲低胃癌MGC-803 细胞系中LINC00342的表达，将其分为si-LINC00342组及si-NC组、敲低胃癌BGC-823细胞系中miR-596的表达，将其分为miR-596-inhibitor组及inhibitor-NC组；分别进行 CCK-8、Edu细胞增殖实验、划痕实验、Transwell细胞侵袭实验、细胞周期实验以验证LINC00342 及 miR-596对胃癌细胞功能的影响；双荧光素酶标记实验验证LINC00342与miR-596的靶向调控关系。结果 通过生物信息学技术及相关软件预测分析，确定所研究LncRNA为 LINC00342，预测其下游调控的miRNA为miR-596；LINC00342在胃癌组织中表达高于癌旁组织（P0.05）；在人胃癌细胞系中表达高于人胃黏膜细胞系（P0.05），miR-596则相反（P0.05）；在胃癌细胞中，LINC00342 的过表达能促进胃癌细胞的增殖（P0.05）、迁移（P0.01）和侵袭（P0.001），且减少处于G0/G1期的细胞比率（P0.01）；LINC00342 敲低后，胃癌细胞的增殖（P0.05）、迁移（P0.01）和侵袭（P0.001）则受抑制，增加处于G0/G1期的细胞比率（P0.01）；miR-596则发挥着相反的作用。LINC00342和miR-596能特异性结合（P=0.0067）。结论 在胃癌细胞中，LINC00342通过调控miR-596，促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。关键词：生物信息学技术；MGC-803 和 BGC-823细胞系；长链非编码核糖核酸；LINC00342；miR-596Abstract:Objective To investigate the expression levels of LINC00342 in gastric cancer(GC)tissues and cells and thepathways mediating its effects on biological behaviors of GC cells.Methods Bioinformatic analysis was performed to identifythe lncRNAs and their downstream miRNAs involved in regulation of biological behaviors of GC cells.qRT-PCR was used toanalyze the differential expression of LINC00342 and miR-596 in GC cell lines,human gastric mucosal cells,and GC andadjacent tissues.In human GC MGC-803 and MGC-823 cells,the effects of LINC00342 overexpression,miR-596overexpression,LINC00342 knockdown,or miR-596 knockdown on cell proliferation,migration,invasion and cell cyclechanges were examined using Edu assay,CCK-8 assay,wound healing assay,Transwell assay,and flow cytometry.Theregulatory interaction between LINC00342 and miR-596 was investigated using a dual-luciferase reporter assay.ResultsInformatic analysis identified LINC00342 as the candidate lncRNA regulating biological behaviors of GC cells,with miR-596 asits downstream miRNA.LINC00342 expression levels were significantly higher while miR-596 expression levels were lower inGC tissues and cell lines than in the paired adjacent tissues and human gastric mucosal cell lines(all P0.05).In MGC-803 andMGC-823 cells,overexpression of LINC00342 significantly enhanced cell proliferation(P0.05),migration(P0.01),andinvasion(P0.001)and reduced the percentage of G0/G1 phase cells(P0.01),while knocking down LINC00342 significantlysuppressed cell proliferation(P0.05),migration(P0.01),and invasion(P0.001)and increased G0/G1 phase cell percentage(P5 cm）均为本课题组收集来自皖南医学院第一附属医院弋矶山医院胃肠外科进行手术治疗后切除下来的标本，标本离体后，立即将其放入已加有RNA保护液的冻存管中，并快速存放于实验室-80 冰箱中，直至提取RNA。标本选择严格遵守纳入、排除标准。纳入标准：患者临床资料、病理资料完整，术后病理证实为胃癌；患者知情同意本研究，能按期完成随访。排除标准：除胃癌外，曾合并其他部位恶性肿瘤的患者；存在自身免疫系统疾病、精神类疾病、妊娠、哺乳等可能影响本研究结果的患者。人胃黏膜细胞（GES-1）及 5 种人胃癌细胞系（AGS、MGC-803、BGC-823、SGC-7901、HGC-27）均购自中国科学院上海生命科学院。LINC00342引物由生工合成，引物序列F：5-CGTTCCAATGTGTTGGGT-3；R：5-TGGGAGGAGGTTGAGATG-3；小干扰 RNA Si-LINC00342、LINC00342 过 表 达 质 粒 pcDNA-LINC00342及其阴性对照由GenePharma合成；miR-596引物、模拟物、抑制物及其阴性对照由RIBOBIO（中国广州）；GAPDH 购自 Bioworld 公司。其余常规设备及试剂均由皖南医学院第一附属医院弋矶山医院中心实验室提供，所有细胞功能实验均重复3次，以减少误差，本研究通过皖南医学院第一附属医院伦理委员会批准（编号：2022伦审研第20号）。1.2 方法1.2.1 生信技术确定研究对象 首先课题组在GEO数据库当中检索出比较胃癌组织与正常胃组织之间基因的两个数据集：GSE13911（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE13911）与GSE54129（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE54129），通 GEO2R（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）在线分析，在相同条件下比较两组样本，用于 筛 选 差 异 表 达 lncRNAs，默 认 情 况 下，使 用Benjamini 和 Hochberg 错误发现率方法 应用调整后的P值来纠正假阳性结果的发生。差异表达的倍数变化（FC）通过对数转换进行评估，即筛选条件为|logFC|1和 调 整 后 的 P0.05。通 过 Venny 2.1.0(http:/b.csic.es/tools/venny/index.html)得到两组数据集中的差异性表达lncRNAs，两组结果取交集共得到 8 个 lncRNA。通过 Kaplan-Meier Plotter（http:/ dex.php?p=service）数据库，共查询出7个lncRNA的生存曲线（LINC00849的生存曲线未查询出），以 P0.01 为筛选条件，最终筛选出LINC00342、LINC00675 以 及 LINC00982 这 3 个lncRNA。通过查阅其他肿瘤数据库以及在Pubmed进行文献查询，最终确定LINC00342为研究对象。通过mircode及Diana生物信息学预测软件预测lncRNA下游调控miRNA，以及在Pubmed进行文献查询，课题组最终发现 miR-596与LINC00342可能存在潜在的靶向作用关系。1.2.2 PCR 测定LINC00342 及 miR-596 的表达量 用Trizol试剂（Invitrogen）提取胃癌组织和相应癌旁组织、人胃癌细胞和人胃黏膜细胞中的RNA；溶解于DEPC水中，取总含量为2 g的RNA进行逆转录，按照SYBRGreen 实时荧光定量PCR kit（Takara）说明书要求进行PCR；逆转录及PCR步骤应在冰上完成。LINC00342和 miR-596 的相对表达水平分别通过 GAPDH 和 U6标准化，使用2-Ct方法量化相对表达水平。J South Med Univ,2023,43(10):1761-1770http:/www.j-17621.2.3 胃癌细胞的培养细胞培养环境为37、5%CO2、饱和湿度，所用培养基为含有10%FBS（Gibco）的RPMI 1640（Gibco），每日观察细胞，保证传代时，细胞处于对数生长期，即细胞密度为70%80%。1.2.4 胃癌细胞系内转染 LINC00342、miR-596 取处在对数生长期的细胞，2 mL培养基重悬后转移至6孔板培养，每孔加入重悬细胞300 L。将LINC00342过表达质粒和其阴性对照、干扰RNA及其阴性对照、miR-596的mimic及其阴性对照、miR-596的inhibitor及其阴性对照各自加入125 L无双抗无血清培养基混匀，脂质体 LIPO-3000及P3000（Invitrogen）各取适量加入至相同培养基，室温放置5 min。然后将LINC00342的过表达质粒及其阴性对照、LINC00342的siRNA及其阴性对照、miR-596的mimic及其阴性对照、miR-596的inhbitor及其阴性对照分别与脂质体混匀，室温静置15 min。分别将上述混合物加入6孔板细胞中，混匀，置于培养箱中培养，46h后使用含血清的培养基换液，继续培养24 h后收集细胞进行下一步实验。各组细胞分别命名为pcDNA-LINC00342组和其阴性对照pcDNA组、si-LINC00342组及其阴性对照si-NC组、miR-596-mimic 组 及 其 阴 性 对 照 mimic-NC 组、miR-596-inhibitor组及其阴性对照inhibitor-NC组。1.2.5 CCK-8细胞增殖实验 将上述4组细胞在转染完成后24 h用胰蛋白酶（Gibco）消化，以8000细胞/孔的密度接种于96孔板，体积100 L。每个实验组设置3个复孔。按照试剂盒（Dojindo Laboratories）提供的说明书步骤处理细胞后，分别在0、24、48、72 h用酶标仪测定各孔的吸光值A450nm，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。1.2.6 Edu细胞增殖实验如上所述，每组分别取对数生长期细胞，以6103/孔细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。依次经过 Edu培养基孵育、PBS清洗、细胞固定液固定后，依次加入甘氨酸溶液、含0.5%TritonX-100的PBS，脱色摇床孵育后PBS清洗；再加入Apollo 染色反应液进行染色，最后每孔加入 1 Hoechst33342反应液避光孵育，用PBS清洗后，用荧光显微镜观测结果并拍照。1.2.7 细胞横向迁移（划痕实验）用marker笔于6孔板的背面平行于长边画线，两条线间隔约1 cm。每孔至少5条线。每孔加入约 5105各组细胞，24 h后用200 L枪头在每孔内垂直于背后横线划痕。PBS冲洗干净划下的细胞，加入无血清培养基。置于37、5%CO2培养。分别于 0、24、48、72 h在倒置显微镜下观察结果并拍照，用ImageJ软件分析结果。1.2.8 细胞纵向迁移（Transwell侵袭实验）转染24 h后的各组细胞，胰酶消化，无血清RPMI 1640培养基洗涤3 次后用无血清培养基重悬，调整密度为 3104/mL。Transwell 小室下室加 600 L含20%血清的培养基，上室加 200 L细胞悬液，37 孵育 24 h。取出小室，PBS洗 2 遍，加4%多聚甲醛固定15 min。加0.1%结晶紫溶液，室温染色20 min。自来水轻柔漂洗后，用棉签轻轻擦除上室表面非侵袭性细胞，室温干燥，至观察颜色适宜，在倒置显微镜下观察结果并拍照、计数，用ImageJ软件分析结果。1.2.9 细胞周期实验收集各组样本细胞，用冷PBS洗涤细胞并重悬，冷乙醇4 固定过夜；收集细胞，冷PBS洗重悬细胞后，加入RnaseA溶液，37 水浴后离心、弃上清，加入PI染液重悬细胞，轻轻混匀后4 避光孵育1 h；用流式细胞仪检测，激发波长为488 nm。采用FlowJo-V10软件进行分析，收集各组细胞S期、G0/G1期比率。1.2.10 双荧光素酶报告基因检测实验 将原代或变异全 长 型 LINC00342 克 隆 到 H306 pMIR-REPORTLuciferase质粒受体中，以上所有原代与变异的受体携带体和模拟生物体内源化，miR-596 模拟物均被导入293T细胞中。待48 h后，利用 Promega 试剂盒通过双荧光素酶受体分析系统 Dual-Luciferase ReporterAssay System（E1960,Promega），测量荧光素活性。1.2.11 统计学分析 统计分析选用GraphPadPrism8.0。正态分布的计量资料采用均数标准差描述，组间差异使用t检验和单因素方差分析比较，P0.05为差异有统计学意义（双侧）。2 结果2.1 确定LncRNA及其下游miRNA通过生物信息学技术及相关预测软件，最终确定所研究LncRNA为 LINC00342（图1），预测其下游调控的miRNA为miR-596。2.2 qRT-PCRLINC00342 在胃癌组织中表达高于癌旁组织（P0.05，图2A）；在人胃癌细胞中表达高于人胃黏膜细胞（P均0.05，图2B）；miR-596 则相反，即miR-596在胃癌组织中表达低于癌旁组织（图2C）；在人胃癌细胞中表达低于人胃黏膜细胞（P均0.05，图2D）。2.3 LINC00342转染效率的验证转染 LINC00342 过表达质粒和 siRNA 敲低LINC00342 后，PCR 结果显示，pcDNA-LINC00342 组表达量高于pcDNA 组（P0.05，图2E），si-LINC00342组表达量低于si-NC组（P0.05，图2F）。2.4 LINC00342和miR-596对胃癌细胞增殖的影响CCK-8细胞增殖实验显示：在24、48、72 h，pcDNA-LINC00342 组A450nm高于对照组（图3B），si-LINC00342http:/www.j-J South Med Univ,2023,43(10):1761-17701763B组低于对照组（图3A），在48h差异最为明显（P均0.05）；miR-596-inhibitor 组高于对照组（图 3D），miR-596-mimic 组低于对照组（图3C，P均0.05）。LINC00342对于胃癌细胞的增殖能力有促进作用，miR-596 则能抑制胃癌细胞的增殖能力。Edu 细胞增殖实验的结果与CCK-8 实验结果一致（图4，5）。2.5 LINC00342和miR-596对胃癌细胞迁移的影响划痕实验的结果显示，pcDNA-LINC00342 组的划痕愈合速度快于对照组（P0.01），si-LINC00342 组的愈合速度则慢于对照组（P0.001）。说明LINC00342对于胃癌细胞的横向迁移能力具有促进作用，miR-596-inhibitor 组的划痕愈合速度比对照组快（P0.01），miR-596-mimic 组的愈合速度比对照组慢（P0.01），miR-596能够抑制胃癌细胞的横向迁移能力（图6）。2.6 LINC00342 和miR-596 对胃癌细胞侵袭能力的影响Transwell侵袭实验结果显示，pcDNA-LINC00342组穿过上室的胃癌细胞数量要高于对照组（P0.001），si-LINC00342组则低于对照组（P0.001）。此结果说明LINC00342 具有促进胃癌细胞纵向侵袭能力的功能；同样的，miR-596-inhibitor 组穿过上室的胃癌细胞数量高于对照组（P0.01），miR-596-mimic 组穿膜细胞数量低于对照组（P0.001），miR-596 对于胃癌细胞纵向侵袭能力具有抑制作用（图7）。2.7 细胞周期实验pcDNA-LINC00342 组及 miR-596-inhibitor 组相较于其阴性对照组，G0/G1期均显著下降，S 期均明显增加；si-LINC00342 组及 miR-596-mimic 组相较于其AGSE13911GSE54129图1 研究对象的选择Fig.1 Selection of the candidate lncRNAs.A:Venn diagram showing that the intersection of the two datasets yields 8differentially expressed lncRNAs.B:Using Kaplan-Meier Plotter,7 lncRNAs were queried(LINC00849 was not queried)withP0.01asthescreeningcondition.J South Med Univ,2023,43(10):1761-1770http:/www.j-1764D*0123Cultrue time(d)A450 nm1.81.61.41.21.00.80.60.40.20.0inhibitor-NCmiR-596-inhibitorB*0123Cultrue time(d)A450 nm1.61.41.21.00.80.60.40.20.0pcDNApcDNA-LINC00342C*0123Cultrue time(d)A450 nm1.41.21.00.80.60.40.20.0mimic-NCmiR-596-mimicAA450 nm0.90.80.70.60.50.40.30.20.10.00123Cultrue time(d)*si-NCsi-LINC00342图2 LINC00342及miR-596在胃癌组织及胃癌细胞中的表达情况Fig.2 Expression of LINC00342 and miR-596 in gastric cancer tissues and cells.A,C:Expression of LINC00342 and miR-596 inGC tissues and normal tissues(n=29,P0.05 vs Normal).B,D:Expression of LINC00342 in human gastric cancer cell linesAGS,MGC-803,BGC-823,SGC-7901 and HGC-27 and human gastric mucosal GES-1 cells(*P0.05,*P0.01,*P0.001 vs GES-1).E,F:Efficiency of LINC00342 overexpression and knockdown detected by qRT-PCR in BGC-823 and MGC-803 cells(*P0.05,*P0.01,*P0.001vsNormal).图3 LINC00342和miR-596对胃癌细胞增殖的影响Fig.3 Effects of LINC00342 and miR-596 overexpression or knockdown on proliferation of gastric cancer cells.A,B:CCK-8 assay for assessing proliferation ability of MGC-803 and BGC-823 cells after knockdown and overexpression ofLINC00342(*P0.05,*P0.01 vs NC or pcDNA).C,D:CCK-8 assay for assessing proliferation ability of MGC-803andBGC-823cellsafteroverexpressionandknockdownofmiR-596(*P0.05,*P0.01,*P0.001vsNC).GES-1MGC-803BGC-823SGC-7901HGC-27AGS*Relative expression of miR-5961.11.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10pcDNApcDNA-LINC00342-1pcDNA-LINC00342-2pcDNA-LINC00342-3Relative expression ofLncRNALINC00342140120100806040200*Relative expression of LncRNALINC003423210NormalCancerRelative expression of LncRNALINC00342121086420GES-1MGC-803BGC-823SGC-7901HGC-27AGS*Relative expression of miR-5963210NormalCancer*Relative expression ofLncRNALINC00342si-NCsi-NC-LINC00342-1si-NC-LINC00342-2si-NC-LINC00342-32.01.51.00.50DABCEFhttp:/www.j-J South Med Univ,2023,43(10):1761-17701765图4 LINC00342对胃癌细胞增殖的影响Fig.4 Effects of LINC00342 overexpressionor knockdown on proliferation of gastriccancer cells(Original magnification:100,Edu staining).A,C:Edu cell proliferationassay of MGC-803 cells after LINC00342knockdown(*P0.01).B,D:Educellproliferation assay of BGC-823 cells afterLINC00342overexpression(*P0.01).si-LINC00342si-NCMGC-803EduDAPIMergepcDNA-LINC00342pcDNABGC-823EduDAPIMergesi-NCsi-LINC00342DNAsynthesis(%Edu incorporation)6050403020100*DNAsynthesis(%Edu incorporation)6050403020100pcDNApcDNA-LINC00342MGC-803BGC-823CDABmiR-596-mimicmimic-NCMGC-803EduDAPIMergemiR-596-inhibitorInhibitor-NCBGC-823EduDAPIMergemimic-NCmiR-596-mimicDNAsynthesis(%Edu incorporation)6050403020100*DNAsynthesis(%Edu incorporation)706050403020100inhibitor-NCmiR-596-inhibitorMGC-803BGC-823CDAB图5 miR-596对胃癌细胞增殖的影响Fig.5Effects of miR-596 overexpression orknockdown on proliferation of gastric cancercells(Edu staining,100).A,C:Edu cellproliferation assay of MGC-803 cells after miR-596 overexpression(*P0.01).B,D:Edu cellproliferation assay of MGC-823 cells after miR-596knockdown.J South Med Univ,2023,43(10):1761-1770http:/www.j-1766阴性对照组，G0/G1期均显著增加，S 期均明显下降，说明 LINC00342 能促进胃癌细胞周期向S期分裂的进程，miR-596 则阻止胃癌细胞周期抑制向S期进展（P0.01，图8）。2.8 LINC00342与miR-596能够特异性结合miR-596 mimic可以显著降低LINC00342 WT质粒的相对荧光素酶活性（P=0.0067），但对于突变体的双荧光素酶活性没有显著影响（图9）。3 讨论随着人类基因组计划的完成以及众多肿瘤数据库被建立，利用生物信息学技术筛查肿瘤潜在的诊疗靶点已成为当代医学重要的分支。早期胃癌患者多无特异的临床症状，多数患者确诊时已处于中晚期 22,23，胃癌诊断时的临床病理分期往往决定着胃癌患者的预后情况 24,25。目前临床上广泛使用血清胃蛋白酶原（PG）、癌胚抗原（CEA）和碳水化合物抗原 19-9（CA19-9）等相关图.6 LINC00342和miR-596对胃癌细胞迁移的影响Fig.6 Effects of LINC00342 and miR-596 overexpression or knockdown on migration of gastric cancer cells(Original magnification:40).A,C:Wound healing assay of MGC-803 and BGC-823 cells after LINC00342knockdown and overexpression(*P0.01,*P0.001).B,D:Wound healing assay of BGC-823 and MGC-803cellsaftermiR-596knockdownandoverexpression(*P0.01).si-NCsi-LINC00342pcDNApcDNA-LINC003420 h48 h0 h48 hBGC-823MGC-803BGC-823MGC-803mimic-NCmiR-596-mimicinhibitor-NCmiR-596-inhibitorsi-NCsi-LINC00342pcDNApcDNA-LINC00342Healing rate(%)80706050403020100*CHealing rate(%)80706050403020100mimic-NCmiR-596inhibitor-NCmiR-596-mimic-inhibitorBDAhttp:/www.j-J South Med Univ,2023,43(10):1761-17701767肿瘤标志物来进行胃癌的筛查，这种方法虽然无创，但其敏感性和特异度较差 26。因此，如何找到一种无创、高灵敏度、成本低的生物标志物来提高早期胃癌的诊断率，正是现在多数临床研究者所关注的课题。如前所述，LINC00342是一种新发现的lncRNA，在非小细胞肺癌、婴儿血管瘤、结肠腺癌中发挥致癌作用 11-16，通过查询其它肿瘤数据库后，我们有理由相信其在胃癌中也发挥着致癌的作用，因此，本课题组最终选择LINC00342作为研究对象。为了验证数据库的预测，课题组通过qRT-PCR证明了LINC00342在胃癌组织的表达较癌旁组织增高，此外，与正常胃黏膜细胞株相比，在胃癌细胞中，LINC00342的表达也升髙，此结果与数据库预测一致，这意味着LINC00342对胃癌的发生发展可能也起到调控的作用。分别在两个胃癌细胞系进行一系列细胞功能试验后，我们发现，过表达LINC00342 能促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，能促进细胞周期向着S期发展；敲低LINC00342会抑制这些能力，miR-596在胃癌细胞中则发挥着相反的作用。然而，不同于传统的中心法则，lncRNA不编码或很少编码蛋白质，其发挥作用的分子基础往往是作为miRNA海绵在转录后水平影响靶标表达 14,27,28，即与其他分子竞争性结合miRNA上的某些位点来调节相应分子的表达水平来发挥作用 29,30。为明确LINC00342与miR-596二者之间是否具有调控关系，本课题组通过完成两者之间的双荧光素酶结合实验，证明了LINC00342和miR-596之间存在特异性结合关系，此项发现尚属首次。结合其它实验结果，我们认为LINC00342可以通过调控miR-596促进胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭。本研究也存在不足之处：（1）在胃癌中，LINC00342及miR-596的上下游是否存在其他的调控机制尚需进一步研究；（2）未来是否能找到有效的作用靶点、能否真正在胃癌的诊断及治疗中产生作用，这还需要我们进一步的探索。综上所述，本研究结果显示LINC00342在胃癌组织及细胞中表达高于癌旁组织及正常胃黏膜细胞，图7 LINC00342和miR-596对胃癌细胞侵袭能力的影响Fig.7 Effects of LINC00342 and miR-596 knockdown and overexpression on invasiveness of gastric cancer cells(Crystal violet staining,200).A,C:Transwell invasion assay of MGC-803 and BGC-823 cells after LINC00342knockdown and overexpression(*P0.001).B,D:Transwell invasion assay of the cells after miR-596 knockdownandoverexpression(*P0.01,*P0.001).C500450400350300250200150100500Number of mirgrating cells*si-NCsi-LINC00342pcDNApcDNA-LINC00342DNumber of mirgrating cells300250200150100500*mimic-NCmiR-596 inhibitor-NC miR-596-mimic-inhibitorsi-NCsi-LINC00342mimic-NCmiR-596-mimicBGC-823MGC-803pcDNApcDNA-LINC00342inhibitor-NCmiR-596-inhibitorBGC-823MGC-803ABJ South Med Univ,2023,43(10):1761-1770http:/www.j-1768miR-596则相反；LINC00342 能促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，且减少处于G0/G1期的细胞比率，miR-596则发挥着相反的作用；最后，LINC00342和miR-596能特异性结合。因此，课题组认为本研究为LINC00342将来是否能作为胃癌筛查、预防、治疗中新的靶点提供了依据。图8 LINC00342和miR-596对胃癌细胞周期的影响.Fig.8 EffectsofLINC00342andmiR-596knockdownandoverexpressionongastriccancercellcycle.A,C:FlowcytometryofMGC-803 and BGC-823 cells after LINC00342 knockdown and overexpression(*P0.01,*P0.001).B,D:Flow cytometry of the cellsaftermiR-596knockdownandoverexpression(*P0.01,*P0.001).图9 LINC00342与miR-596能够特异性结合Fig.9 Specific binding between LINC00342 and miR-596.A:Binding sites of LINC00342 and miR-596 predictedby online software DIANA.B:Luciferase reporter assay for confirming the binding between LINC00342 andmiR-596(P=0.0067).*P0.001.LINC00342 WT+miR-596-NCLINC00342 WT+miR-596-mimicLINC00342 WUT+miR-596-NCLINC00342 WUT+miR-596-mimicRelative luciferase activity1.41.21.00.80.60.40.20*ABCountCount1.5K1.0K5000CountCountCountCountCou