HP-PRRSV对4种消毒剂的敏感性试验.pdf

中国兽医杂志():对 种消毒剂的敏感性试验杨慧莹 刘 稳 张丽杰 高云航 徐凤宇(吉林农业大学动物医学院 吉林 长春 农安县永安乡综合服务中心 吉林 长春)摘要:为了研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒()毒株对不同消毒剂的敏感性本试验选取浓戊二醛、聚维酮碘、复方新洁尔灭和过硫酸氢钾复合粉 种消毒剂依照 年版消毒技术规范分别采用悬液滴定法、中和剂鉴定试验和细胞培养法在不同浓度和温度下检测消毒剂作用、和 后 的滴度以及 对消毒剂的敏感性 结果显示 种消毒剂按照使用说明要求配制浓度在 和 环境下与病毒作用 后均可被彻底灭活 结果表明 毒株对所选消毒剂均有较高敏感性关键词:消毒剂 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒()敏感性 灭活效果中图分类号:.文献标志码:文章编号:()():().“”.:():收稿日期:基金 项 目:吉 林 省 科 技 发 展 计 划 项 目()国家现代农业产业技术体系建设专项()作者简介:杨慧莹()女硕士生研究方向为动物疾病预防与传染病控制:刘稳()男硕士生研究方向为动物疫病防控及环境控制:注:刘稳与杨慧莹对本文具有同等贡献通信作者:徐凤宇:猪繁殖与呼吸综合征()可导致怀孕母猪早产、流产、产死胎或木乃伊胎仔猪和育成猪出现呼吸道症状且死亡率较高 我国于 年末发现该病随后传播到全国 年我国南方地区暴发“高热病”主要特征为高热、高发病率和高死亡率最终确诊为高致病性猪繁殖与呼吸综合征()使国内养猪业遭受重创 针对 的防控目前主流做法为疫苗防控国内市场虽能购买到不同类型 相关疫苗但防控效果始终不够理想且猪繁殖与呼吸综合征病毒()为单股正链 病毒易发生变异疫苗使用不当会增加患 风险给防控工作带来巨大困难 在疫病防控过程中切断传播途径至关重要 消毒剂可以杀灭病原体切断传播途径阻止、控制传染病发生 目前国内市场所售针对养殖行业的消毒剂种类繁多产品质量参差不齐 因此本试验以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒()的临床分离株 为试验毒株选取目前国内市场主流消毒剂探究 对消毒剂的敏感性以期为 防控提供参考数据和技术支撑 材料与方法 试验材料 毒株和细胞临床分离株 为本实研 究 论 文 卷验室从临床 患病猪的肺脏分离对其、基因序列进行遗传变异分析 毒株与以 毒株、毒株为代表的 亲缘关系较近故鉴定为 冰箱保存非洲绿猴胚胎肾细胞()由吉林农业大学马红霞老师馈赠 主要试剂 浓戊二醛(含量为/)、聚维酮碘(含量为 /)、过硫酸氢钾复合粉(有效氯含量不低于 活性氧含量质量分数为)和复方新洁尔灭(苯扎溴铵含量为 /)均购自上海源叶生物科技有限公司牛血清白蛋白()、硫代硫酸钠和卵磷脂均购自国药集团甘氨酸购自 公司吐温购自 公司 培养基购自北京普利莱基因技术有限公司北美特级 胎牛血清购自北京沃比森科技有限公司 消毒剂均用标准硬水稀释(去离子水中含 无水氯化钙和 六水氯化镁)试验方法 病毒悬液制备和滴度测定 从 冰箱里取出 冻存液接种于已长满单层(密度为 )的 细胞 置于 、培养箱内培养 每 观察细胞待出现细胞病变效应()时收获病毒反复冻融 次先 /离心 再 /离心 取上清作为病毒悬液冻存备用 对收集的上清按照 的悬液滴定法测定半数组织培养感染剂量()中和剂鉴定试验为测定消毒剂对 的作用效果以及中和剂和中和剂与消毒剂产生的中和产物是否会对病毒滴度造成后续影响以 为试验毒株分别选用 种消毒剂及对应的中和剂进行中和剂鉴定试验参照参考文献 确定消毒剂对应中和剂:浓戊二醛对应中和剂为含 /甘氨酸的磷酸盐缓冲液()聚维酮碘对应中和剂为含 /硫代硫酸钠的 /吐温 过硫酸氢钾复合粉中和剂为含/硫代硫酸钠的 复方新洁尔灭消毒液对应中和剂为含/卵磷脂的 /吐温试验分为 个组:第 组消毒剂 病毒悬液表示消毒剂对病毒有杀灭作用第 组(消毒剂 病毒悬液)中和剂表示消毒剂被中和后对病毒无残留灭活作用第 组中和剂 病毒悬液表示中和剂对病毒无影响第 组(消毒剂 中和剂)病毒悬液表示消毒剂的药效被中和病毒不会被杀灭第 组稀释剂 病毒悬液表示选择病毒可供试验使用即为阳性对照组第 组稀释液 中和剂表示中和剂未受病毒污染即为阴性对照组参照 年版消毒技术规范规定的悬液定量试验要求进行病毒滴度测定为进一步探究消毒剂对 致 细胞出现 的保护作用以及中和剂和中和产物对消毒剂灭活病毒在活体细胞中是否仍造成影响分别将中和剂、消毒剂和中和产物接种于已长满单层(密度为 )的 细胞观察 试验分组:对照组分别为:硬水对照:培养基对照:对照中和剂组分别为:含 /甘氨酸的:含 /硫代硫酸钠的 /吐温:含 /硫代硫酸钠的:含 /卵磷脂的 /吐温 消毒剂组分别为:浓戊二醛:聚维酮碘:过硫酸氢钾复合粉:复方新洁尔灭中和产物组分别为中和剂与其对应作用的消毒剂:病毒对消毒剂的敏感性试验 采用细胞培养法分别选择 和 环境条件下进行敏感性试验 试验在水浴锅中进行 试验在恒温加样台中进行 参照消毒剂说明书使用浓度范围分别选择最大和最小稀释浓度进行稀释并保存备用 取 病毒悬液与 有机干扰物质()在 恒温水浴 加入 消毒液混匀并开始计时分别作用、和 后取 混合液加至 中和剂中作用 后取出 进行 测定 以灭菌 代替消毒液其他条件不变作为阳性对照以 培养基代替消毒剂和病毒悬液其他条件不变作为阴性对照 试验与 试验步骤一致但所有试剂使用前均在 冰箱预冷 所有试验重复 次取平均值 按公式()计算病毒灭活对数绝对值病毒灭活对数绝对值 ()式中 为阳性对照(病毒)为消毒剂 结果 病毒滴度测定根据 法计算 毒株的病毒效价为 /中和剂鉴定试验 从表 可以看出各消毒剂第 组病毒无滴度或滴度较低说明消毒剂已灭活大部分病毒第 组病毒滴度比第 组高但低于第 期杨慧莹等:对 种消毒剂的敏感性试验、组说明消毒剂可以灭活病毒但在被中和剂中和后对病毒没有后续灭活作用第、组的病毒生长量较为接近且组间误差小于 各滴度符合消毒技术规范要求说明各中和剂、中和剂与消毒剂所形成的中和产物对病毒滴度和宿主细胞生长无影响 结果表明第 组和第 组中的病毒滴度变低为消毒剂单独作用不受中和剂及中和后产生的中和产物影响且中和剂可以有效中和消毒剂 即含 /甘氨酸的 可有效中和戊二醛含 /卵磷脂的 /吐温 可有效中和新洁尔灭含 /硫代硫酸钠的 /吐温 可有效中和聚维酮碘含 /硫代硫酸钠的 可有效中过硫酸氢钾复合粉细胞试验结果如图 所示各对照组(:硬水表 中和剂、消毒剂和中和产物对病毒滴度的影响 消毒剂名称 病毒灭活对数绝对值()组 组 组 组 组 组浓戊二醛 复方新洁尔灭 聚维酮碘 过硫酸氢钾复合粉 图 中和剂、消毒剂和中和产物对 细胞生长的影响()():硬水对照:培养基对照:对照:含/甘氨酸的 :含/硫代硫酸钠的 /吐温:含/硫代硫酸钠的 :含 /卵磷脂的 /吐温 :浓戊二醛:聚维酮碘:过硫酸氢钾复合粉:复方新洁尔灭 :/:/:/:/:研 究 论 文 卷对照:培养基对照:对照)细胞生长状态良好与对照组相比中和剂组中各中和剂对细胞的生长状况无影响但在消毒剂组 种消毒剂对细胞的生长均造成影响表现为细胞皱缩变圆、漂浮、数量减少等较明显的 而各中和产物组对细胞的生长状况均无影响与对照组相当 对浓戊二醛的敏感性结果如表 所示 与 倍稀释浓戊二醛消毒液在 和 环境下作用 时病毒灭活对数值大于 达到消毒技术规范中有效灭活的标准表明病毒被有效灭活作用 及以上时病毒灭活对数绝对 值 为 表 明 病 毒 被 完 全 灭 活 与 倍稀释浓戊二醛消毒液在 和 环境下作用 时病毒被有效灭活作用 及以上时病毒被完全灭活表 对浓戊二醛的敏感性 稀释倍数 病毒灭活对数绝对值()对 聚维酮碘的敏感性 结果如表 所示 与 倍稀释的 聚维酮碘在 和 环境下作用 时病毒灭活对数绝对值大于 表明病毒被有效灭活作用 及以上时病毒被完全灭活 与 倍稀释 聚维酮碘在 环境下作用 时病毒被有效灭活作用 及以上时病毒被完全灭活在 环境下 需要与消毒剂作用至少 才可被有效灭活表 对 聚维酮碘的敏感性 稀释倍数 病毒灭活对数绝对值()对复方新洁尔灭的敏感性结果如表 所示 与 倍稀释的复方新洁尔灭在 和 环境下作用 时病毒灭活对数绝对值大于 表明病毒可被有效灭活作用 及以上时病毒可被完全灭活 与 倍稀释的复方新洁尔灭在 环境下作用 时病毒可被有效灭活作用 及以上时病毒可被完全灭活在 环境下 需要与 倍稀释的复方新洁尔灭作用 及以上时病毒可有效且完全被灭活表 对复方新洁尔灭的敏感性 稀释倍数 病毒灭活对数绝对值()期杨慧莹等:对 种消毒剂的敏感性试验 对过硫酸氢钾复合粉的敏感性结果如表 所示 与 倍稀释或 倍稀释过硫酸氢钾复合粉在 和 的环境下作用 时病毒即被有效灭活作用 及以上时病毒被完全灭活表 对过硫酸氢钾复合粉的敏感性 稀释倍数 病毒灭活对数绝对值()讨论目前国内市场所售针对养殖行业的消毒剂种类繁多产品质量参差不齐 为了评估 对不同消毒剂的敏感性 本试验以临床分离株 为试验毒株选取目前国内市场主流消毒剂按照 年版消毒技术规范要求测定其对不同消毒剂的敏感性 在进行消毒剂敏感性试验时可选择灭菌、标准硬水、液体培养基等作为阳性对照中和试剂、培养基等作阴性对照 本试验分别对硬水对照、培养基对照、对照进行比较结果显示细胞状态未见明显差异为了促进细胞生长保证细胞状态良好本试验以灭菌 为阳性对照、培养基为阴性对照测定消毒剂的敏感性戊二醛是养殖场常见的消毒剂由于其对金属无腐蚀性因此可用于圈舍、运输车辆等消毒本试验结果显示 倍和 倍稀释的浓戊二醛在 和 与 作用 病毒即可被有效灭活作用 及以上时病毒被彻底灭活 这与戊二醛消毒剂使用说明书推荐的疫情发生时环境消毒浓度保持一致 此外在作用 及以下时 环境下戊二醛灭活病毒的能力相较于 环境下有所下降但在作用 后两者均可完全灭活病毒表明温度对戊二醛的消毒性能影响相对较小其消毒性能较为稳定聚维酮碘是一种新型碘伏消毒剂主要成分为碘和聚乙烯吡咯烷酮是中效消毒剂依靠 碘化和氧化病原体蛋白使病原体变性或抑制酶活性从而达到杀菌消毒的效果 因其具有广谱、高效、水溶性、有一定清洁作用、对黏膜刺激性低、安全性高、无毒副作用等特点近年来被广泛应用于临床、医药、养殖业等领域 本试验根据推荐使用说明按照疫病发生时的浓度进行配比结果显示聚维酮碘在 和 环境下与病毒作用 即可完全灭活病毒在 环境下 和 倍稀释的聚维酮碘与病毒作用 时消毒效果明显低于 环境表明环境温度可影响聚维酮碘的消毒效果 因此在温度偏低时使用聚维酮碘应适当提高浓度或延长消毒作用时间以便达到更好的消毒效果复方新洁尔灭的主要成分是苯扎溴铵是最常用的表面活性剂之一具有洁净、杀菌等作用 因其具有无色无味、无腐蚀性、刺激性小、毒性低等优点常被养殖场用于通道、办公场所、宿舍、食堂等人员密切接触场所的消毒 本试验结果显示复方新洁尔灭在 倍稀释后与病毒作用 即可达到消毒技术规范的要求即病毒灭活对数绝对值下降 个单位与病毒作用 及以上即可完全灭活病毒而在 倍稀释时需要与病毒作用 及以上才能将病毒有效且完全灭活复方新洁尔灭的杀灭效果随温度上升、浓度增加而有所增强过硫酸氢钾复合粉是一种基于酸性氧化体系的新型过氧化物消毒剂其以过硫酸氢钾复合盐为主要成分辅以氯化钠、表面活性剂等具有广谱、低毒、高效和使用方便等优点是目前畜禽行业最为主流的消毒剂之一 本试验结果显示该消毒剂 和 倍稀释时在 和 环境下与 作用 即可有效灭活病毒作用 即可完全灭活病毒与使用说明书描述一致 在 或 环境下使用该消毒剂其消毒效果基本无差异表明该消毒剂具有较强的稳定性本试验参照 年版消毒技术规范要求以()为试验毒株选取浓戊二醛、聚维酮碘、复合新洁尔灭、过硫酸氢钾复合粉研 究 论 文 卷共 种消毒剂在 和 的预设环境温度条件下均可在一定时间内完全灭活 表明()对养殖场常用的消毒剂有较高的敏感性参考文献:.().():.郭宝清陈章水刘文兴等.从疑似 流产胎儿分离 的研究.中国畜禽传染病():.?.:.().():.:.():.().():.().:.刘梅沈欣悦李建梅等.种常用消毒剂对基因型新城疫病毒的灭活效果.中国兽医杂志():.纪洵敏李爱琼张磊等.常用快速手消毒剂对两种肠道病毒的灭 活 效 果 研 究 .中 国 消 毒 学 杂 志():.罗致茜.猪场消毒剂效 果评 价及细 菌对消 毒剂抗 性研究.贵阳:贵州大学.薄玉霞 .评价化学消毒剂对病毒灭活效果的中和剂选择试验.中国消毒学杂志():.卫生部卫生法制与监督司.消毒技术规范第一分册.北京:中华人民共和国卫生部.南文龙巩明霞邹艳丽等.三类常用消毒剂对非洲猪瘟病毒灭活效果的评价.中国兽药杂志():.任利军.苯扎溴铵碘对畜禽细菌的杀灭效果试验.太谷:山西农业大学.苏裕心李杰张哲等.一种复合碘皮肤黏膜消毒剂对病毒灭活 效 果 研 究 .中 国 消 毒 学 杂 志 ():.王爱玲.四种消毒剂对猪场常见病原微生物的杀灭效果研究.杨陵:西北农林科技大学.朱佳文刘逍叶思齐等.化学消毒剂对非洲猪瘟病毒的作用效果与应用建议.黑龙江畜牧兽医():.周淑棉陶富平张伟超等.过硫酸氢钾复合盐消毒剂、温度和紫外线对伪狂犬病毒灭活效果研究.畜牧与兽医():.