DL-丁胱亚磺酰亚胺导致结肠癌细胞铁死亡的作用研究.pdf

中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023，39（8）：1399-1407杂志网址：http:/DL-丁胱亚磺酰亚胺导致结肠癌细胞铁死亡的作用研究*郑拥，孙玥，辛宝山，罗斌，刘刚，史良会（皖南医学院第一附属医院胃肠外科，安徽 芜湖 241000）摘要 目的：研究DL-丁胱亚磺酰亚胺（DL-BSO）导致结肠癌细胞发生铁死亡的作用机制。方法：（1）采用梯度浓度的DL-BSO干预人结肠癌HCT-116和SW480细胞，CCK-8法检测细胞活力的改变。（2）采用实验浓度的DL-BSO干预2种细胞，分为对照组和实验组，Transwell和划痕实验检测细胞迁移能力，Western blot法检测目的蛋白表达水平。（3）用necrostatin-1（Nec-1）和ferrostatin-1（Fer-1）预处理2种细胞，再用实验浓度的DL-BSO进行干预，分为对照组、DL-BSO组、抑制剂组和DL-BSO联合抑制剂组，CCK-8法检测细胞活力，以铁离子比色法试剂盒检测铁离子浓度，以谷胱甘肽（GSH）试剂盒检测GSH浓度，以Western blot法检测谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和胱氨酸/谷氨酸反向转运体（xCT）表达水平，以脂质过氧化传感器 C11-BODIPY-591荧光显影和流式细胞术检测活性氧（ROS）水平。结果：DL-BSO干预后，HCT-116和SW480细胞活力均显著减弱，DL-BSO的最适浓度和处理时间分别为300 mol/L和36 h。DL-BSO处理使HCT-116和SW480细胞横向及纵向迁移能力均减弱，铁死亡关键蛋白GPX4和xCT表达下调，ROS水平和铁离子浓度升高，GSH浓度降低。DL-BSO的作用不受Nec-1的回调，但受到Fer-1的回调。结论：DL-BSO能通过铁死亡途径导致结肠癌细胞发生死亡，并减弱细胞的侵袭和迁移能力。关键词 DL-丁胱亚磺酰亚胺；结肠癌；铁死亡中图分类号 R735.3+5；R363.2 文献标志码 A doi：10.3969/j.issn.1000-4718.2023.08.007Role of DL-buthionine-(S,R)-sulfoximine in ferroptosis of colon cancer cellsZHENG Yong，SUN Yue，XIN Baoshan，LUO Bin，LIU Gang，SHI Lianghui（Department of Gastrointestinal Surgery，the First Affiliated Hospital of Wannan Medical College，Wuhu 241000，China.E-mail：）ABSTRACT AIM：To investigate the mechanism of DL-buthionine-（S，R）-sulfoximine（DL-BSO）leading to ferroptosis of colon cancer cells.METHODS：（1）Human colon cancer HCT-116 and SW480 cells were treated with different concentrations of DL-BSO，and the cell viability was detected by CCK-8 assay.（2）The cells were treated with DL-BSO at experimental concentration，and divided into control group and DL-BSO group.The cell migration ability was detected by Transwell and scratch assays，and the expression levels of the target proteins were detected by Western blot.（3）The cells were pretreated with necrostatin-1（Nec-1）or ferrostatin-1（Fer-1），intervened with DL-BSO at experimental concentration，and divided into control group，DL-BSO group，inhibitor group and DL-BSO combined inhibitor group.The cell viability was detected by CCK-8 assay，and the iron ion concentration was detected by colorimetry.The gluthione（GSH）level was determined by commercially available kits，and the glutathione peroxidase 4（GPX4）and cystine/glutamate antiporter（xCT）expression levels were detected by Western blot.The level of reactive oxygen species（ROS）was detected by lipid peroxidation sensor C11-BODIPY-591 fluorescence visualization and flow cytometry.RESULTS：After DL-BSO intervention，cell viability was significantly reduced，and the optimal concentration and treatment time of DL-BSO were measured at 300 mol/L and 36 h，respectively.Cell lateral and longitudinal migration ability was also reduced.The expression of GPX4 and xCT，key proteins of ferroptosis，was down-regulated.The ROS level and iron ion concentration were increased，and GSH concentration was decreased.The effects of DL-BSO were counteracted by Fer-1 rather than Nec-1.CONCLUSION：Treatment with DL-BSO causes death of colon cancer cells through the ferroptosis pathway and diminish their invasion and migration ability.KEY WORDS DL-buthionine-（S，R）-sulfoximine；colon cancer；ferroptosis文章编号 1000-4718（2023）08-1399-09 收稿日期 2023-02-16 修回日期 2023-07-04*基金项目 安徽省教育厅自然科学研究计划项目（No.2022AH051241）；皖南医学院中青年科研基金（No.WK2021F07）通讯作者 Tel：[phone]；E-mail：1399结直肠癌（colorectal cancer，CRC）作为一种常见的恶性肿瘤，目前已经跃居世界第三位，大约每年新增180万例左右，死亡人数高达90万例，也是癌症相关死亡的第二大病因1。铁死亡作为新发现的程序性细胞死亡形式之一，主要通过活性氧（reactive oxygen species，ROS）的大量产生与细胞抗氧化体系的失效从而导致细胞发生死亡2。DL-丁胱亚磺酰亚胺 DL-buthionine-（S，R）-sulfoximine，DL-BSO 是近年发现的新型放射增敏物质，它通过影响胱氨酸/谷 氨 酸 反 向 转 运 体（cystine/glutamate antiporter，xCT）而耗竭肿瘤细胞内谷胱甘肽（gluthione，GSH）水平，使得细胞内抗氧化能力大幅降低，从而提高放射线对肿瘤细胞的杀伤力。Berger等3很久以前就发现，BSO作为一种-谷氨酰半胱氨酸合成酶（glutamylcysteine synthetase，-GCS）抑制剂，能够通过几乎耗尽GSH导致结肠癌细胞发生死亡，但其抗肿瘤作用有待进一步研究。本研究根据上述文献进行实验，验证DL-BSO对结肠癌细胞发生作用的机制，及相关铁死亡产物进行分析，进一步确定了DL-BSO的抗肿瘤作用与诱导结肠癌细胞铁死亡有关。材料和方法1细胞人结肠癌细胞系HCT-116和SW480均购于北京协和基础医学院。2主要实验试剂DL-BSO和necrostatin-1（Nec-1）购自MedExpressChem；ferrostatin-1（Fer-1）购自 Selleck；CCK-8 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、ROS检测试剂盒（包含DCFH-DA探针）和铁离子比色法检测试剂盒购自碧云天；谷胱甘肽过氧化物酶 4（glutathione peroxidase 4，GPX4）抗体和 xCT抗体购自 Abcam；羊抗兔抗购自Abclonal；GSH检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；脂质过氧化传感器C11-BODIPY-591购自Thermo Fisher。3主要方法3.1细胞培养及分组待细胞生长至对数期时将细胞消化进行分组：（1）分为对照组（正常培养的细胞）和 DL-BSO 组（以终浓度为 100、200、300、400和500 mol/L的 DL-BSO干预 24、36和 48 h）；（2）分为对照组、DL-BSO组、Fer-1组、Nec-1组、DL-BSO+Fer-1 组和 DL-BSO+Nec-1 组（后 4 组细胞用 5 mol/L Nec-1或 Fer-1预处理 12 h）；（3）分为 DL-BSO 组 以300 mol/L 的 DL-BSO 干预 36 h（Transwell 实验）和48 h（划痕实验）、PBS 组（以等体积的 PBS 进行干预）和对照组；（4）用于 Western blot实验、流式细胞术及荧光显影检测的细胞分为对照组、DL-BSO组、Fer-1组和DL-BSO+Fer-1组。3.2CCK-8 实验将 HCT-116 和 SW480 细胞培养至对数生长期，按照细胞传代方式消化离心至5 mL离心管中，后用1640培养液重悬，取10 L至细胞计数板上计数，以 1105 mL1接种于 96 孔板中，每孔100 L，设置分组同3.1中的（1）和（2），同时设置空白孔（仅等体积培养液），每组设置5个复孔方便数据分析及减少误差，用无菌PBS处理96孔板边缘防止实验孔蒸发。于37、5%CO2培养箱中培养至实验所需时间后，所有孔各加入CCK-8液10 L，轻拍96 孔板四周使其混匀后再次放回培养箱孵育 3 h。孵育结束后用分光光度仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度（A）。细胞相对活力（%）=（A实验孔A空白孔）/（A对照孔A空白孔）100%。3.3Transwell 实验将 HCT-116 和 SW480 细胞分接种到6孔板上并按3.1中的（3）分组。达到处理时间后将各分组细胞用胰酶进行消化后以1 000 r/min离心5 min，用移液枪移除上清，沉淀用无血清培养液重悬，取10 L悬液于细胞计数仪上计数，每组计数细胞为5105 mL1，接种于Transwell小室上室，并用无血清培养液定容至200 L，下室内加入500 L培养液，24 h后观察并收集小室。用棉签擦去上室残留细胞，用PBS缓冲液清洗小室23次。后用4%多聚甲醛液进行固定，20 min后，洗去固定液后用龙胆紫染色20 min，再次用PBS冲洗23次，最后在显微镜下采用随机抽取方式选取5个视野进行拍照，用GraphPad Prism 8.0统计细胞个数并分析。3.4划痕实验将HCT-116和SW480细胞分别接种到6孔板上培养并分组标记，待细胞贴壁并充满60%70%视野后，吸去上清并用200 L的枪头在6孔板中划痕，用 PBS 冲洗 23 遍，用 300 mol/L 的DL-BSO处理标记为DL-BSO组，后用无血清培养液定容至2 mL，另设对照组（只含无血清培养液）。分别在0 h和48 h用倒置相差显微镜对细胞拍照，然后用ImageJ软件对划痕面积进行分析并绘制图表。3.5Western blot 法检测蛋白表达水平用 SDS-PAGE分离蛋白质（每泳道10 g）。然后，将样品转移到聚偏氟乙烯膜上。在室温下用5%的牛奶封闭1 h后，将膜与抗在4 下孵育过夜。用山羊抗兔抗在室温下孵育1 h后，使用ECL试剂盒通过ECL系统观察信号。将相对蛋白水平归一化至GAPDH，用ImageJ软件进行定量。3.6铁离子比色法将细胞接种到24孔板上，DL-1400BSO 干预 36 h 收集细胞，用 2 mL PBS 洗 2 遍，吸出PBS。按照每孔200 L添加裂解液使细胞裂解，并于摇床上裂解2 h后依组收集于离心管中。用试剂盒提供的稀释用液将3 mmol/L的标准品母液稀释为300、150、75、37.5、18.75、9.38和4.69 mol/L，称为标准品，并设置 0 浓度对照反应管。将缓冲液与4.5%高锰酸钾按 1 1 混匀，称为混液 A。使用 1.5 mL离心管，设置空白对照管（100 L稀释液+100 L混液 A）、标准品管（100 L混液 A+100 L标准品）和样品管（100 L混液A+100 L样品）。混匀，60 孵育1 h。冷却至室温，于离心管中加入30 L铁离子检测剂，混匀，室温孵育30 min，每管取200 L放于96孔板，设置每组5个孔以消除误差，于550 nm检测吸光度，绘制标准曲线并计算铁离子浓度。3.7GSH 的检测将细胞接种到 24 孔板上，DL-BSO 干预 36 h 收集细胞，用 2 mL PBS 洗 2 遍，使用PBS重悬细胞备用；使用超声破碎仪冰上裂解细胞；待细胞充分裂解后取悬液100 L，与试剂一混匀，以3 500 r/min离心10 min，取上清液用于实验；设置空白对照管（100 L试剂一+100 L试剂二+25 L试剂三）、标准管（100 L GSH标准品+100 L试剂二+25 L试剂三）和测定管（100 L样品+100 L试剂二+25 L试剂三）。将各管充分混匀后，室温静置5 min，用酶标仪测定405 nm处各管的吸光度；根据说明书提供的公式计算每管中GSH含量，并处理数据绘制图表，注意重复实验消除误差。3.8脂质过氧化传感器 C11-BODIPY-591 荧光显影将细胞接种到6孔板上，DL-BSO干预36 h收集细胞，用移液枪吸去6孔板上层液体，后将细胞用2 mL PBS洗2遍；使用培养液稀释并配制每孔2 mol/L C11-BODIPY-591染料，在避光条件下分别加入至6孔板内，用锡纸包裹 6孔板于 37 培养箱内孵育30 min；时间完成后吸去 6孔板内染料，将细胞用 2 mL PBS洗2遍；于荧光显微镜下观察细胞显影情况，分析每组细胞绿光荧光强度。使用软件绘制图表。3.9流式细胞术将细胞接种到 12孔板上，药物干预 36 h 收集细胞，用移液枪吸去 12 孔板上层液体，将细胞用2 mL PBS洗2遍；后用胰酶消化细胞并离心，按照 1 2 000 使用无血清培养液稀释 DCFH-DA，用适量稀释好的DCFH-DA重悬细胞；于37 培养箱内孵育20 min，期间每5 min混匀一次；待孵育完成后使用无血清培养液反复清洗细胞3次，后使用无血清培养液定容至2 mL。注意设置空白对照及全程避光实验。最后用流式细胞仪检测细胞内ROS并绘制图表。4 统计学处理使用GraphPad Prism软件进行统计学分析。数据以均数标准差（meanSD）表示。两组间均数比较使用t检验，多组间均数比较使用单因素方差分析及LSD-t检验。以P0.05）；在各时点DL-BSO组细胞活力与对照组相比差异有统计学意义（P0.05）；经Fer-1预处理，细胞活力下调受到显著抑制，相对DL-BSO组的差异有统计学意义（P0.05），见图1。2DL-BSO对HCT-116和SW480细胞迁移能力的影响划痕实验结果显示，对照组和PBS组细胞明显向划痕处迁移，划痕愈合明显，DL-BSO组细胞划痕距离未见明显减少，与对照组相比差异有统计学意义（P0.05），见图2。Transwell 实验结果显示，与对照组相比，DL-BSO 组细胞很少迁移到 Transwell 下室（P0.05），见图3。3DL-BSO对铁死亡关键蛋白的影响DL-BSO 干预后 2 种细胞中铁死亡关键蛋白GPX4和xCT的表达水平与对照组相比均显著下调（P0.05）；经过铁死亡抑制剂Fer-1预处理后，再行药物DL-BSO干预，GPX4和xCT表达水平的下调明显受到抑制，不仅DL-BSO组和DL-BSO+Fer-1组2种细胞中GPX4和xCT表达水平与对照组相比差异均有 统 计 学 意 义（P0.05），并 且 DL-BSO+Fer-1 组HCT-116细胞 GPX4和 xCT 表达水平及 SW480细胞GPX4表达水平与DL-BSO组相比差异均有统计学意义（P0.05），可能与实验误差有关，见图4。4DL-BSO对铁死亡相关产物铁离子和GSH水平的影响与对照组相比，DL-BSO组铁离子水平显著升高（P0.05）；经过铁死亡抑制剂Fer-1预处理后，再行药物 DL-BSO 干预，铁离子水平升高有所减缓，DL-1401Figure 1.Effects of DL-BSO and Fer-1/Nec-1 on the viability of colon cancer HCT-116（A，C，E and G）and SW480（B，D，F and H）cells were detected by CCK-8 assay.A and B：effect of DL-BSO at different concentrations on the cell viability；C and D：effect of DL-BSO for different time on the cell viability；E and F：effects of Fer-1 pretreatment for 12 h and DL-BSO treatment on the cell viability；G and H：effects of Nec-1 pretreatment for 12 h and DL-BSO treatment on the cell viability.MeanSD.n=5.*P0.05 vs control（Con）or 0 h group；#P0.05 vs DL-BSO group.图1DL-BSO和Fer-1/Nec-1对结肠癌细胞活力的影响Figure 2.Effects of DL-BSO on the lateral migration ability of colon cancer HCT-116（A）and SW480（B）cells were detected by wound healing assay（scale bar=50 m）.MeanSD.n=5.*P0.05 vs control（Con）group.图2DL-BSO对结肠癌细胞横向迁移能力的影响1402BSO+Fer-1 组与 DL-BSO 组相比差异有统计学意义（P0.05），见图5AC。与对照组相比，DL-BSO 组 GSH 水平显著降低（P0.05）；经过Fer-1预处理后，再行药物DL-BSO干预，GSH水平降低有所减缓，DL-BSO+Fer-1组与DL-BSO组相比差异有统计学意义（P0.05），见图5D、E。5DL-BSO对细胞内脂质ROS的影响与对照组相比，DL-BSO干预后脂质ROS水平显著升高，即荧光显微镜下C11-BODIPY-591（绿光）荧光强度明显增强；经过Fer-1预处理后，再行药物DL-BSO干预，ROS水平升高程度有所减缓，荧光强度介于DL-BSO和对照组之间，见图6。DCFH-DA探针和流式细胞术结果显示，与对照组相比，DL-BSO 组脂质 ROS 水平显著升高；DL-BSO+Fer-1 组脂质 ROS 水平与 DL-BSO 组相比差异有统计学意义（P0.05），见图7。讨论CRC作为一种常见的恶性肿瘤，是一系列人类疾病（如炎性肠病）最有害的并发症之一，约占炎性肠病相关死亡的15%，占所有癌症死亡率和发病率的9.2%4-5。尽管早期筛查方法和治疗方法得到了迅速发展，但CRC的预后并不令人满意。目前对于CRC的诊断和治疗虽然已经有高速的发展，但CRC患者和转移性疾病患者的5年生存率分别只有48%和10%6。研究证明，CRC的早期诊断可能会显著提高患者的生存率6，而包括患者和医生在内的许多因素可能会导致诊断延迟7。最重要的因素之一可能是由于缺乏足够敏感性和特异性的生物标志物导致显著延长早期症状和最终诊断之间间隔8。此外，用于 CRC 治疗的常用药物，如 FOLFOX、FOLFIRI、CAPOX 和 FOLFOIRI 等方案在化疗的早期阶段是有效的，但这些药物中的一些在重复治疗周期中不可避免地产生耐药性9-10。铁死亡作为新发现的具有可调节性的程序性细胞死亡形式之一2，不同于其他程序性死亡方式最重要的一点是其具有铁依赖性，铁死亡的发生离不开活性铁的超负荷11。铁死亡的发生有赖于细胞内氧化铁的失衡从而导致细胞内脂质过氧化物的堆积，反映在细胞水平表现为线粒体大小的改变和细胞膜的破坏，反映在生物化学水平表现为脂质过氧化物的堆积12。铁死亡受各种因素调节，如GPX4活Figure 3.Effects of DL-BSO on the longitudinal migration ability of colon cancer HCT-116（A）and SW480（B）cells were detected by Transwell assay（scale bar=50 m）.MeanSD.n=5.*P0.05 vs control（Con）group.图3DL-BSO对结肠癌细胞纵向迁移能力的影响1403Figure 4.Effects of DL-BSO（A）and DL-BSO+Fer-1（B）on the expression of ferroptosis key proteins in colon cancer HCT-116 and SW480 cells were detected by Western blot.MeanSD.n=5.*P0.05 vs control（Con）group；#P0.05 vs DL-BSO group.图4DL-BSO和Fer-1对结肠癌细胞铁死亡关键蛋白表达的影响1404Figure 5.Effects of DL-BSO on ferrous ion and glutathione levels in colon cancer HCT-116（B and D）and SW480（C and E）cells.A：the standard curve of ferrous ion concentration detection；B and C：effects of DL-BSO on iron ion level；D and E：effects of DL-BSO on glutathione level.图5DL-BSO和Fer-1对结肠癌细胞铁离子和谷胱甘肽水平的影响Figure 6.Effects of DL-BSO（A and B）and DL-BSO+Fer-1（C and D）on lipid reactive oxygen species levels in colon cancer HCT-116（A and C）and SW480（B and D）cells were detected using lipid peroxidation sensor C11-BODIPY-591（scale bar=20 m）.图6脂质过氧化传感器C11-BODIPY-591检测DL-BSO和Fer-1对结肠癌细胞内脂质活性氧的影响1405性丧失、GSH耗竭、花生四烯酸过氧化、细胞内铁超载等13-15。越来越多的研究表明，通过增加细胞内Fe2+和 ROS 水平、降低抗氧化剂 GSH 水平或灭活CRC细胞中的GPX4来诱导铁死亡可有助于CRC的临床治疗16-17，而抑制铁死亡可能导致肿瘤进展和CRC的治疗耐药性18。因此，调节铁死亡可能是治疗CRC的一种有前途的策略。此外，与铁死亡相关的生物化合物可被用来当做诊断和预后该疾病的生物标志物。铁死亡是疾病治疗中一个新兴的热门话题，其导致具有独特特征的细胞死亡，在许多疾病的治疗中具有相当大的前景，且已被相关研究所证实19-20。DL-BSO是近年来发现的可通过降低肿瘤细胞内GSH水平来降低细胞内抗氧化能力而提高放射线对肿瘤细胞杀伤的新型放射增敏物质，其发挥作用主要是通过抑制-GCS 活性使细胞内 GSH 合成减少，进而间接抑制下游的 GPX43，从而使细胞发生脂质过氧化导致铁死亡的发生。GSH作为机体细胞层面的抗氧化关键物质之一，其通过作为辅助因子辅助GPX4的作用是使氧化脂类被还原为相应的醇类，从而减少脂质过氧化物的堆积，保持细胞膜氧化还原的平衡。当GSH减少甚至发生耗竭时，GPX4活性减弱，氧化反应占主导地位，使细胞膜上氧化还原反应动态平衡被打破，细胞发生死亡。通过使GSH耗竭间接导致GPX4失活的药物有很多，如柳氮磺吡啶、顺铂等。本研究结果证实，DL-BSO 对结肠癌细胞的活力、侵袭及迁移均具有抑制作用，其对结肠癌细胞活力的抑制作用具有剂量依赖性，且受到铁死亡抑制剂Fer-1的回调。结肠癌细胞中ROS的堆积是铁死亡发生的关键，本研究发现，ROS水平与铁死亡关键蛋白GPX4和xCT表达水平呈负相关。初步研究可以推测出DL-BSO具有一定的抗肿瘤作用，其抗肿瘤作用与 ROS-铁死亡的发生有关，且 Fer-1可以拮抗Figure 7.Effects of DL-BSO on lipid reactive oxygen species levels in colon cancer HCT-116（A）and SW480（B）cells were determined by DCFH-DA probe and flow cytometry.图7DCFH-DA探针和流式细胞术检测结肠癌细胞内脂质活性氧水平1406DL-BSO 对结肠癌细胞的毒性作用，并使 GPX4 和xCT表达水平回升。本研究发现DL-BSO对于结肠癌细胞的毒性作用与诱导ROS的产生及促进铁死亡的发生相关。在CCK-8实验中运用坏死性凋亡抑制剂处理后发现，DL-BSO 导致的细胞死亡不受抑制，基本确定 DL-BSO发挥作用不通过坏死性凋亡途径，因此铁死亡途径可确定为DL-BSO抗肿瘤作用的机制之一，也是DL-BSO作为放疗增敏剂发挥重要作用的机制。参考文献1Keum N，Giovannucci E.Global burden of colorectal cancer：emerging trends，risk factors and prevention strategies J.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2019，16（12）：713-732.2Temraz S，Mukherji D，Alameddine R，et al.Methods of overcoming treatment resistance in colorectal cancerJ.Crit Rev Oncol Hematol，2014，89（2）：217-230.3Berger SJ，Gosky D，Zborowska E，et al.Sensitive enzymatic cycling assay for glutathione：measurements of glutathione content and its modulation by buthionine sulfoximine in vivo and in vitro in human colon cancer J.Cancer Res，1994，54（15）：4077-4083.4Averboukh F，Ziv Y，Kariv Y，et al.Colorectal carcinoma in inflammatory bowel disease：a comparison between Crohns and ulcerative colitis J.Colorectal Dis，2011，13（11）：1230-1235.5Bray F，Ferlay J，Soerjomataram I，et al.Global cancer statistics 2018：GLOBOCAN estimates 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