KeratinoSensTM方法在化妆品皮肤致敏性评价中的研究进展.pdf

Technique express科技广场36Vol.46 No.10 Oct.2023摘 要：阐述了一种目前已被OECD收录的体外皮肤致敏替代方法KeratinoSens及其实验原理；重点综述KeratinoSens方法在预测化妆品中过敏原，如香料、植物提取物、金属纳米材料等对皮肤致敏性的发展现状，讨论了该方法对化妆品中过敏原与刺激物组合时致敏阈值的评估，以及对其与其他测试方法的整合策略展开论述，同时还对该方法在动物替代的发展进行展望，为后续选择合适的体外检测方法用于化妆品原料和成品的致敏评价提供参考。关键词：化妆品；过敏原；皮肤致敏性；体外替代方法；KeratinoSens方法中图分类号：TQ658 文献标识码：A 文章编号：1006-7264(2023)10-036-07DOI：10.3969/j.issn.1006-7264.2023.10.008收稿日期：2023-05-04作者简介：刘楠楠（1994-），安徽人，工程师。目前市场上销售的化妆品种类繁多，令人应接不暇。然而随着化妆品日益广泛使用，消费者一方面享受着化妆品所带来的福音，另一方面其产生的不良反应现象也随之增多。据统计，在化妆品皮肤病中，约70%80%为化妆品接触性皮炎。这其中有些是由于化妆品中添加的某些成分是皮肤细胞过敏原，从而引发皮肤过敏。因此，为了减少化妆品过敏事件的发生，各国监管部门纷纷出台了相应的法律法规，对化妆品中的过敏原使用量作出明确规定；对企业而言，在产品开发过程中，检测化妆品中致敏成分对保障化妆品的安全性意义重大。化妆品中，动物试验和人体试验是最常用的检测皮肤致敏反应的方法；其中动物实验主要包括豚鼠最大剂量法和Buehler封闭斑贴试验法。但基于伦理的考虑及“3R”原则的推行和提倡，2002年OECD为减少动物使用量，提出将小鼠局部淋巴结检测（LLNA）作为一种豚鼠试验优化方法1。之后研究人员经过数10年的不懈努力，2012年OECD基于有害结局通路（AOP）出版了一份描述皮肤致敏体外测试方法的文件2。该概念将皮肤致敏过程分为4个关键事件（KE），并针对每个关键事件开发了一系列对应的体外测试方法。目前被OECD收录作为标准方法的有直接多肽反应试验（DPRA）、ARE-Nrf2荧光素酶检测方法（KeratinoSens）和人体细胞系活化试验（h-CLAT）等，以期应对国际监管对禁止使用动物的要求，同时满足在安全性测试中主动选择使用非动物试验的企业需求。KeratinoSens方法作为首个获得欧盟ECVAM声明和经合组织测试指南认可的皮肤致敏性体外细胞试验3，目前已被纳入OECD TG 442D测试指南4。且该方法已得到ECVAM声明的认可，可用于评估化学品的安全性5。本文通过介绍KeratinoSens方法，总结了该方法在筛选用于化妆品致敏成分的发展现状，并对该方法在检测化妆品过敏原中存在的局限性进行阐述，同时对方法的发展进行展望，为后续KeratinoSens方法在化妆品致敏成分检测的进一步应用提供理论指导。1 KeratinoSens方法KeratinoSens实验方法是皮肤致敏AOP的第2个关键事KeratinoSensTM方法在化妆品皮肤致敏性评价中的研究进展刘楠楠，宋肖洁，霍 刚（欧诗漫生物股份有限公司，浙江 湖州 313200）Technique express科技广场37第46卷2023年第10期件，即表皮角化细胞的活化。使用HaCaT人角质形成细胞衍生的永生化贴壁细胞系，稳定转染含有荧光素酶报告基因的可选质粒，该基因受人类AKR1C2基因的ARE的控制，且在皮肤致敏剂刺激下上调，从而构建KeratinoSens细胞系作为检测系统。其实验原理如图1所示。图1 Keratinosens检测皮肤致敏剂的作用机制Fig.1 Mechanism of Keratinosensinthedetectionofskinsensitizers当角质细胞受到皮肤致敏剂刺激后，可作用于传感器蛋白Keap1(一种细胞内亲电子和氧化应激的感受器蛋白），与Keap1蛋白的活性半胱氨酸残基进行共价修饰，促使Keap1蛋白与转录因子Nrf2解体，随后Nrf2转位进入细胞核并在核内聚集，然后与启动子序列中的抗氧化反应元件ARE（Antioxidant Response Elements）相结合，从而启动Nrf2-ARE信号通路，并促使下游II相解毒酶和抗氧化酶基因的表达6。该实验方法参考OECD TG442D指南4，将KeratinoSens细胞接种于96 孔板培养24 h，然后移除培养基，使用含不同浓度受试物的新鲜培养基处理48 h后，进行荧光素酶活性和细胞毒性检测，最后根据荧光素酶诱导倍数和细胞存活率，预测待测物质的致敏潜力。由于大多数化学皮肤致敏剂都是通过与皮肤蛋白中的亲核中心发生亲电反应，从而诱导该途径，因此Keap1-Nrf2-ARE信号通路被作为识别潜在皮肤致敏剂的最相关途径之一7。2 KeratinoSens方法的应用不同于其他现有的体外检测方法，据相关文献报道，目前KeratinoSens方法不仅在预测化妆品单一化学品方面有着广泛应用，包括纳米材料、某些过敏原等，还可用于评估混合物的皮肤致敏性，如植物提取物等，从而使产品符合国内外一系列化学品的安全法规。2.1对化妆品中过敏原的致敏能力评估在化妆品成分检测中，最易引起化妆品过敏反应的过敏原包括香精香料、防腐剂、染发剂（对苯二胺）等8-10，因此检测该类物质在化妆品中的安全性尤为重要。已有文献报道KeratinoSens方法可用于评估过敏原的致敏潜力。如Cho等11研究表明KeratinoSens方法能够预测被广泛应用于化妆品领域的防腐剂致敏潜力，如羟基苯乙酮、苯氧乙醇等。此外一些过敏原，因其具有光敏作用而被多数国家严格限制其在化妆品中的添加和使用，如大部分香豆素类化合物、抗菌剂、染发剂。光敏作用类似于接触过敏，唯一不同之处在于其半抗原是一种光敏剂，需要紫外线辐射后才能成为光抗原。通常采用动物实验对化学物质的光毒理学特性进行评估12,13，但受监管和伦理方面限制，需要开发一些体外替代方法。有研究报道了KeratinoSens方法在过敏原的光致敏潜力方面的评估。如Tsujita-Inoue等14报道了KeratinoSens方法能够预测UV照射下化妆品中过敏原（6-甲基香豆素、三氯卡班、对苯二胺）的光致敏潜力；且研究发现当检测光致敏原的临界值设置为50%荧光素酶表达诱导时，KeratinoSens方法预测光致敏/光毒性化学物质的准确性和特异性分别为67%和 100%。因此，KeratinoSens方法在检测化妆品中某些过敏原的致敏性方面具有适用性。2.2对化妆品中植物提取物相关的致敏能力评估随着消费者对化妆品功效的要求不断提高，加之“植物”和“天然”产品的普及，目前人们对各种植物或天然提取物兴趣颇深，并将其作为活性成分进行使用。而植物提取物本身相对组分比较复杂，分析鉴别难度大，很容易由于自身提取中带入以及人为添加等原因造成潜在过敏风险增加。因此，出于监管目的以及从为生产商提供充分的风险评估方面考虑，都需要对这些植物提取物可能产生的潜在致敏风险进行安全评估。然而像DPRA方法由于待测物需要以特定的分子量比与合成模型肽混合，因此并不适用于植物提取物的检测。OECD测试指南中指出KeratinoSens方法适用于多成分物质和混合物的测试。先前部分研究为了验证KeratinoSens方法能够检测植物提取物中存在的潜在致敏成分，通过向已知无致敏的植物提取物中添加不同致敏剂模拟本身具有致敏成分的植物提取物的方式来展开研究，即向不含致敏成分的植物提取物中人为添加致敏剂，以此证实KeratinoSens方法在检测植物Nrf2Nrf2MafSOOHHSHKeap 1ARENrf2-target genes1)Covalent modification of Keap 15)GENE ACTIVATION3)Nuclear accumulation of Nrf2 in induced stateElectrophilic skin sensitizers(e.g.Chinnamal)4)Heterodimer of Nrf2 with small Maf binds to ARE sequence2)Dissociation of Nrf2 from modified Keap 1Technique express科技广场38Vol.46 No.10 Oct.2023提取物中致敏成分的应用。如Andres等15报道了KeratinoSens方法可适用于检测植物提取物中 人为地添加或因其成分复杂不可避免而带入的中度致敏剂对皮肤的致敏性；另外通过对加了不同剂量致敏剂的提取物结果，发现该实验对检测植物提取物中具有致敏潜力的微量组分具有一定的敏感性；Gan等16也报道了KeratinoSens方法对植物性化妆品中成分进行皮肤致敏预测，通过将3种已知的致敏剂加入4种无致敏的植物成分中检测其致敏性，研究表明KeratinoSens具有检测植物成分基质中的亲电过敏原的潜力。Taku等17通过对植物提取物中微量致敏成分的检测限（DL）进行研究，证实了KeratinoSens当与其他方法如h-CLAT组合应用时能够有效检测植物提取物中微量组分的皮肤致敏性，且其灵敏性优于LLNA。这些都说明了KeratinoSens方法能够检测植物提取物中混有的中度致敏剂，微量致敏成分以及亲电过敏原的皮肤致敏情况。2.3对化妆品中过敏原与刺激物组合的致敏阈值评估由于化妆品配方的复杂性，许多因素会影响化妆品过敏的发展，包括化妆品成分、成分的使用浓度和条件等。与单一过敏原相比，过敏原与刺激物组合可能会诱导致敏应答增加。一方面过敏原和刺激物都可以直接诱导角质形成细胞释放促进炎症的介质，引发炎症级联反应。另一方面，刺激物通过干扰皮肤屏障，促进过敏原的渗透，加剧接触性皮炎的发展。然而多数化妆品中通常会包含这2种物质。但评估刺激物与过敏原的同时应用时的致敏潜力目前研究却较少。致敏阈值是作为KeratinoSens方法预测致敏能力的判定标准之一。目前有研究表明KeratinoSens可以评估混合物中刺激物与过敏原组合时的致敏阈值。如Rentiis等18报道了KeratinoSens方法可用于评估中轻度过敏原与非细胞毒性的刺激物组合作用下对过敏原致敏阈值的影响，研究发现相比于单一过敏原，加入刺激物组合后会造成致敏阈值的降低，且不同程度的过敏原在刺激物添加后对细胞毒性和致敏阈值的影响不同，如与中度过敏原肉桂醛相比，较弱的过敏原EGDMA，刺激物的添加对细胞毒性和致敏阈值的影响更大，其会造成致敏阈值更为显著的降低。而这一研究结果与基于表皮模型的SENS-IS分析暴露于与刺激物相结合的过敏原相比具有一致性19。此外，在该研究中KeratinoSens方法还指出了过敏原才是混合物中决定反应的主要化合物。因此，KeratinoSens方法能够大大改善化妆品中对所使用的过敏原与刺激物组合的风险评估。2.4对化妆品中金属纳米原料的致敏能力评估随着纳米技术的兴起，纳米材料现已成为化妆品行业的研发热点。在防晒化妆品中，具有纳米级粒径的二氧化钛、氧化锌、氧化铁或氧化铝等因其对紫外线具有良好的屏蔽作用，目前被广泛作为化妆品中的物理性紫外屏蔽剂。除此之外，市场上还出现了含纳米原料或纳米技术的沐浴露、面膜、精华液等化妆品。而另一方面与之相关的安全性问题却呈指数级增长。有相关文献表明金属纳米颗粒可以与蛋白质非共价结合从而影响免疫系统20。此外，一些研究报道了纳米颗粒释放出的游离化学物质可能会诱导皮肤致敏性21,22。先前Park等23报道了使用小鼠局部淋巴结（LLNA-BrdU-ELISA）试验评估纳米氧化钛对皮肤致敏性的诱导潜力。也有研究报道了KeratinoSens方法在预测金属纳米材料致敏性方面的应用。如Kim等24研究表明KeratinoSens方法能够预测金属氧化物纳米颗粒（NPs）的皮肤致敏潜力，除纳米氧化铜外，其余金属氧化物纳米颗粒的预测结果，均与先前研究报道过的金属氧化物NPs结果一致25-27。因此，KeratinoSens方法可作为预测化妆品中金属纳米原料诱导皮肤致敏潜力的一种体外替代方法。综上，KeratinoSens方法在检测化妆品中香料、防腐剂、金属纳米材料等方面，具有预测皮肤致敏性的潜力，同时与其他单一替代方法相比（如DPRA），KeratinoSens方法还适用于混合物致敏能力的预测，如植物提取物中相关的过敏成分的检测；此外，该方法还可以对化妆品中所使用的过敏原与刺激物组合进行风险评估。2.5KeratinoSens方法在化妆品皮肤致敏整合策略中的应用皮肤致敏整合策略和评估方法（IATA）是基于限定的几组体外试验结果（如DPRA，KeratinoSens和h-CLAT等限定方法），并结合大量计算机模型（如QSAR预测、人工神经网络、贝叶斯网络等）综合判断目标化合物的皮肤致敏性。由于与单一替代方法相比，整合策略因涵盖了多个AOP过程，能大大提高物质在敏感性、特异性和准确性方面的预测，因此皮肤致敏AOP及IATA原则都要求体外的评估方法必须结合使用，以对皮肤致敏剂进行更准确的判断。而作为皮肤致敏AOP关键事件中的限定方法之一，KeratinoSens方法可以被应用到整合策略中；目前在纳入OECD 的整合策略中，其中涉及KeratinoSens方法与其他方法协同进行判断的Technique express科技广场39第46卷2023年第10期整合策略主要有以下几种。KeratinoSens方法作为DPRA、树突状细胞激活方法这3个单一方法的一种，被应用到3选2模型中；比如一种3选2模型是如巴斯夫等28,29及OECD TG 497测试指南30中的3选2测试模型，是3种方法以未定义的顺序进行连续测试。若3种实验中有2种预测结果为阳性，则判定该化合物为致敏物；若均为阴性，则判定为非致敏物。而另外一种3选2是如Van等31开发了 一种基于3选2的分级测试策略，即使用KeratinoSens方法或基因签名实验与DPRA优先进行判定，只有当2种实验结果不一致时，再进行h-CLAT实验，最终以h-CLAT实验的结果进行判定。与LLNA试验和人体试验结果相比29，该策略的敏感性和特异性均优于单一替代方法。KeratinoSens与其他2个关键事件的单一方法组合并结合了计算机模型，从而对化合物的致敏性进行评估。如资生堂等32开发的人工神经网络分析模型（ANN-EC3），将KeratinoSens与DPRA、h-CLAT进行组合测试外，同时引入了QSAR、人工神经网络等计算机模型；欧莱雅33,34开发的堆叠元模型（Stacking meta），采用KeratinoSens和DPRA、U-SENS 3种体外测试方法组合，同时还结合了TIMES-SS和Toxtree计算机系统等对数据进行综合分析。KeratinoSens作为一种单一方法与皮肤模型（Sens-Is模型）、h-CLAT模型相结合的整合策略。如Mathilde等35基于皮肤致敏AOP的关键事件1和3建立的一种新的连续测试策略。该策略将KeratinoSens方法作为最终判定，考虑到成分在皮肤中的渗透，该策略将Sens-Is模型作为起点，其次是h-CLAT、KeratinoSens。若Sens-Is结果为阳性，则将其归类为皮肤敏化剂，且不需要进行其他测试。但当结果为阴性时，该成分必须进行h-CLAT再次确认。若上述2次测试结果不一致，再使用KeratinoSens对其进行第3次测试，从而得出最终结论。该方法不仅可以将预测所选成分致敏能力的准确性提高到88%以及假阴性结论的风险降至最低，还能克服溶解性问题并区分刺激物与致敏剂。而且当KeratinoSens方法应用于皮肤整合策略中，还可以解决KeratinoSens方法单一使用时造成的假阳性及假阴性结果。比如在单独使用KeratinoSens方法预测酒石酸、6-甲基香豆素、芹菜素3种物质时结果均为阳性，而当使用整合策略时3种物质预测结果均为阴性，且预测结果与LLNA和人体数据一致11。这可能是由于一些亲电性化学物质不仅能够激活ARE诱导的关键事件2，也能够作用于皮肤致敏AOP中其他关键事件（如树突状细胞的激活等），而整合策略与单一KeratinoSens方法相比涵盖的关键事件更为全面。总之，这些研究均表明KeratinoSens方法运用到整合策略中能进一步突破单一方法的局限性35,36，并提高对获得总体结果的可信度。3方法应用的局限正如前面所述，KeratinoSens方法已在化妆品等众多领域有了广泛的应用，但由于其是单一且基于细胞的方法，因此也存在一定的局限性。皮肤致敏作用机制复杂，目前仅靠单一的体外替代方法无法涵盖致敏的全部环节，因此难以对物质的致敏性进行准确判断。而且在基于细胞的相关测试中，对于不溶于水或DMSO以及无法在溶剂中稳定分散的化学物质都很难被正确评估。这可能是由于受试物无法在最高浓度进行测试，因此对于使用该方法评价获得的阳性结果可被识别为致敏剂，但阴性结果还需要进一步评估。此外对于细胞毒性较高的及对荧光素酶测试产生强烈干扰的化学物质，如植物雌激素等，KeratinoSens方法也无法对其进行正确评价。如Andres以及Kim等15,24研究均表明使用KeratinoSens方法无法对具有高细胞毒性的绿茶提取物、纳米氧化铜的致敏性进行准确预测。这是由于亲电化学物质以外的化学应激源（如刺激性或具有细胞毒性的物质）可能会激活Keap1-Nrf2-ARE通路，从而导致测试结果呈假阳性。另外，OECD TG 442D测试指南指出，能够选择性与赖氨酸残基反应的致敏物会导致结果呈假阴性。并且该方法还受细胞系代谢能力影响，有报道表明KeratinoSens无法识别需要P450激活的前半抗原，因此对一些前半抗原可能会提供阴性预测。4 KeratinoSens相关方法在国内的发展对于KeratinoSens方法最为关键和紧要的一个环节就是KeratinoSens细胞系的获得，为了弥补国内在这一方面的空缺，满足KeratinoSens方法在国内的实际应用和科学研究。在国内各位研究人员不懈努力下，目前国内已经取得一定成果。上海海关技术中心于2019年历经数月，率先完成了商品化KeratinoSens细胞的进口、传代保存、细胞验证以及测试Technique express科技广场40Vol.46 No.10 Oct.2023方法验证等工作，并得到细胞提供方Givaudan公司的认可，成为国内首个完成KeratinoSens方法验证的官方实验室。因此，该细胞系的成功转移，实现了KeratinoSens方法在国内化妆品研发中的应用，并为产品质量控制提供一种优质的检测方法。同时国内科研人员也在努力开发自主构建稳定转染的KeratinoSens细胞系。刘春凤和陈田等37基于ARE-Nrf2荧光素酶方法，成功得到稳转细胞系DSens（一种可以用于KeratinoSens试验的细胞系）。该研究通过构建pGL4.17-AKR1C2-ARE-SV40质粒，转染人类永生化角质细胞系HaCaT，并用G418进行筛选。且验证结果表明该细胞系与商品化的KeratinoSens细胞系具有相同的作用条件，且对OECD测试指南中推荐的10种化学物质的预测与KeratinoSens预测结果一致，并与LLNA的结果相符。之后，陈虹等38使用上述相同的质粒也成功构建了KeratinoSens细胞系，实验结果也证实了该细胞系对测试指南中选取的8种物质（包括3种强致敏物、2种中等致敏物、2种弱致敏物、1种非致敏物）致敏性预测与商品化的KeratinoSens结果一致，且与人类斑贴测试数据相比，预测结果全部正确；并使用该细胞系对临床上致敏报道较多的2种医疗器械的致敏性进行了预测。此外，黄黎珍课题组39采用与KeratinoSens相似的检测方法和接受标准，利用CRISPR/Cas9与同源重组介导的精准基因编辑技术相结合手段，建立了 一种实时精准的HMOX1报告追踪细胞模型。该模型通过评估和比较35种化学物质（包括OECD指导原则推荐的20种标准参考物）的皮肤致敏预测能力，验证了其预测能力不仅达到OECD指导原则的要求，且优于KeratinoSens方法。因此从一定程度上来说，该细胞模型实现了KeratinoSens方法的优化，与KeratinoSens方法相比，具有较好的皮肤致敏预测能力，能够对皮肤致敏反应进行更加准确科学的评估，从而提高化妆品使用的安全性。5展望前面提到KeratinoSens方法是首个被ECVAM认可的基于细胞的体外测试方法，该方法代表了动物试验替代的巨大进步。而且随着对动物福利的考量，消费者对“零残忍”化妆品的需求越来越大，许多化妆品企业开始主动选择在安全测试中使用非动物试验和不含动物源性的成分。于是KeratinoSens方法也由最初的使用动物源成分（如牛血清等）向尝试使用非动物源性成分培养。为响应这一需求，XCellR8团队40开发了一种从一开始就不含动物产品的方法，即使用人类等效物代替细胞培养方法中广泛使用的大量动物源性成分（主要包括胎牛血清和猪胰蛋白酶）。他们首先将KeratinoSens应用于无动物产品条件，并对21种参考物质进行内部验证，包括OECD TG 442D测试指南相关性能标准中列出的参考物质。结果表明修改后的方法与已验证的KeratinoSens方法（VRM）等效，且在准确性（85.7%）、敏感性（84.6%）和特异性（87.5%）方面均具有可比性，满足所有可接受标准。此外，对KeratinoSens测试的无动物产品适应性也被证明了在良好实验室实践（GLP）认证的实验室中，该方法具有2年以上的稳定性和可重复性，完全符合GLP要求。而且从科学角度来看，使用人体试剂，尤其是来自大量供体的人血清，可以更接近于对化学品的“现实生活”反应，因此修改后的方法完全适用于安全评估。这也是KeratinoSens方法在动物替代方法上谋求动物福利的发展。另外，除了在化妆品中，在医疗器械领域KeratinoSens方法也有相关应用，以天然乳胶手套为例，多项研究报道证实了医用天然乳胶手套中含有的水溶性蛋白质可引起机体产生IV型超敏反应41。因此在临床使用前有必要对其潜在的致敏性进行评价。然而针对医疗器械潜在皮肤致敏性的检测，目前医疗器械国家标准GB/T16886.10只推荐了3种动物试验测定方法。目前陈虹等38初步探讨了用KeratinoSens方法检测医用天然乳胶手套和含镍金属的致敏性，一方面通过计算溶剂对照组的变异度以测试细胞株的稳定性，另一方面通过将实验结果和OECD TG 429测试指南中已知的几种非致敏物和致敏物进行对比从而得到KeratinoSens方法对医疗器械致敏性的预测潜力。研究发现在构建的KeratinoSens细胞系满足稳定性要求的情况下，KeratinoSens方法表现出良好的致敏预测性，2种医疗器械产品的KeratinoSens方法结果均呈阴性，因此该项研究一方面显示了KeratinoSens方法在医疗器械致敏性预测上可以有很好的应用，而且还可以为今后KeratinoSens实验方法转化为预测化妆品中重金属的致敏性提供一些参考。同时，国内KeratinoSens方法的落地和相类似功能细胞系的进一步发展也将为KeratinoSens方法在国内的进一Technique express科技广场41第46卷2023年第10期步应用以及打造国内替代的KeratinoSens方法打下基础，从而使该方法在化妆品致敏检测的领域中有更广阔的应用前景。总之，本文通过阐述KeratinoSens方法在化妆品安全评价中的应用进展，希望读者对该方法在皮肤致敏性检测的应用有更深入地认识，也为后续开发可靠的体外化妆品成分皮肤致敏性综合预测方法提供方法支撑。参考文献：1 BASKETTER D A,EVANS P,FIELDER R J,et al.Local lymph node assay validation,conduct and use in practiceJ.Food and Chemical Toxicology,2002,40(5):593-598.2 OECD.The adverse outcome pathway for skin sensitisation initiated by covalent binding to proteins,Part 1:scientific evidence.environmentS.Health and Safety Publications,2012.3 NATSCH A,EMTER R.Nrf2 Activation as a key event triggered by skin sensitisers:the development of the stable keratinosens reporter gene assayJ.Alternatives To Laboratory Animals,2016,44:443-451.4 OECD.Test No.442D:In Vitro skin sensitisation:are nrf2 luciferase test methodS.OECD Publishing,2015.5 ECVAM.EURL ECVAM Recommendation on the KeratinoSens Assay for Skin Sensitisation TestingR.EU:EUAM,2021.6 WAKABAYASHI N,DINKOVA-KOSTOVA A T,HOLTZCLAW W D,et al.Protection against 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