DNA双加氧酶TET家族蛋白1抑制上皮性卵巢癌转移的作用机制研究.pdf

论著【引用本文】段红英张军.双加氧酶 家族蛋白 抑制上皮性卵巢癌转移的作用机制研究.中国医药():.:./.双加氧酶 家族蛋白 抑制上皮性卵巢癌转移的作用机制研究段红英 张军首都医科大学附属北京安贞医院妇产科北京 通信作者:张军:.【摘要】目的 探讨 家族蛋白()在调控上皮性卵巢癌()转移中的作用机制 方法 在 细胞系中瞬时转染 过表达质粒通过 实验检测 细胞迁移能力变化 通过蛋白质免疫印迹检测上皮细胞黏附分子()的表达 通过蛋白质免疫荧光实验检测 上游转录因子连环蛋白的亚细胞定位变化 检测 连环蛋白的上游抑制因子叉头框基因()基因启动子区 和 含量变化 通过染色质免疫共沉淀实验检测 与 基因启动子区域结合情况 利用 组织芯片对 与 连环蛋白进行免疫组织化学染色探讨二者表达的相关性 结果过表达 明显抑制 细胞系 和 的细胞迁移能力且明显抑制 的表达 过表达后促进 连环蛋白的亚细胞定位发生变化其核内聚集明显减少连环蛋白与 基因启动子区域结合亦明显减少 过表达可以促进 的表达进而抑制 连环蛋白进入细胞核发挥转录因子作用 当 表达被敲低后连环蛋白的细胞核内分布明显增加 在浆液性卵巢腺癌组织样本中(/)表达呈阳性 (/)连环蛋白表达呈阳性 与 连环蛋白的表达呈负相关()结论 通过调控/连环蛋白/轴抑制 转移【关键词】上皮性卵巢癌 家族蛋白 连环蛋白 上皮细胞黏附分子 叉头框基因【基金项目】国家自然科学基金()北京市医院管理中心青年人才培养“青苗”计划()【】./.【中图分类号】.【文献标识码】:.【】()().().().(/)(/)().【】中国医药 年 月第 卷第 期 .【】()()卵巢癌是侵袭性最强的妇科恶性肿瘤其中上皮性卵巢癌()是致死率最高的亚型约占卵巢癌病例的 一些关键驱动基因和重要信号通路介导了 的转移和发展 甲基化/去甲基化是重要的表观遗传修饰方式之一在肿瘤的发生发展中发挥重要作用 促进 发生去甲基化的关键蛋白是 家族蛋白 上皮细胞黏附分子()是一种跨膜糖蛋白 研究报道 在大多数人类肿瘤中呈高表达近年来 已被确定为肿瘤起始干细胞的重要标志物 本团队前期研究结果揭示 家族蛋白()在 细胞系中不表达 本研究旨在探讨 在 发展中的作用及相关分子机制以及 对 的调控作用 材料与方法.材料 人 细胞系 和 来源于晚期 患者均购自复旦大学遗传研究所细胞库 细胞培养基、胎牛血清、胰酶和细胞培养用磷酸盐缓冲液()均购自美国 公司 抗 和抗 兔多克隆抗体购自美国 生物有限公司 抗叉头框基因()兔单克隆抗体和抗 连环蛋白()单克隆抗体购自美国 公司 真核表达质粒 和 由上海交通大学裴耀飞博士馈赠 细胞转染试剂购自美国 公司 本研究方案已通过首都医科大学附属北京安贞医院伦理委员会审批().方法.蛋白质免疫印迹检测刮取细胞至 离心管中 /、离心 (离心半径 )弃上清 以冰 洗 次 转/离心(离心半径 )弃上清 加入 倍细胞沉淀体积细胞裂解液吹打混匀 冰浴 /离心 (离心半径 )取上清 法测定蛋白浓度 等量蛋白()经 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离.干扰细胞转染实验小干扰 由上海 生物公司合成 靶基因序列:正向序列为反向序列为 阴性对照序列为 将细胞以 /孔铺在 孔板中将 /小干扰 和 转染试剂按照试剂盒说明书操作加入细胞培养基中 转染后 通过实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质免疫印迹实验验证靶基因敲除效率.细胞迁移实验 所有细胞培养试剂和 小室于 温育待测细胞培养至对数生长期消化细胞用 和无血清培养基先后洗涤 次用无血清培养基悬浮细胞计数调整浓度为 /在下室(孔板底部)加入 含 血清的培养基上室(孔板)加入 细胞悬液继续在孵箱培养 用镊子小心取出小室吸干上室液体移到预先加入约 甲醇的孔中室温固定 取出小室吸干上室固定液移到预先加入约 结晶紫染液的孔中室温染色 清水冲洗浸泡数次取出小室吸去上室液体用湿棉棒擦去上室底部膜表面上的细胞用小镊子小心揭下膜底面朝上晾干移至载玻片上用中性树胶封片保存显微镜下随机取 个视野进行细胞计数统计各视野的细胞总数 每个实验至少重复 次 本研究均以无 过表达为对照组.蛋白质免疫荧光实验细胞种植在预先铺有盖玻片的 孔板上将种植细胞的盖玻片置于多聚甲醛中室温下固定 然后用 牛血清白蛋白室温下封闭处理 加入抗 连环蛋白抗体 孵育过夜 /漂洗 次 细胞中加入异硫氰酸荧光素标记羊抗鼠二抗避光条件下室温孵育 漂洗 次后用 二脒基苯基吲哚避光下染色 最后用 甘油/封片 采用德国卡尔蔡司 共焦显微镜拍摄图像用来观察 连环蛋白的亚细胞分布.基因启动子区中的 和 分析 使用 和 分析试剂盒(美国 公司)检测 基因启动子区 和 水平 按照试剂盒说明书操作将 的基因组 予以 噬菌体 葡萄糖基转移酶处理 随后将 葡萄糖基化的基因组 用 或 于 处理 或不添加任何酶 处理 (对照组)然后在 条件下灭活处理 用于检测 和 含量的引物:正向序列为 反向序列为 最后进行聚合酶链反应用 琼脂糖凝胶分离产物酶处理组反映 水平酶处理组反映 和 水平 未加酶切割组反映基因启中国医药 年 月第 卷第 期 .动子区 的总量.染色质免疫共沉淀实验细胞种植在 孔板中 甲醛室温下固定 用预冷的 漂洗 次将细胞刮入 预先加入蛋白酶抑制剂的预冷 中 下 离心 随后将细胞(/)重悬于十二烷基硫酸钠裂解缓冲液(十二烷基硫酸钠/乙二胺四乙酸和/三羟基氨基甲烷 值)裂解 将细胞裂解液进行超声处理(冰上操作)超声处理结束后取 作为阳性对照 细胞溶解产物被用于免疫沉淀反应即与 抗 连环蛋白抗体或 抗 抗体 孵育过夜 免疫球蛋白 作为阴性对照 抗体蛋白 复合物用 珠子沉淀下来 对 珠子进行漂洗、洗脱使用 纯化试剂盒进行 纯化(最后加入 溶液溶解)对纯化的 进行聚合酶链反应 染色质免疫共沉淀实验引物序列:正向序列为 反向序列为 引物正向序列为 反向序列为.组织标本和免疫组织化学染色卵巢癌组织芯片购自美国 公司(:/./)该组织芯片来自于 例浆液性卵巢癌患者的卵巢组织(公司官网提供了患者年龄、病理分级和临床分期相关数据但未提供获取标本的具体日期信息)常规脱蜡:二甲苯、二甲苯脱蜡各 梯度乙醇水化:、各 蒸馏水、各洗 次 /次阻断内源性过氧化物酶活性:过氧化氢置于室温湿盒中 抗原修复:值 的柠檬酸缓冲液 水浴 洗 次/次封闭:牛血清白蛋白 羊血清室温封闭 一抗反应:牛血清白蛋白以 稀释抗 单抗正常小鼠免疫球蛋白(稀释)作阴性对照 过夜 洗 次/次滴加二抗室温下反应 洗 次/次二氨基联苯胺显色:二氨基联苯胺显色 显微镜下观察显色强度适时终止自来水冲洗苏木精复染 盐酸乙醇分色 自来水冲洗返蓝梯度乙醇脱水二甲苯透明 次各 通风橱中风干后中性树脂封片 结果判定标准:以肿瘤细胞内出现棕黄色颗粒着色判断为阳性细胞内无棕黄色颗粒着色为阴性.统计学方法采用 统计软件分析数据 计数资料以倍数或例()表示采用 检验进行统计学分析 为差异有统计学意义 结果.对 细胞迁移及 表达的影响 和 细胞不表达 蛋白 瞬时转染 质粒后 和 的细胞迁移被明显抑制 见图 过表达后 表达被明显抑制在 细胞中过表达后 的相对表达量仅为对照组(无 过表达)的 在 细胞中过表达后 的相对表达量仅为对照组(无 过表达)的 (均 )图 外源性过表达 家族蛋白 对上皮性卵巢癌细胞系细胞迁移的影响(结晶紫染色)、为 细胞、为 细胞、为对照组无 家族蛋白 过表达、为 家族蛋白 过表达.外源性过表达 抑制 连环蛋白向细胞核内聚集 在 和 细胞中连环蛋白聚集在细胞核内 当过表达 后连环蛋白广泛地分布在 和 的细胞质中其核内聚集被明显抑制 染色质免疫共沉淀实验结果显示与对照组(无 过表达)相比 过表达可导致 连环蛋白与 启动子区域结合减少 ().外源性过表达 对 表达的影响在 细胞中 过表达组的 表达量是对照组(无 过表达)的 倍()启动子区域 岛 含量为对照组的 倍()在 细胞中 过表达组的 表达量是对照组(无 过表达)的 倍()启动子区域 岛 含量为对照组的 倍()、细胞中 启动子区域 岛 含量未见明显变化 此外染色质免疫共沉淀中国医药 年 月第 卷第 期 .实验结果揭示 过表达后其结合到 启动子区域 岛的能力为对照组(无 过表达)的 倍().对 对 连环蛋白亚细胞定位的影响通过实时荧光定量聚合酶链反应验证 敲低效率平均达 ()蛋白质免疫印迹验证 敲低效率平均达 ()敲低 后几乎完全逆转了 过表达后 中 连环蛋白的细胞核聚集减少连环蛋白重新聚集在细胞核内发挥作用.中 和 连环蛋白表达的相关性在包含 例浆液性卵巢癌样本的卵巢癌组织微阵列()中通过免疫组织化学染色方法检测了 和 连环蛋白的表达结果显示(/)表达呈阳性 (/)连环蛋白表达呈阳性 表达与 连环蛋白表达呈负相关()见图 图 人浆液性卵巢癌组织样本中 家族蛋白 与 连环蛋白表达代表图(免疫组织化学染色)、为 家族蛋白、为 连环蛋白 讨论越来越多的证据表明 甲基化状态异常与癌症患者的肿瘤进展和存活有关 家族蛋白可以催化 从 状态转化为 并最终促使其发生去甲基化 有研究支持 在乳腺癌、结肠癌、肾细胞癌和肝癌中的肿瘤抑制功能 在癌症基因组图谱数据库中搜索 在卵巢癌组织中的表达情况数据显示 例 患者 水平与预后呈负相关 本研究结果与之并不一致分析认为癌症基因组图谱数据库提供的是 在卵巢癌组织样本中的 表达数据而本研究是通过免疫组织化学染色检测了 蛋白的表达 另外诸如种族差异等因素也可能导致结果的不一致 在基因表达综合数据库中基因表达谱芯片数据()提示 个卵巢癌细胞系中 和 的 水平极低而 水平较高 在 数据库中发现 在正常卵巢组织中高表达在 中不表达(:/.)正常卵巢组织和 中未检测到 表达 而 在正常卵巢组织中的表达极低在 中的表达却极高 目前认为浆液性卵巢癌起源自输卵管上皮发生恶性转化 数据库(.)中的相关数据显示正常输卵管上皮中、和 水平和蛋白水平均为中等水平 基于以上信息推测 可能作为肿瘤抑制因子在抑制卵巢癌发生发展中发挥一定的作用 等报道随着小鼠卵巢表面上皮细胞从肿瘤前的非恶性状态转变为恶性/侵袭性状态时 的表达显著下调 通过检索基因表达综合和 数据库发现与正常卵巢组织相比卵巢癌细胞中 蛋白水平极低 本团队前期研究揭示 细胞中无 蛋白的表达 这提示 的表达缺失很可能是促使 发展的重要因素之一 作为癌基因能够破坏 连环蛋白和 肌动蛋白之间的连接进而使得细胞间的黏附松散 此外 与 的联系干扰了 介导的同型细胞之间的黏附进而促进细胞运动、增殖、生存、肿瘤发生和转移/连环蛋白信号通路的异常调节与结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌等肿瘤的发生密切相关 是 家族成员之一作为/连环蛋白信号通路的抑制剂阻断了该途径的激活并下调了该途径中多种下游靶基因如、和金属蛋白酶 由于 基因启动子中存在 岛 也可以通过 甲基化和去甲基化来调节本研究结果显示过表达 可以抑制 细胞迁移 其机制为 可以与 的启动子区域结合增加该区域 含量最终使其 岛发生去甲基化从而促进 转录使其蛋白表达增加 作为/连环蛋白信号通路的主要拮抗因子阻碍了 连环蛋白进入细胞核内发挥转录因子作用进而下调靶致癌基因 表达而 被认为是诱导许多类型癌症转移的重要蛋白本团队前期研究结果表明 在早期 组织样本中的表达高于中晚期 组织样本表明中国医药 年 月第 卷第 期 .蛋白水平与卵巢癌患者的临床分期呈负相关 本研究发现 细胞系不表达 然而 组织中却仍表达 这一现象可能是由于所选 组织样本多数为癌症早期患者而细胞系均来源于晚期癌症患者将来需要更大样本量的卵巢癌组织样本来明确 的表达情况综上外源性过表达 通过调控 /连环蛋白/轴抑制肿瘤的恶性行为 参与表观遗传调控目前围绕 仍有许多问题需要阐明 例如 的靶基因正逐步被研究清楚但在肿瘤细胞中 表达缺失的机制目前仍不十分清楚需要进一步研究 考虑到/连环蛋白/轴在卵巢癌中所发挥的作用表达水平和 含量也许可以作为富有前景的卵巢癌诊断、治疗和预后评估指标利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突参考文献 .():.:./.:.:.:./.():.:./.():.:./.():.:./.:.():.:././.():.:./.:.():.:./.():.:./.:.():.:./.():.:./.:.():.:./.():.:././.():.:./.程东东李彩和郭建忠.临床预测模型在脑胶质瘤疾病中应用的研究进展.中国医药():.:./.():.:./.:.:./.():.:./.():.:././.():.:./.():.:./.().():.:./.():.:././.:.:./.():.:./.(收稿:)(本文编辑:王云飞)中国医药 年 月第 卷第 期 .