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He染色介绍
苏木精 — 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ) ，简称HE染色法 ，石蜡切片技术里常用的染色法之一 。苏木精染液为碱性 ，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色 ；伊红为酸性染料 ，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色 。
染色分类
易于被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性( basophilia )和嗜酸性( acidophilia ) 。
组织内构成蛋白质的氨基酸种类很多，它们有不同的等电点。在普通染色法中，染色液的酸碱度为pH6左右，细胞内的酸性物质如细胞核的染色质、腺细胞和神经细胞内的粗面内质网及透明软骨基质等均被碱性染料染色，这些物质称为嗜碱性。而细胞质中的其它蛋白质如红细胞中的血红蛋白、嗜酸粒细胞的颗粒及胶原纤维和肌纤维等被酸性染料染色，这些物质称为嗜酸型。如果改变染色液的酸碱度，pH值升高时，则原来被酸性染料染色的物质可变为嗜碱性；pH值降低时，原来被碱性染料染色的物质则可变为嗜酸性。所以说染色液的pH值可以影响染色的反应。
DNA两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。伊红是细胞浆的良好染料。
由于组织或细胞的不同成分对苏木精的亲和力不同及染色性质不一样。经苏木精染色后，细胞核及钙盐粘液等呈蓝色，可用盐酸酒精分化和弱碱性溶液显蓝，如处理适宜，可使细胞核着清楚的深蓝色，胞浆等其它成分脱色。再利用胞浆染料伊红染胞浆，使胞浆的各种不同成分又呈现出深浅不同的粉红色。故各种组织或细胞成分与病变的一般形态结构特点均可显示出来。
染色结果
细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。
着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变。例如，很多细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。
常规HE染色步骤
（1）二甲苯（Ⅰ） 5-10 min
(2) 二甲苯（Ⅱ） 5-10 min
(3) 95%乙醇（Ⅰ） 1-3 min
（4）95%乙醇（Ⅱ） 1-3 min
（5）80%乙醇 1 min
（6）蒸馏水 1 min
（7）苏木精液染色 5-15 min
(8 ) 流水稍洗去苏木精液 1-3 s
(9) 1%盐酸乙醇 1-3 s
(10) 稍水洗 10-30 s
(11)促蓝液返蓝 10-30 s
(12) 流水冲洗 10-15 min
（13）蒸馏水过洗 1-2 s
(14) 0.5%曙红液染色 1-3 min
(15) 蒸馏水稍洗 1-2 s
(16) 80%乙醇稍洗 1-2 s
(17) 95%乙醇（Ⅰ） 3-5min
(18) 95%乙醇（Ⅱ） 3-5 min
(19) 无水乙醇 5-10 min
(20) 无水乙醇 5-10 min
(21) 二甲苯（Ⅰ） 3-5 min
(22) 二甲苯（Ⅱ） 2-5 min
(23) 二甲苯（Ⅲ） 3-5 min
(24) 中性树胶封固
结果：细胞浆红色，细胞核蓝紫色。
一、操作方法及步骤：
①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。
②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。
③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。
二、冰冻切片时的注意事项：
①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。
②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。
③放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。
④组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。
⑤当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。
⑥用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。
三、冰冻切片的快速染色方法：
① 切片固定30秒－1分钟。
② 水洗。
③ 染苏木素3－5分钟。
④ 分化。
⑤ 于碱水中返蓝20秒。
⑥ 伊红染色10－20秒。
⑦ 脱水，透明，中性树胶封固。
冰冻组织1－2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述。
常规方法：
（1）冰冻切片固定 10～30 s
（2）稍水洗 1～2 s
（3）苏木精液染色（60℃） 30～60 s
（4）流水洗去苏木精液 5～10 s
（5）1%盐酸乙醇 1～3 s
（6）稍水洗 1～2 s
（7）促蓝液返蓝 5～10 s
（8）流水冲洗 15～30 s
（9）0.5%曙红液染色 30～60 s
（10）蒸馏水稍洗 1～2 s
（11）80%乙醇 1～2 s
（12）95%乙醇 1～2 s
（13）无水乙醇 1～2 s
（14）石炭酸二甲苯 2～3 s
（15）二甲苯（Ⅰ） 2～3 s
（16）二甲苯（Ⅱ） 2～3 s
（17）中性树胶封固。
注：第（14）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇，染色结果为：细胞核蓝色、胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。
封片 切片染色后封片常用中性树胶，酸性的树胶可使胞核褪色，如树胶放置时间过长，因氧化而变酸。中性树胶可用二甲苯稀释。树胶过浓，封片时容易导致气泡；过稀，封片时易使胶外溢，影响美观，也会出现由于二甲苯挥发后缺胶的现象。
在整个染色过程中不让切片干涸：切片完全干涸，会使组织收缩和出现裂痕即出现所谓“龟裂”现象。也会使部分细胞核透明不良，看起来像黑色的细胞核，即形成“黑核”。
一、HE染液的配制：
1、 Harris苏木素： 称取 苏木素精 1g
一氧化汞 0.5g硫酸铝钾 20g量取 无水乙醇 10ml蒸馏水 200ml
苏木素溶于无水乙醇，钾明矾溶于蒸馏水，二者混合后煮沸，离火，加入氧化汞，用玻棒搅拌，试剂变为深紫色，立即移入冷水快速冷却，静置一夜，过滤，棕色小磨口试剂瓶密封保存。使用前加入5%冰乙酸4ml（或冰乙酸3滴）。
2、0.5%伊红(水溶性)： 称取 伊红 0.5g
量取 95%乙醇 25ml
蒸馏水 75ml
先取少量蒸馏水加入伊红，用玻棒将伊红碾碎并搅溶，再加入全部蒸馏水，完全溶解后，再加入乙醇，最后加入冰乙酸1滴。白色小磨口试剂瓶密封保存。
3、1%盐酸水溶液：
盐酸 3ml
蒸馏水 297ml
混匀，白色试剂瓶保存。
4、中性树胶封片剂：
往125ml棕色滴瓶中倒入中性树胶若干，加入二甲苯适量用吸管调匀，有一定粘稠度即可。
试剂 : 二甲苯 1瓶 Harris苏木素染液
无水乙醇 2瓶 1%盐酸水溶液
95%乙醇 2瓶 0.5%伊红(水溶性)染液
中性树胶封片剂
二、染色步骤
1、 电吹风吹片或烤片，至溶蜡；
2、 入二甲苯（I）中脱蜡5分钟，用吸水纸吸干液体；
3、 入二甲苯（II）中脱蜡10分钟（切片透明），用吸水纸吸干液体；
4、 入100%乙醇（I）5分钟，用吸水纸吸干液体；
5、 入100%乙醇（II）5分钟，用吸水纸吸干液体；
6、 入95%乙醇3分钟；
7、 入流水2分钟，用吸水纸吸干水分；
8、 Harris苏木素 染色 4~8分钟；
9、 自来水稍洗；
10、1%盐酸水溶液分化5~10秒（切片由蓝变红）；
11、自来水洗返蓝15~30分钟；
12、0.5%伊红(水溶性)染色30秒~1分
13、95%乙醇（I）脱水5分钟，用吸水纸吸干液体；
14、95%乙醇（II）5分钟，用吸水纸吸干液体；
15、入100%乙醇（I）5分钟，用吸水纸吸干液体；
16、入100%乙醇（II）2分钟，用吸水纸吸干液体；
17、入二甲苯（I）中透明2--3分钟，用吸水纸吸干液体；
18、入二甲苯（II）中透明5分钟；
19、中性树胶封片。
20、镜下观察结果：细胞核深蓝色，胞浆及纤维组织呈深浅不等的红色。
三、注意事项
1、苏木素染色时间应根据染液的新鲜或陈旧、及着色力决定。
2、盐酸分化要恰当，分化不足，会核、浆共染，分化过度会造成核染色过浅。
3、水洗蓝化时间应充分，以防褪色。
4、封片后，玻片应及时贴上标签并写上编号。
常规制片（H.E）染色程序 ZT
一、HE染液的配制：
1、 Harris苏木素： 称取 苏木素精 1g
一氧化汞 0.5g
硫酸铝钾 20g
量取 无水乙醇 10ml
蒸馏水 200ml
苏木素溶于无水乙醇，钾明矾溶于蒸馏水，二者混合后煮沸，离火，加入氧化汞，用玻棒搅拌，试剂变为深紫色，立即移入冷水快速冷却，静置一夜，过滤，棕色小磨口试剂瓶密封保存。使用前加入5%冰乙酸4ml（或冰乙酸3滴）。
2、0.5%伊红(水溶性)： 称取 伊红 0.5g
量取 95%乙醇 25ml
蒸馏水 75ml
先取少量蒸馏水加入伊红，用玻棒将伊红碾碎并搅溶，再加入全部蒸馏水，完全溶解后，再加入乙醇，最后加入冰乙酸1滴。白色小磨口试剂瓶密封保存。
3、1%盐酸水溶液：盐酸 3ml蒸馏水 297ml 混匀，白色试剂瓶保存。
4、中性树胶封片剂：
往125ml棕色滴瓶中倒入中性树胶若干，加入二甲苯适量
用吸管调匀，有一定粘稠度即可。
试剂 二甲苯 1瓶 Harris苏木素染液
无水乙醇 2瓶 1%盐酸水溶液
95%乙醇 2瓶 0.5%伊红(水溶性)染液
中性树胶封片剂
二、染色步骤
1、 电吹风吹片或烤片，至溶蜡；2、 入二甲苯（I）中脱蜡5分钟，用吸水纸吸干液体；
3、 入二甲苯（II）中脱蜡10分钟（切片透明），用吸水纸吸干液体；
4、 入100%乙醇（I）5分钟，用吸水纸吸干液体；5、 入100%乙醇（II）5分钟，用吸水纸吸干液体；
6、 入95%乙醇3分钟； 7、 入流水2分钟，用吸水纸吸干水分；
8、 Harris苏木素 染色 4~8分钟； 9、 自来水稍洗；
10、1%盐酸水溶液分化5~10秒（切片由蓝变红）；11、自来水洗返蓝15~30分钟；
12、0.5%伊红(水溶性)染色30秒~1分 13、95%乙醇（I）脱水5分钟，用吸水纸吸干液体；
14、95%乙醇（II）5分钟，用吸水纸吸干液体； 15、入100%乙醇（I）5分钟，用吸水纸吸干液体；
16、入100%乙醇（II）2分钟，用吸水纸吸干液体；17、入二甲苯（I）中透明2--3分钟，用吸水纸吸干液体；18、入二甲苯（II）中透明5分钟；
19、中性树胶封片。20、镜下观察结果：细胞核深蓝色，胞浆及纤维组织呈深浅不等的红色。
三、注意事项
1、苏木素染色时间应根据染液的新鲜或陈旧、及着色力决定。
2、盐酸分化要恰当，分化不足，会核、浆共染，分化过度会造成核染色过浅。
3、水洗蓝化时间应充分，以防褪色。4、封片后，玻片应及时贴上标签并写上编号。
石蜡组织切片的HE染色
1．取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片。
2．切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。
3．苏木素染色5min，自来水冲洗。 4．盐酸乙醇分化30s（提插数下）。
5．自来水浸泡15min或温水（约50℃）5min。 6．置伊红液2min。
7．常规脱水，透明，封片：95％乙醇（I）min→95％乙醇（Ⅱ）1min→100％乙醇（I）1min→100％乙醇（Ⅱ）1min→二甲苯石碳酸（3：1）1min→二甲苯（I）1min→二甲苯（Ⅱ）1min→中性树脂封固。
第四节 包 埋
包埋，就是将已经经过固定，脱水，透明，浸蜡的组织块从最后的蜡浴取出置入充满熔融石蜡的包埋框内，包埋成块，使组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却，这个程序称为包埋。包埋剂凝固后，进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。
一．石蜡包埋法
石蜡包埋法是制作光学显微镜切片的常规方法，它有许多优点，操作简易便于掌握，可进行连续切片，包埋后的组织可以长期保存。
包埋的方法有自动包埋机包埋和手工包埋两种。手工包埋的步骤如下：
1.组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。
2.准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。
3.迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。
4.待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有一层透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。
5.蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切，准备制成切片或储藏备用。
二．石蜡包埋的注意事项
1.作为包埋组织使用的石蜡不仅由于气候的不同需要加以选择，而且与组织的硬度也有密切关系，过硬的组织最好用硬度较高的石蜡包埋，反之，软组织则应以硬度较低的石蜡包埋。其熔点一般要求再60。C左右。
2.包埋用石蜡加温不可过高，以保持其不凝固为度，温度过高容易将组织烫坏，使得组织变硬，变脆，并发生卷曲，收缩变形而不利于切片，甚至影响诊断。另外注意埋蜡的温度和组织本身的温度，两者是否合适，温度不一致常可造成组织与周围石蜡脱裂的现象，而达不到包埋的作用。
3.包埋用石蜡应掌握用量，以组织全部包埋完毕，石蜡也恰好用完为宜。
4.包埋应注意组织病变面放在下面，并尽可能使组织放平，在不损伤组织的情况下可用镊子轻压。
5.囊壁和消化道等组织包埋时更应注意组织方位，应将组织块直立拉平，不要卷曲。
6.相同组织如包埋于一个蜡块时，除包平外，还要注意方向的一致，以利切片。
7.多块组织和碎组织包埋于一个蜡块内时，组织的排列一定要密挤靠拢，以求成直线或方块行，这样有利于切片。
8.石蜡包埋后，不宜冷凝过慢，特别是室温较高时，石蜡凝固后应立即投入冷水中加速冷却可增加石蜡密度，韧性和硬度。但冷凝过速也会因为内外温差过大造成蜡块裂损。
石蜡切片的制作过程主要包括：取材，固定，脱水，透明，透蜡，包埋，切片，贴片，染色，透明，封藏等步骤
●取材和固定： 处死动物后立即切取组织块，并快速投入固定液中。
●脱水和透明：
８０％酒精（min）
９５％酒精Ⅰ（min）
９５％酒精Ⅱ（min）
无水酒精Ⅰ（min）
无水酒精Ⅱ（min）
二甲苯Ⅰ、Ⅱ（min）
<2mm
45-60
45-60
45-60
15-30
2-4mm
60-120
60-120
60-120
30
4-5mm
120-240
120-240
120-240
60
注意事项：1.脱水应彻底，否则材料不能透明，影响石蜡的浸入，致使难以切片。
2.在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。
3.在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。
4.如需过夜，应停留在70%酒精中。
5.使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。
●浸蜡和包埋：
浸蜡：将透明的组织放入蜡杯（Ⅰ）→蜡杯（Ⅱ）→蜡杯（Ⅲ）。浸蜡时间视材料大小而定，一般总的浸蜡时间为２－４小时左右。
包埋：1. 组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。
2.准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。
3.迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。
4.待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。
5.蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切，准备制成切片或储藏备用。
●切片制作：
注意事项： 1.室温过高时，可将修好的蜡块放到冰箱中冷却一定时间。在夏季时可用冰块冷却刀和组织块，减少刀与组织块在过程中产生的热时，使石蜡保持合适的硬度以利于切片。
2.切片经30%的乙醇初展后，再用载玻片捞起蜡带放入展片仪水盒内（一般水温为45℃左右）。待蜡片带中的组织展平后，即可进行分片和捞片。
3. 切片时要及时清洁刀口、除去蜡屑，否则易引起破碎。
●贴片：
待切片在恒温水内充分摊开展平后，将载玻片垂直插入水中以毛面轻靠切片，并用毛笔将切片一边拨于玻片上，随即将玻片直立提起。快！
●烘片与脱蜡：
石蜡切片在90度烘箱内烘半小时
经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5-10min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各级酒精溶液中各3-5min，再放入蒸馏水中3min。
●染色
1.将蒸馏水洗涤后的切片移入Harris苏木精液中５－１０min，使细胞核着色。
2.用自来水洗去切片上残余的染液。
3.将切片放入1%盐酸乙醇液（盐酸1份+70%乙醇100份）中褪色，见切片变红，颜色较浅即可，约数秒至数十秒钟。
4.入１％氨水或自来水浸洗，使之返蓝。
5.在蒸馏水中浸片刻。
6.０.５％伊红酒精溶液中染色２－５min，使细胞质着色。
●脱水和透明：：
切片依次入９５％酒精(Ⅰ)→９５％酒精(Ⅱ)→无水酒精(Ⅰ)→无水酒精(Ⅱ)
→１：１无水酒精、二甲苯→二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ)，各级中停留１－５min。
●封藏：
将切片从二甲苯(Ⅱ)中取出，用纸或布擦去材料周围的二甲苯。在材料中央滴一小滴树胶，然后，用镊子加盖盖玻片。切片封好后，放在切片托盘上待干燥，即可用于观察。
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