miRNA-146调控TLR4_NF-κB通路促进滋养层细胞增殖和迁移.pdf

.1718生殖医学杂志2 0 2 3年11月第32 卷第11期DO1:10.3969/j.issn.1004-3845.2023.11.016miRNA-146 调控TLR4/NF-kB通路促进滋养层细胞增殖和迁移何凤屏1，张咏梅1*，郭义红，陈陆静，郭艳乐2（1.东莞市妇幼保健院，东莞52 30 57 2.粤北人民医院，韶关512 0 99）【摘要】目的探讨miRNA-146是否通过调控Toll样受体4/核因子-cB（T LR4/NF-k B)信号通路促进滋养层细胞HTR-8/SVneo增殖和迁移，以期为不明原因复发性流产(uRSA)的发病机制研究和防治提供参考。方法（1)细胞研究：将转染后的胎盘滋养层细胞HTR-8/SVneo分成miRNA-146抑制剂组、抑制剂对照组、miRNA-146模拟物组、模拟物对照组，检测各组HTR-8/SVneo细胞生长的活力、增殖、调亡、迁移情况，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Westernblot检测各组TLR4、NF-k B、肿瘤坏死因子(TNF-)和白介素-6(IL-6)的mRNA和蛋白相对表达水平。（2)动物研究：建立Dicer酶敲除的uRSA小鼠模型,将正常妊娠小鼠作为对照组，通过qRT-PCR检测胎盘组织的miRNA-146mRNA表达情况，采用免疫组织化学法检测胎盘组织的TLR4、NF-k B、T NF-、I L-6 蛋白表达情况。结果（1)细胞研究：与模拟物对照组比较，miRNA-146模拟物组HTR-8/SVneo细胞克隆形成率、增殖能力及迁移能力显著增加（P0.05），细胞凋亡率显著降低（P0.05）；与抑制剂对照组和miRNA-146模拟物组比较，miRNA-146抑制剂组HTR-8/SVneo细胞克隆形成率、增殖能力及迁移能力显著降低（P0.05），而细胞凋亡率显著增加（P0.05）。与模拟物对照组比较，miRNA-146模拟物组的TLR4、NF-kB、T NF-、I L-6 蛋白和mRNA相对表达量显著降低（P0.05）；与抑制剂对照组和miRNA-146模拟物组比较，miRNA-146抑制剂组的TLR4、NF-k B、T NF-、I L-6 蛋白和mRNA相对表达量显著增加(P0.05）。不同浓度（10 8 0 mol/L)miRNA-146对HTR-8/SVneo细胞生长活力的增长均有显著影响（P0.05),并呈浓度依赖性。（2)动物研究：与对照组比较，uRSA组小鼠胎盘组织中miRNA-146mRNA的相对表达量显著降低（0.32 士0.19）vS.（0.9 6 士0.2 4），t=12.473,P0.05，而TLR4、NF-cB、T NF-、I L-6 的蛋白表达有增高趋势。结论上调miRNA-146的表达具有促进胎盘滋养层细胞的增殖和迁移作用，其机制可能与负性调控TLR4/NF-kB通路相关。miRNA-146有望成为防治uRSA的潜在靶标。【关键词】不明原因复发性流产；微小RNA-146；T o ll样受体4；核因子-B；胎盘滋养层【中图分类号】Q492.6miRNA-146 promotes trophoblast proliferation and migration by regulating TLR4/NF-kB pathwayHE Feng-ping2,ZHANG Yong-meil*,GUO Yi-hong,CHEN Lujing,GUO Yan-le1.Dongguan Maternal and Child Health Hospital,Dongguan 5230572.Yuebei Peoples Hospital,Shaoguan 512099Objective:To investigate whether micro RNA-146(miRNA-146)regulates signaling pathway of Tolllike receptor 4/nuclear factor-B(TLR4/NF-kB)to promote the proliferation and migration of HTR-8/SVneo trophoblast cells,and provide reference for the pathogenesis and prevention of unexplained recurrentspontaneous abortion(uRSA).Methods:(1)The transfected HTR-8/SVneo placental trophoblast cells were divided into the miRNA-146inhibitor group,inhibitor control group,miRNA-146 mimic group and mimic control group.The vitality,【收稿日期】2023-03-21；【修回日期】2 0 2 3-0 5-12【基金项目】广东省基础与应用基础研究基金区域（粤莞）联合基金培育项目（2 0 2 2 A1515140097）【作者简介】何凤屏，女，广东中山人，博士，教授，生殖免疫学专业，（*通讯作者，Email：w a t e r i n g a l i y u n.c o m【文献标识码】A【A b s t r a c t 生殖医学杂志2 0 2 3年11月第32 卷第11期proliferation,apoptosis and migration of HTR-8/SVneo cells in each group were detected.The quantitativereal-time PCR(qRT PCR)and Western blot were used to detect the mRNA and protein expression ofmiRNA-146,TLR4,NF-kB,tumor necrosis factor alpha(TNF-)and interleukin-6(IL-6).(2)The Dicerenzyme knockout uRSA mouse model was established,and the normal pregnant mice was collected as thecontrol group.The miRNA-146 mRNA expression in placental tissue was detected by qRT-PCR.Theprotein expressions of TLR4,NF-kB,TNF-and IL-6 in placental tissue were detected byimmunohistochemical assay.Results:(1)Compared with the mimic control group,the clone formation rate,proliferation ability,andmigration ability of HTR-8/SVneo cells in the miRNA-146 mimic group were significantly increased(P0.05),while apoptosis rate was significantly reduced in the miRNA-146 mimic group(P 0.05).Compared with the inhibitor control group and the miRNA-146 mimic group,the clone formation rate,proliferation ability and migration ability of HTR-8/SVneo cells in the miRNA-146 inhibitor group weresignificantly reduced(P0.05),while the apoptosis rate was significantly increased in the miRNA-146inhibitor group(P0.05).Compared with the mimic control group,the protein and mRNA relativeexpression levels of TLR4,NF-kB,TNF-and IL-6 were significantly reduced in miRNA-146 mimic group(P0.05).Compared with the inhibitor control group and the miRNA-146 mimic group,the protein andmRNA relative expression levels of TLR4,NF-kB,TNF-and IL-6 were significantly increased in miRNA-146inhibitor group(P0.05).Different concentrations(10-80 mol/L)of miRNA-146 significantly affectedthe growth and vitality of HTR-8/SVneo cells(P0.05),and showed a dose-dependent manner.(2)Comparedwith the control group,the relative mRNA expression levels of miRNA-146 in mice placental tissue ofuRSA group were significantly decreased(0.320.19)vs.(0.960.24),t=12.473,P0.05,while therelative protein expression levels of TLR4,NF-sB,TNF-and IL-6 showed an increasing trend.Conclusions:Up-regulation of miRNA-146 expression can promote the proliferation and migration oftrophoblast cells,and the mechanism may be related to negative regulation of TLR4/NF-kB pathway.ThemiRNA-146 might be expected to become a potential indicator for the prevention and treatment of uRSA.Key words:Unexplained recurrent spontaneous abortion;Micro RNA-146;Toll-like receptor 4;Nuclear factor-kB;Placental trophoblast:1719.(JReprod Med 2023,32(11):1718-1725)正常妊娠过程中存在一种特殊的免疫耐受机制，即妊娠的建立和维持依赖于母体免疫系统对半异已胎儿的耐受，母胎免疫耐受受制于母胎界面在免疫调节下炎性反应和耐受的平衡，如果母胎免疫调节机制异常则易引起不明原因复发性流产（Unexplainedrecurrent spontaneous abortion,uRSA)。u RSA 是母胎免疫失衡导致的不良妊娠结局，是体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗难以突破的瓶颈1-3,其严重危害妇女生育功能，已成为临床迫切需要解决的问题4。目前uRSA缺乏诊断的标志物和有效的治疗手段5,因其病因尚不清楚，发病机制也不明确，部分学者认为妊娠早期母胎界面发生的免疫事件极其复杂，uRSA的发生可能与免疫调节因子及免疫代谢相关门。作为一种小的非编码RNA,microRNAs(miRNAs)通过与靶mRNA特异性结合，降解靶向mRNA或抑制其翻译过程，从而参与疾病的发生和发展。同时miRNAs也可以作为免疫调节因子,激活和加强免疫系统的作用，在调控母胎免疫耐受平衡方面具有重要意义1。既往研究表明，miRNAs在胎盘和生殖细胞中均有表达7-8 1。miRNA-146 是研究较为热门的miRNAs家族成员，是第1个被发现对免疫系统有调节作用的miRNA，m iRNA-146 可通过负反馈调节Toll样受体4/核因子-kB(TLR4/NF-kB)信号通路减轻或抑制炎症反应。miRNA-146亦可通过调控靶细胞表面的肿瘤坏死因子-(TNF-)和白介素1受体相关激酶1(Interleukin-1receptor-associated kinase l,IRAK1)作用于 TLR4/NF-kB.1720信号通路调控炎症与免疫反应10 1。基于以上文献报道，本文拟研究miRNA-146对胎盘滋养层细胞增殖和迁移的作用,探讨其对TLR4/NF-kB信号通路和炎症因子的调控机制，为miRNA-146在uRSA中的作用研究提供参考。材料与方法一、实验材料1.细胞和实验动物：滋养层细胞系HTR-8/SVneo购自上海帛科生物公司。SPF级BALB/c雌鼠（40 只)和雄鼠（10 只)购自中山大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（粤）2 0 16-0 0 2 9；SPF级CBA/J雌鼠（40 只）和雄鼠（10 只）购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2014-0004;DBA/2雄鼠（10 只）购自北京维通利华试验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006；以上小鼠均为7 9 周龄、体质量18 22g。所有小鼠均在温度2 0 2 2、相对湿度45%55%、12 h/12 h 昼夜交替的环境下适应性喂养1周再进行下一步试验。动物实验获得中山大学动物实验伦理委员会批准（SYSU-IACUC-020-B1236）。2.主要试剂及设备：胎牛血清(FBS)、RPM I-16 40培养基购自上海帛科生物公司;DMEM培养基购自上海雅吉；引物及探针由广州市锐博生物公司提供；cDNA Synthesis Kit、SYBR G r e e n PC R M a s t e rMixKit、A p p lie d Bio s y s te m s A BI 7 50 0 均购自美国Applied Biosystems 公司;Lipofec-tamine 2000 购自福州奕澜瑞生物公司；RIPA裂解液、0.2 5%的胰蛋白酶、ECL化学发光检测试剂盒购自上海爱必信;BCA蛋白检测试剂盒购自美国赛默飞；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京Biosea;FL流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特；TLR4、NF-k B、白介素6（IL-6）、T NF-鼠抗兔单克隆抗体和辣根过氧化物酶酶标二抗均购自英国Abcam公司；miRNA-146、T LR4、NF-k B、T NF-、I L-6 和内参GAPDH引物及探针由广州市锐博生物有限公司提供;miRNA-146 抑制剂（50 nmol/L）、m iRNA-146抑制剂对照、miRNA-146模拟物（50 nmol/L）和miRNA-146模拟物对照均购自上海生工基因公司。二、实验方法1.HTR-8/SVneo 细胞培养:将 HTR-8/SVneo 培养于含10%灭活FBS、10 0 U/m l青霉素的RPMI-1640培养基中，置于5%CO2、37 和10 0%湿度条件下生殖医学杂志2 0 2 3年11月第32 卷第11期的培养箱培养，稳定传代后收集指数生长期细胞用于进一步的实验。2.miRNA-146转染:将HTR-8/SVneo 消化离心，以合适密度接种到培养板，2 4h后细胞融合到60%7 0%时，按照Lipofec-tamine 2000说明书进行操作，分成miRNA-146抑制剂组、抑制剂对照组、miRNA-146模拟物组、模拟物对照组，分别转染miRNA-146抑制剂（50 nmol/L）、m iRNA-146 抑制剂对照、miRNA-146模拟物（50 nmol/L）、m iRNA-146模拟物对照，5h后换成完全培养基，荧光显微镜观察转染效率。3.HTR-8/SVneo细胞生长活力：采用MTT比色法测定0 mol/L、10 mol/L、2 0 mol/L、40 mol/L和8 0 mol/L miRNA-146对 HTR-8/SVneo 细胞生长活力的影响，将各组HTR-8/SVneo 细胞接种于6 孔板，密度为110 3个细胞/孔，磷酸盐缓冲盐(PBS)冲洗2 次后，10 l MTT溶液稀释为5mg/ml，加到每一孔中。将培养板在3 7 下培养2 4h，然后添加150 l的二甲基亚，置摇床上低速震荡10 min后，使结晶物充分溶解。采用酶联免疫检测仪检测各孔OD490mm的吸光值。4.HTR-8/SVneo细胞增殖和调亡实验：细胞增殖实验：在各组生长期细胞加入0.2 5%的胰蛋白酶，消化后吹打为单个细胞，离心后计数，取110 3个细胞/孔重悬于对应的培养基，接种于细胞培养皿里，于37、5%CO及饱和湿度的细胞培养箱内培养2 4 h，显微镜下观察细胞增殖情况。细胞调亡实验：使用AnnexinV-FITC/PI调亡检测试剂盒进行各组滋养层细胞调亡检测、鉴定和定量滋养凋亡细胞。将各组生长期细胞以110 5个细胞/孔接种于6 孔板中,用冷PBS洗涤处理细胞2 次,并将其重新悬浮在含有10 l膜联蛋白V和5lPI的2 0 0 l结合缓冲液中，将贴壁细胞和漂浮细胞结合，使用FL流式细胞仪测量百分比，以区分凋亡细胞（膜联蛋白V阳性和PI阴性)和坏死细胞（膜联蛋白V和PI 阳性)。5.HTR-8/SVneo细胞迁移实验：在Transwell小室上室加人10 0 l的Matrigel稀释液，室温静置1h。经含10%FBS的液体培养基将各组细胞重悬至密度110/ml,加人Transwell小室上室，下室加50 0 l含FBS的培养基，2 4孔细胞培养板置于37、5%C O 培养箱中培养12 h,用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，移去Transwell,倒置并风干，生殖医学杂志2 0 2 3年11月第32 卷第11期24孔板中加人50 0 l2.5%结晶紫，将小室置于其中，使膜浸没在染料中，37 30 min取出，PBS清洗，倒置显微镜下观察各组细胞迁移情况。6.Westernblot检测：将各组细胞用RIPA裂解液裂解，通过离心提取细胞总蛋白。使用BCA法测定TLR4、NF-k B、I L-6 和 TNF-蛋白浓度，加入5XSDS的蛋白上样缓冲液煮沸进行蛋白质变性处理。按照每孔上样30 g进行SDS-PAGE，将蛋白转移至PVDF膜上，5%BSA进行封闭，摇床放置2 h。T BST 溶液洗涤3次,加入 TLR4、NF-k B、I L-6和TNF-一抗(工作浓度均为1：10 0 0)4孵育过夜。TBST溶液洗涤，加入辣根过氧化物酶标二抗（工作浓度1：30 0 0)室温孵育2 h,TBST溶液洗涤3次。超敏ECL化学发光液试剂盒发光显影，用基因miRNA-146TLR4NF-kBIL-6TNF-GAPDH8.uRSA小鼠模型的建立及分组：根据参考文献11,建立Dicer 酶敲除的uRSA小鼠模型。通过阴道涂片记录所有雌鼠动情周期，于动情前将雌雄小鼠合笼：将CBA/J雌鼠2 0 只与BALB/c雄鼠10只合笼作为对照组，将CBA/J雌鼠2 0 只与DBA/2雄鼠10 只合笼作为uRSA小鼠模型组。于合笼次日观察CBA/J雌鼠阴道分泌物，存在精子则确认妊娠，合笼至所有雌鼠妊娠。阴道分泌物检出精子者计为妊娠第0 天。取各组妊娠雌鼠各4只进行uRSA小鼠模型评价，因雌性小鼠分别敲除Dicer酶，妊娠小鼠多次流产，即成功建立了uRSA的动物模型。:1721Imagequant TL软件分析目的条带与内参条带的光密度比值，计算 TLR4、NF-B、I L-6 和TNF-蛋白相对表达量。剩余细胞冻于一8 0 备用。7.实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测：使用Applied Biosystems ABI7500系统进行qRT-PCR。将各组细胞或胎盘组织进行裂解，提取总RNA,反转录cDNA,反转录反应体系为：95预变性10 min，95变性15s，55退火15s，35个循环。用反转录得到的产物作为模板进行PCR扩增，反应体系为:SYBR Premix Ex Taq10 l,上游引物 0.4 l,下游引物 0.4 l,ROX Reference Dye 0.4 l,DNA模板2.0 l，d H z 0 6.8 l；反应条件：9 510 s，955s，6 0 30 s，40 个循环。以2-C计算mRNA的相对表达量。各目标基因及引物序列见表1。表1目标基因及引物序列引物序列上游:5-CACACAAGTCTCCGCTAT-3下游:5-GTGCGATCCAGTCGCG-3上游:5-CGCTTTCACCTCTGCCTTCACTACAG-3下游:5-ACACTACCACAATAACCTTCCGGCTC-3上游:5-CTGAACCAGGGCATACCTGT-3下游:5-GAGAAGTCCATGTCCGCAAT-3上游:5-GAGAAGGGGGACCAACTCAG-3下游:5-GGTCTGTTGGGAGTGGTATCC-3上游:5-CACACAAGTCTCCGCTAT-3下游:5-GTGCGATCCAGTCGCG-3上游:5-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3下游:5-GGCATGGACTGTGGTGATGAG-3只，于妊娠第7 天安乐处死，无菌环境下取出胎盘组织置人4%多聚甲醛固定，制成石蜡切片，将TLR4、NF-kB、T NF-、I L-6 单克隆抗体作为一抗进行孵育，利用DBA显色试剂盒显色。结果判定：按着色细胞占视野的百分比进行评分，阳性细胞率 7 5%=4分；按着色强度分级进行评分，不着色=0 分、浅黄色=1分、棕黄色=2 分、棕褐色=3分。TLR4和NF-kB蛋白相对表达（着色9.免疫组织化学检测：取各组妊娠雌鼠各16：17 2 2 细胞占视野的百分比X着色强度）：阴性表达（一)2分，弱阳性（十）=34分，中度阳性（十十）=58分，强阳性（十十十）=912 分。三、统计学分析采用SPSS19.0软件进行数据分析。计量资料采用均数土标准差（士s）表示，两组比较采用t检验；计数资料用例或百分率表示；采用Spearman分析小鼠模型miRNA-146水平与TLR4和NF-kB水平相关性。P0.05为差异具有统计学意义。一、miRNA-146对 HTR-8/SVneo 细胞增殖能力的影响与模拟物对照组比较，miRNA-146模拟物组HTR-8/SVneo细胞增殖能力和细胞克隆形成率均显著增加(P0.05）；与抑制剂对照组和miRNA-146模拟物组比较，miRNA-146抑制剂组HTR-8/SVneo细胞增殖能力和细胞克隆形成率均显著降低(PA1.00.80.6F0.40.20C6F420A:miRNA-146对HTR-8/SVneo细胞增殖能力的影响：与模拟物对照组比较，P0.05；与抑制剂对照组和miR-146模拟物组比较，#P0.05;B:miRNA-146对HTR-8/SVneo细胞生长活力的影响：与模拟物对照组比较，*P0.05；与抑制剂对照组和miR-146模拟物组比较，#P0.05；C:m i RNA-146 对HTR-8/SVneo细胞生长活力的影响：与0 mol/L和10mol/L组比较，P0.05；与2 0 mol/L组比较，#P0.05；与40 mol/L组比较，AP0.05;D:miRNA-146对HTR-8/SVneo细胞凋亡的影响：与模拟物对照组比较，*P0.05；与抑制剂对照组和miR-146模拟物组比较，#P0.05。生殖医学杂志2 0 2 3年11月第32 卷第11期0.05)(图 1A,B)。二、miRNA-146对HTR-8/SVneo细胞生长活力的影响比较不同浓度miRNA-146对HTR-8/SVneo细胞生长活力的影响,结果显示：与0 mol/L和10 mol/L处理组比较，2 0 8 0 mol/LmiRNA-146处理的HTR-8/SVneo细胞生长活力显著增加（P0.05);与2 0 mol/L比，40 8 0 mol/LmiRNA-146的HTR-8/SVneo细胞生长活力显著增加（P0.05)；与40 mol/L比,8 0 mol/L miRNA-146的HTR-8/SVneo细胞生长活力显著增加（P0.05）；m i RNA-146结果对HTR-8/SVneo 细胞生长活力的影响呈浓度依赖趋势(图 1C)。三、miRNA-146对HTR-8/SVneo 细胞调亡的影响与模拟物对照组比较，miRNA-146模拟物组HTR-8/SVneo细胞凋亡率显著降低（P0.05）；与抑制剂对照组和miRNA-146模拟物组比较，miRNA-146抑制剂组细胞凋亡率显著增加（P0.05)（图1D)。B模拟物对照组80miR-146模拟物组抑制剂对照组miR-146抑制剂组#0 mol/L miRNA-14610 mol/LmiRNA-14620 mol/LmiRNA-14640 mol/LmiRNA-14680 mol/LmiRNA-146*#*#图1miRNA-146对HTR-8/SVneo细胞活力、生长、增殖以及调亡的影响模拟物对照组miR-146模拟物组抑制剂对照组60miR-146抑制剂组40#200D50403020100模拟物对照组miR-146模拟物组抑制剂对照组miR-146抑制剂组#生殖医学杂志2 0 2 3年11月第32 卷第11期四、miRNA-146 对HTR-8/SVneo 细胞迁移能力的影响与模拟物对照组比较，miRNA-146模拟物组HTR-8/SVneo 细胞迁移能力显著提高(P0.05);与抑制剂对照组和miRNA-146模拟物组比,miRNA-146抑制剂组细胞迁移能力显著降低（P0.05)（图2)。五、miRNA-146对 HTR-8/SVneo 细胞TLR4、NF-cB、T NF-、IL-6 蛋白和 mRNA表达的影响与模拟物对照组比较，miRNA-146模拟物组的TLR4、NF-c B、T NF-、I L-6 蛋白和 mRNA相对表达量显著降低(P0.05);与抑制剂对照组和miRNA-146模拟物组比较,miRNA-146 抑制剂组的TLR4、NF-k B、A模拟物miR-146对照组模拟物组对照组TLR4NF-KBTNF-.IL-6-actinBA：W e s te r n b lo t检测各组HTR-8/SVneo细胞中TLR4、NF-k B、T NF-、I L-6 蛋白的表达：与模拟物对照组比较，*P0.05;与抑制剂对照组和miR-146模拟物组比较，#P0.05。B:m i RNA-146 对HTR-8/SVneo细胞TLR4、NF-k B、T NF-、IL-6mRNA水平的影响：与模拟物对照组比较，P0.05；与抑制剂对照组和miR-146模拟物组比较，#P0.05。图3miRNA-146对HTR-8/SVneo细胞TLR4、NF-B、T NF-、IL-6 蛋白和mRNA表达的影响1723TNF-、I L-6 蛋白和 mRNA相对表达量显著增加(P0.05)(图 3)。150100500与模拟物对照组比较，*P0.05；与抑制剂对照组和miR-146模拟物组比较，#P0.05。图2 miRNA-146对HTR-8/SVneo细胞迁移能力的影响miR-146模拟物组抑制剂对照组miR-146抑制剂组#2.0抑制剂miR-146kDa抑制剂组9565262148150#100500403020100模拟物对照组miR-146模拟物组抑制剂对照组miR-146抑制剂组模拟物对照组#1.51.01.00.50.5002.02.01.51.51.01.00.50.50080#6040200#2520151050#模拟物对照组miR-146模拟物组抑制剂对照组miR-146抑制剂组#.1724：六、两组小鼠胎盘组织中TLR4/NF-kB信号通路和炎症因子的表达比较采用qRT-PCR方法检测对照组与uRSA组小鼠胎盘组织中miR-146mRNA的表达水平，结果显示uRSA组小鼠胎盘组织中 miR-146 mRNA的相对表NF-KB生殖医学杂志2 0 2 3年11月第32 卷第11期达量显著低于对照组（0.3 2 0.19）VS.（0.9 6 士0.24）,t=12.47 3,P 0.0 5。采用免疫组化法检测相关炎症因子在两组小鼠胎盘组织中的表达显示，与对照组比较,uRSA组小鼠胎盘组织中 TLR4、NF-k B、TNF-、I L-6 蛋白的相对表达量有升高趋势（图 4)。TLR4TNF-IL-6uRSA组um20 um20 m对照组20m图4免疫组化检测TLR4、NF-k B、T NF-、I L-6 蛋白在uRSA组和对照组小鼠胎盘组织中的定位表达（X500）讨论妊娠是一个与正常免疫相悖的生理事件，在这个过程中,母体胎盘免疫功能对胎儿的免疫调控是保障妊娠正常进行的必要条件。在正常妊娠的母胎界面存在TLR4,其在女性生殖受孕、分娩、胚胎生长和发育中发挥重要作用9.12。在反复流产的妇女中,TLR4可异常表达,其在识别相应配体后，通过活化一系列信号转导分子激活NF-kB信号通路，介导炎症反应(IL-6、T NF-等是炎症反应中具有代表意义的促炎因子)和氧化应激损伤等免疫反应13，引发uRSA141。T LRs 参与慢性炎症、氧化应激、肿瘤微环境的形成。但滋养层细胞HTR-8/SVneo中的上述信号转导介导炎症反应的分子机制目前尚未明确。miRNA-146家族成员被称为炎症诱导型miRNAs，参与TLR4信号的负反馈调节，诱导炎症反应，与动脉粥样硬化、心血管疾病发生和发展有密切关联15。近期研究表明，外泌体miRNA-146在M1巨噬细胞和滋养层细胞之间的通讯中起到重要的作20 m用,M1巨噬细胞是母-胎界面的重要免疫细胞成分，可以抑制滋养层细胞的上皮间质转化，提示外泌体miRNA-146可能通过M1巨噬细胞调节滋养层细胞的新机制16 。但miR-146是否参与滋养层细胞HTR-8/SVneo 的增殖、调亡和迁移尚未见研究报道。研究证实，早期流产与滋养层细胞调亡有密切关系，胎盘滋养层细胞发生调亡是导致早期胚胎丢失的主要原因之一17 。在本研究中，miRNA-146 模拟物能够增加胚胎滋养层细胞HTR-8/SVneo的增殖和生长活力,并降低细胞的调亡率，而且miRNA-146对胎盘滋养层细胞HTR-8/SVneo生长的影响呈浓度依赖性趋势，上述结果提示miRNA-146具有促进滋养层细胞HTR-8/SVneo 增殖和生长的能力。此外，miRNA-146模拟物有助于促进胎盘滋养层细胞HTR-8/SVneo迁移，而miRNA-146抑制剂组表现为迁移能力降低。同时，与模拟物对照组和miRNA-146模拟物组比较，miRNA-146抑制剂组滋养层细胞HTR-8/SVneo 的 NF-B、T LR4 蛋白和 mRNA水平亦明显增高。NF-kB和TLR4高水平表达与诱导炎20um20um生殖医学杂志2 0 2 3年11月第32 卷第11期症反应有关,提示miRNA-146可能通过调节TLR4/NF-kB信号通路促进胎盘滋养层细胞HTR-8/SVneo增殖和迁移。本研究的动物实验结果显示，与对照组比较，uRSA小鼠胎盘组织miRNA-146 mRNA的相对表达量显著降低，TLR4、NF-c B、T NF-、I L-6 蛋白的表达有增高趋势，与胎盘滋养层细胞HTR-8/SVneo的研究结果趋势一致，从实验动物角度佐证了细胞研究。以上结果说明：（1）上调miRNA-146可负性调控TLR4/NF-kB信号通路，降低炎症因子TNF-和IL-6的表达，炎症因子TNF-和IL-6参与胎盘滋养层细胞炎症反应的发生，可能影响早期胚胎生长和发育，导致早期流产事件；（2)miRNA-146或许是母胎免疫功能的重要调控分子，能减轻胎盘炎症和免疫反应，在促进早期胎儿生长和发育以及稳定胚胎中发挥重要作用。近期的研究表明，炎症因子 TNF-、I L-6 与NF-kB等信号通路具有相互调控作用，通过影响下丘脑-垂体-卵巢(HPO)轴，诱导雌激素和孕激素的释放，促进生殖细胞的发育以及早期胚胎生长和成熟18 。本研究中的离体研究尚不足以支持上述观点，是否提示miRNA-146可能通过调节TLR4/NF-kB信号通路，绕过HPO轴对早期胚胎丢失发挥胎盘功能保护作用，尚需要进一步的研究观察离体环境下滋养层细胞等对HPO轴的依赖度。综上所述，上调miRNA-146的表达具有促进胎盘滋养层细胞增殖和迁移的作用，其机制可能与负性调控TLR4/NF-kB信号通路有关；miRNA-146有望成为防治uRSA的潜在指标。【参考文献】1 Ticconi C,PietropolliA,Di SN,et al.Endometrial immunedysfunction in recurrent pregnancy loss JJ.Int J Mol Sci,2019,20:5332.2Li TY,Li R,Zeng L,et al.In vitro fertilization-embryotransfer in patientswith unexplained recurrent pregnancy lossJJ.Chin Med J(Engl),2021,134:2421-2429.3Annual Capri Workshop Group.Early pregnancy loss:thedefault outcome for fertilized human oocytesJ.J AssistReprodGenet,2020,37:1057-1063.4Placais L,Kolanska K,Kraiem YB,et al.Intralipid therapyfor unexplained recurrent miscarriage and implantationfailure:Case-series and literature reviewJ.Eur J ObstetGynecol Reprod Biol,2020,252:100-104.5Sato T,Sugiura-Ogasawara M,Ozawa F,et al.Preimplantation:1725.genetic testing for aneuploidy:a comparison of live birth ratesin patientswith recurrent pregnancy loss due to embryonicaneuploidy or recurrent implantation failure JJ.HumReprod,2019,34:2340-2348.6Huang Q,Ding J,Gong M,et al.Effect of miR-3e regulatingNK cell activities on immune tolerance of maternal-fetal interface bytargeting PRF1JJ.Biomed Pharmacother,2019,1