miR-21-3p_p53信号通路对缺血_再灌注损伤小鼠的肾脏保护作用及其机制 (1).pdf

实用医学杂志 2023年第39卷第19期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.19miR-21-3p/p53信号通路对缺血/再灌注损伤小鼠的肾脏保护作用及其机制雷小林1 刘燕秀2 张婵31西安交通大学第一附属医院肾脏内科（西安 710000）；2吉安市中心人民医院消化内科（江西吉安 343000）；3西北工业大学医学研究院（西安 710072）【摘要】目的观察miR-21-3p对肾缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤小鼠的影响，并探讨其肾脏保护作用是否与通过 miR-21-3p/p53 信号通路而调控凋亡水平有关。方法体内实验随机分为Sham、I/R、I/R+agomir、I/R+agomir+PIF、I/R+PIF共5组。建立小鼠肾缺血/再灌注（I/R）损伤模型；构建过表达miR-21-3p（agomiR-21-3p）小鼠，同时给予p53抑制剂Pifithrin-（PIF）处理；采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-21-3p与p53的互作；检测小鼠血清中肾功能指标小鼠胱抑素 C（Cys C）、尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）的含量，以及炎症指标肿瘤坏死因子-（TNF-）、白细胞介素-1（IL-1）、超敏C反应蛋白（hs-CRP）含量水平；此外，TUNEL染色观察肾细胞凋亡情况，并检测肾组织（细胞）匀浆中细胞凋亡相关基因p53、Bax、Bcl2、Caspase-3的表达水平。结果与Sham组比较，I/R组小鼠肾细胞miR-21-3p表达明显降低；而与I/R 组相比，I/R+agomir 组、I/R+PIF 组和 I/R+agomir+PIF 组 miR-21-3p 表达均明显升高（P 0.05），而p53表达趋势相反；双荧光素酶报告基因实验证实miR-21-3p与p53存在互作关系；与Sham组比较，其他肾组织细胞凋亡率均升高；但是与I/R 组相比，I/R+agomir 组、I/R+PIF 组和I/R+agomir+PIF 组凋亡率降低，I/R+agomir+PIF组损伤最低（P 0.05）。结论miR-21-3p可以通过靶向下调p53表达来抑制凋亡的发生，从而减轻肾I/R小鼠的肾损伤，发挥肾脏保护作用。【关键词】miR-21-3p；缺血/再灌注损伤；p53；细胞凋亡【中图分类号】R363.1+4Protective effects and the mechanism of miR213p/p53 signaling pathway on renal function in mice with renal ischemia/reperfusion injury LEI Xiaolin*，LIU Yanxiu，ZHANG Chan.*Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University，Xian 710000，China Corresponding author：ZHANG Chan Email：【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of miR-21-3p on mice with renal ischemia/reperfusion（I/R）injury and to explore whether the renal protective effect is related to the regulation of apoptosis levels through miR-21-3p/p53 signaling pathway.MethodsIn vivo experiments were randomly divided into five groups：Sham，I/R，I/R+agomir，I/R+agomir+PIF，and I/R+PIF.Renal I/R injury model in vivo was established，overexpressing of miR-21-3p（agomiR-21-3p）in mice were constructed and treated with the p53 inhibitor Pifithrin-（PIF）.Dual-luciferase reporter assay was used to verify the interaction between miR-21-3p and p53.Serum levels of cystain C（Cys C），blood urea nitrogen（BUN）and serum creatinine（Scr）were measured to reflect renal function of mice.Serum oxidative stress and inflammation indices were also determined，including tumor necrosis factor-alpha（TNF-），Interleukin-1（IL-1），and high-sensitive c-reactive protein（hs-CRP）.In addition，apoptosis rate of renal cells was visualized by TUNEL staining and the expression of apoptosis b-cell lymphoma-2（Bcl-2），Bcl-2 assaciated X protein（Bax），p53 and caspase-3 were measured too.ResultsCompared with Sham group，the expression of miR-21-3p in I/R mice was significantly decreased.Compared with I/R group，the expression of miR-21-3p in the I/R+agomir group，the I/R+PIF group and the I/R+agomir+PIF group was significantly increased（P 0.05），while the trend of p53 expression was opposite.Dual-luciferase reporter assay confirmed the interaction between miR-21-3p and p53.Compared with Sham group，the rate of cell apoptosis in all other renal tissues was increased；基 础 研 究doi：10.3969/j.issn.1006-5725.2023.19.011基金项目：国家自然科学基金-青年科学基金项目（编号：82200386）；中国博士后科学基金-面上项目（编号：2022M712590）；陕西省自然科学基础研究计划项目-青年项目（编号：2022JQ-881）通信作者：张婵 E-mail：2475实用医学杂志 2023年第39卷第19期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.19however，compared with the I/R group，the I/R+agomir，the I/R+PIF group and I/R+agomir+PIF groups were decreased，and the I/R+agomir+PIF group was the lowest（P 0.05）.ConclusionsmiR-21-3p could inhibit the development of apoptosis by targeting p53 expression，thus alleviating renal injury in mice with renal I/R.【Key words】miR-21-3p；ischemia/reperfusion injury；p53；apoptosis急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是一种常见的综合征，定义为肾功能突然下降。AKI 见于 10%15%的住院患者，甚至超过 50%的 ICU患者1。更重要的是，AKI是院内死亡率的独立预测指标，对于这些幸存者来说，进展为慢性肾脏病或终末期肾病的风险很高，迫切需要为已确诊的AKI寻找特定的治疗策略2。肾I/R损伤是AKI的主要原因，其特征是肾小管致死性和亚致死性损伤3-4。研究5表明，肾小管适应不良和不完全修复导致肾纤维化的进展。因此，保护肾小管上皮细胞（tubular epithelial cells，TEC）免受缺血性损伤和促进肾小管修复对于改善缺血性AKI的结局至关重要。目前，血清肌酐和尿量通常用于 AKI 诊断和分期6。然而，血清肌酐和尿量的变化在实际肾损伤后发生相对较晚，因此不能提供 AKI 的早期或及时检测。此外，血清肌酐和尿量受多种因素影响，如脱水、膳食蛋白质摄入量、肌肉质量、利尿剂等7。MicroRNA（miRNA）是核苷酸的短非编码RNA分子，内源性产生以调节靶基因表达8-9。有趣的是，一些 miRNA 被释放到细胞外空间，并在血液，尿液和其他体液中被检测到，代表了人类疾病的新型诊断生物标志物。与蛋白质生物标志物相比，miRNA在体液中更稳定10-11。此外，基于序列的qPCR扩增能够以高特异性测量少量体液中极少量的 miRNA12-13。在肾脏中，miRNA 与包括AKI 在内的多种肾脏疾病的发病机制有关，并且特异性miRNA的表达变化被认为对AKI具有诊断价值14-15。然而，目前尚无具有高灵敏度和特异性的 miRNA 生物标志物，用于 I/R 患者早期检测AKI。近期有研究16-17发现miR-21-3p可以减弱神经细胞中缺氧/复氧诱导的细胞凋亡，以及减轻急性肺损伤，但 miR-21-3p 是否参与了 I/R 诱导肾小管上皮细胞凋亡，目前尚不清楚。肿瘤抑制因子p53 已成为各种形式的AKI 的重要参与者18。这种转录因子主要通过停止细胞周期和促进细胞凋亡来响应细胞应激和 DNA 损伤。生物信息学分析表明 miR-21-3p 可能直接靶向调控 p53 的表达，然而其具体作用机制尚未完全清楚。在这项研究中，证明了miR-21-3p在小鼠缺血性 AKI 中的生物分布和治疗益处。miR-21-3p 积聚在受损伤的肾脏中，通过下调p53表达，抑制凋亡来显著减轻 AKI 的病理损伤和病死率，改善肾I/R损伤，发挥了肾脏保护作用，为预防和治疗AKI提供新的分子策略。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物实验选取SPF级别的C57 BL/6J雄性小鼠（3 4 月龄，体质量 20 26 g），购买于西安交通大学第一附属医院实验动物中心，饲养于西安交通大学第一附属医院肾脏内科实验动物房，室内温度控制在 22 26，相对湿度为 45%75%，噪音60 dB以内，12 h光照交替，定期消毒通风。动物实验符合伦理学（许可证号：202201003）。1.1.2主要试剂和仪器Pifithrin-由 MCE 公司购买（货号：HY-123076）；小鼠肾功能指标：半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（胱抑素C，Cys C）、血尿素氮（BUN）检测试剂盒（上海沪震生物科技有限公司）；血清中肌酐（Scr）水平检测试剂盒（北京九强生物技术股份有限公司）；炎症指标：肿瘤坏死因子-（TNF-）、超敏C反应蛋白（hs-CRP）、白细胞介素-1（IL-1）ELISA 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；细胞凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Caspase-3、p53）抗体由 Abcam（英国）公司购买。AgomiR-21-3p（过表达 miR-21-3p）病毒由广州锐博生物技术有限公司定制完成。组织细胞 RNA提取试剂盒（Trizol提取法）（Invitrogen）；反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒（北京全式金生物技术股份有限公司）；抗p53抗体（ab26，Abcam），抗Bax抗体（ab32503，Abcam），抗Bcl2抗体（ab182858，Abcam），抗 Caspase-3 抗体（ab184787，Abcam），抗 GAPDH抗体（ab8245，Abcam）；二抗：山羊抗兔IgG（H+L）（CW0103S，康为世纪），山羊抗小鼠 IgG（H+L）（CW0102S，康为世纪）。ECL 化学发光液、PDVF膜购自美国Millipore。台式高速冷冻离心机（5424R，艾本德/Eppendorf）；T100 基因扩增仪（Bio-Rad）；CAX-370 型离心机（日本TomySeiko公司）；SYNERGY/H1多功能酶标仪（BioTek）；MX3005P 荧光定量分析仪（Agilent）；BIO RAD GelDoc XR 化学发光凝胶成像仪（Bio-Rad伯乐）；IX83荧光显微镜（Olympus）。2476实用医学杂志 2023年第39卷第19期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.191.2方法1.2.1动物分组与给药小鼠适应性喂养后，随机分成Sham组、I/R组、I/R+agomir组、I/R+agomir+Pifithrin-（PIF）组、I/R+PIF，每组6只；除Sham组外均建立肾 I/R 模型，I/R+agomir 组、I/R+agomir+PIF 组和 I/R+PIF 组在模型建立前 3 d 每只经尾静脉注射 miR-21-3p agomir 10 nmol/L19，I/R+agomir+PIF 组同时腹腔注射 p53 特异性抑制剂PIF（3 mg/kg），共注射 3 d20。Sham 组和 I/R 组经尾静脉注射等量PBS 溶液，在此期间动物自由饮食饮水。1.2.2I/R模型建立按照60 mg/kg的剂量，按照根据小鼠实际体重，腹腔注射 1%戊巴比妥钠溶液，成功麻醉后，将小鼠置于 37 动物恒温手术台，取高压灭菌后的手术器械于小鼠腹正中线做 1 2 cm的切口，依次切开皮肤至腹膜，而后使用眼科镊在腹腔中游离双侧肾脏及肾蒂，使用微血管夹将双侧肾蒂夹闭，开始进行20 min倒计时，后快速松开微血管夹，观察到双侧肾脏均由紫黑色转为红色，表明再灌注成功，注意无菌及保暖，关闭切口，依次缝合小鼠腹部肌层和皮层组织。假手术组仅切开腹膜，游离双侧肾脏及肾蒂，不夹闭肾蒂。在再灌注时间点24 h后依次麻醉小鼠后取材，取小鼠眼眶血及双侧肾脏，进行之后的指标检测。按照实验用量切取一定量的肾组织用 4%多聚甲醛固定，进行病理染色。剩余部分储存于-80 的冰箱中保存，用于基因和蛋白的检测分析。1.2.3细胞培养及转染将生长状态良好的小鼠肾小管上皮细胞 TCMK1 培养于含有 10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（P/S）的DMEM-F12培养基，消化离心重悬后均匀地将细胞接种在 6孔板内，在CO2培养箱中37 培养细胞过夜，使得细胞均匀贴壁生长。按照制造商说明书进行细胞转染（mimic miR-21-3p 和 miR-21-3p inhibitor 以及空载对照NC由中国上海GenePharma公司提供），第 2 天查看接种密度和细胞生长状态，达到 70%融合时，使用 PBS 清洗两遍后每孔再加入 1 mL的Opti-MEM 无血清培养基，细胞在CO2培养箱中37 继续培养 6 h 后更换正常 DMEM 培养基，于转染后48 h后观察转染效率并进行指标测定。1.2.4双荧光素酶报告基因实验检测 miR213p与 p53 的靶向结合作用根据生物信息学预测结果，针对 miR-21-3p 上潜在的 p53 结合位点（第635个碱基位点），构建miR-21-3p 3UTR 的野生型及突变型荧光素酶报告基因质粒，分别与 miR-21-3p 模拟物（mimic）共转染到 293T 细胞中，以双荧光素酶报告基因实验检测其活性，明确 miR-150-5p 是否与 p53 靶向结合影响其活性，以及具体的结合部位。1.2.5肾功能指标和炎症指标的测定体内采用小鼠眼球采血法，分离血清，以6 000 r/min，离心10 min，依据试剂盒方法检测血清中有关肾功能指标的Cys C、BUN、Scr含量水平和炎症因子TNF-、IL-1和hs-CRP含量。1.2.6标本采集与肾脏细胞凋亡率检查分别处死小鼠并解剖取出肾脏，分成两部分，一部分于-80 条件下保存，做肾组织中细胞凋亡相关基因 p53、Bax、Bcl-2、Caspase-3 的检测；另一部分于4%多聚甲醛中浸泡 24 h，然后使用乙醇脱水，切制成4 m厚的切片，并用做TUNEL染色，在荧光显微镜下观察各组肾脏细胞凋亡率。1.2.7qRTPCR检测肾组织及细胞miR215p和p53 基因表达取各组液氮保存的右肾组织，RNA提取试剂盒提取总RNA，并进行逆转录。PCR引物序列见表 1。使用 TaqMan miRNAs 检测试剂盒进行 PCR 反应。PCR 反应条件：94 30 s，94 5 s，60 30 s，共40个循环。采用2-Ct法计算 miR-21-5p 和 p53 相对表达量。各组 RNA 表达量归一化为对照组（NC或sham组）。1.2.8Western blot 测定肾组织凋亡相关蛋白表达体内实验将各组实验小鼠肾脏组织匀浆，加入裂解液，以 6 000 r/min，离心 10 min，分离并吸取上清液。BCA法测定蛋白浓度，进行蛋白定量。采用Western blotting 检测细胞凋亡相关蛋白p53、Bax、Bcl-2和Caspase-3表达，各组蛋白表达量归一化为GAPDH。1.3统计学方法用 SPSS 22.0 统计软件进行分析。数据均采用均数标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD-t法），以P 0.05为差异有统计学意义。2结果2.1缺血再灌注损伤导致小鼠肾组织miR213p下调和p53表达上调I/R 肾组织 miR-21-3p 表达低于正常组，p53 表达高于正常组（P 4倍，图1A），而p53呈高表达（图1B）。Agomir-21-3p肾组织中miR-21-3p表达明显升高，p53表达显著降低；此外，与 I/R+agomir 组相比，用 p53 抑制剂（PIF）处理后，miR-21-3p 反而升高（P 0.05），I/R+agomir组与 I/R+PIF组未见明显差异。2477实用医学杂志 2023年第39卷第19期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.192.2miR213p 靶向调控p53表达生物信息学分析（TargetScan，miRDB，miRTarBase）预测显示，miR-21-3p与p53存在互补核苷酸序列（图2A、B）。双荧光素酶报告实验结果显示，WT-miR-21-3p 与p53共转染后的细胞荧光素酶活性降低，而MUT-miR-21-3p与p53共转染后的细胞荧光素酶活性无显著变化（图 2C）。TCMK1 细胞 qRT-PCR 结果显示，miR-21-3p mimic组p53表达低于NC mimic组；miR-21-3p inhibitor 组 p53 表达高于 NC inhibitor 组（P 0.05，图2D），图2E显示转染效率大约为80%。2.3过表达miR213p小鼠可减弱I/R导致的肾功能损伤与Sham组比较，I/R组小鼠血中Cys C、Scr和 BUN等反映肾功能的指标参数水平显著升高（P 0.05）；同时，与I/R组比较，过表达miR-21-3p小鼠血中肾功能指标含量水平均有不同程度降低（P 0.05），过表达miR-21-3p基础上再给予PIF处理后，小鼠血中肾功能损伤指标含量水平降低更加明显。I/R+agomir组与 I/R+PIF组未见明显差别。见图3。2.4过表达miR213p而抑制p53小鼠可以抑制炎症因子的表达与 Sham 组比较，I/R 组小鼠血清 TNF-、IL-1 和 hs-CRP 含 量 均 有 增 加（P 0.05）；同时，I/R+agomir 组与 I/R+PIF 组未见明显差别，但是与I/R组比较，小鼠血中肾功能指标含量水平也有不同程度降低，而I/R+agomir+PIF组则显著降低炎症因子的产生。见图4。2.5肾脏组织细胞凋亡率的检测在荧光显微镜下，发现Sham组小鼠的肾小管、肾小球等细胞，未发生明显的细胞凋亡；与Sham 组比较，I/R 组小鼠肾小管上皮细胞发生大量的细胞凋亡；与I/R组比较，过表达miR-21-3p小鼠肾小管上皮细胞凋亡程度明显减低，进一步用PIF抑制p53表达后凋亡细胞显著减少（P 0.05），I/R+agomir 组与 I/R+PIF组未见明显差别。见图5。表1引物序列Tab.1Sequences of the primers名称p53miR-21-3pU6GAPDH序列Forward:5-CCATCTACAAGCAGTCACA-3Reverse:5-CCATCTACAAGCAGTCACA-3Forward:5 ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA-3Reverse:5-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACAACT-3Forward:5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3Reverse:5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3Forward:5-TCAACGGCACAGTCAAGG-3Reverse:5-ACTCCACGACATACTCAGC-343210Relative RNA expression of miR213p（U6）Sham组I/R组I/R+agomir组I/R+agomir+PIF组I/R+PIF组*2.52.01.51.00.50.0Relative RNA expression of p53（GAPDH）ABSham组I/R组I/R+agomir组I/R+agomir+PIF组I/R+PIF组注：A，miR-21-3p表达；B，p53表达。*P 0.05图1缺血再灌注肾组织miR-21-3p和 p53 的基因表达Fig.1mRNA expressions of miR-21-3p andp53 in I/R kidney tissues2478实用医学杂志 2023年第39卷第19期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.195mfe：-22.1 kcal/molNC mimicmiR213p mimic*86420NC mimicmiR213p mimicNC inhibitormiR213p inhibitorNC mimicNCWTMUTp532.52.01.51.00.50.0Relative luciferase activityRelative RNA expressionof p53（GAPDH）Light fieldFluorescent lightTransfection efficiencyABCDE注：A、B，miR-21-3p与p53存在互补核苷酸序列；C，双荧光素酶报告实验WT-miR-21-3p 与p53共转染后；D，miR-21-3p调控p53的表达；E，miR-21-3p的转染效率。*P 0.05图2miR-21-3p靶向调控p53表达Fig.2miR-21-3p targeted and regulated p53 expressionI/R+agomir+PIF组I/R+PIF组I/R+agomir组I/R组Sham组*403020100BUN（mmol/L）1.20.80.40.0Cys C（mg/L）150100500Scr（mol/L）ABCI/R+agomir+PIF组I/R+PIF组I/R+agomir组I/R组Sham组I/R+agomir+PIF组I/R+PIF组I/R+agomir组I/R组Sham组注：A，BUN；B，Cys C；C，Scr；*P 0.05图3各组小鼠血中 Cys C、Scr和 BUN含量检测Fig.3Content of CysC，BUN and Scr in different groups2479实用医学杂志 2023年第39卷第19期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.192.6miR213p/p53通过调控I/R损伤后肾细胞凋亡抑制肾功能损伤与 Sham 组比较，I/R 组肾组织促凋亡蛋白p53、Bax、Caspase-3表达均升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达均降低（P 0.05）；与I/R组相比，I/R+agomir 组、I/R+PIF、I/R+agomir+PIF 组肾组织细胞不同程度地降低了 Bax、升高了 Bcl-2 和降低了Caspase-3和p53表达，I/R+agomir+PIF组抑制凋亡蛋白表达水平更明显（P 0.05）；此外，Bax/Bcl-2比例下降，从而减少了Caspase-3的产生，起到抑制细胞凋亡作用（图6）。3讨论本课题采取“增加外源性”和“消除内源性”的设计方案来验证miR-21-3p/p53对I/R的肾损伤作用。在体外实验中，应用双荧光素酶报告基因实验检测miR-21-3p和p53之间的反馈关系；通过上调或沉默miR-21-3p表达，研究其对肾脏保护作用的靶点。在体内实验中，通过在体miRNA干扰等手段，明确miR-21-3p/p53的作用。其次，本课题从体外、体内两个层次，从分子、细胞和整体水平对miR-21-3p/p53抗AKI的作用与机制加以探讨。本研究证明了I/R导致AKI的模型中的miR-21-3p显著降低，因此可以将miR-21-3p确定为缺血性AKI背景下的重要转录后调节因子。此外，I/R 导致AKI中miR-21-3p的低表达加重肾损伤并参与炎症反应增强，上调miR-21-3p可改善肾功能，下调p53I/R+agomir+PIF组I/R+PIF组I/R+agomir组I/R组Sham组*100806040200TNF（g/mL）806040200IL1（g/mL）20151050hsCRP（mg/L）ABCI/R+agomir+PIF组I/R+PIF组I/R+agomir组I/R组Sham组I/R+agomir+PIF组I/R+PIF组I/R+agomir组I/R组Sham组注：A，TNF-；B，IL-1；C，hs-CRP。*P 0.05图4各组小鼠血中 TNF-、IL-1 和hs-CRP含量检测Fig.4Content of TNF-，IL-1 and hs-CRP in different groupsI/R+agomir+PIF组I/R+PIF组I/R+agomir组I/R组Sham组*50403020100Apoptotic rate（%）I/R+agomir+PIF组I/R+PIF组I/R+agomir组I/R组Sham组DAPITUNELMergeAB注：A，荧光检测凋亡率；B，凋亡率结果。*P0.05图5各组小鼠肾组织细胞凋亡情况的比较Fig.5Comparison of renal cell apoptosis in various groups of mice（Bar=100 m）2480实用医学杂志 2023年第39卷第19期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.19表达，减少体内细胞凋亡和炎症反应。I/R会导致慢性肾脏疾病甚至死亡21，许多研究22-23调查了肾脏I/R的分子和细胞机制，表明发生了各种病理生理变化，包括肾小管上皮细胞损伤，微血管功能障碍和炎症，这些变化对I/R的整体肾损伤做出了巨大贡献。然而，潜在的机制尚未完全阐明，并且没有有效的治疗方法可用于I/R相关的肾损伤。miRNA是经过充分研究的转录后调节因子，通过抑制 mRNA 转录对各种生物过程具有至关重要的影响24-25。miRNAs具有高度保守性，不易被降解，调控下游靶基因和下游蛋白表达是miRNAs 通过多种途径参与缺血后病理损伤的调节的主要机制26。通过生物信息学软件程序预测的结果，并通过荧光素酶报告基因测定证实miR-21-3p通过直接结合p53 mRNA的3 UTR来抑制 p53 表达。p53 基因为人体抑癌基因，p53 基因的失活或下调对细胞凋亡的发展起重要作用。本研究结果显示 miR-21-3p mimics 可以下调 p53 蛋白表达，说明过表达miR-21-3p通过靶向抑制p53，从而抑制肾脏细胞的凋亡和炎症反应，有助于I/R的改善。通过本项目的深入研究，可望对 I/R 导致的AKI 的治疗提供新的理论依据，为临床治疗提供新的思路：（1）I/R 导致的 AKI 可能导致肾组织miR-21-3p 的表达下调，检测体液中 miR-21-3p 的含量可能对早期疾病的诊断及预后判断有重要意义；（2）过表达肾组织 miR-21-3p可以抑制靶细胞 p53 的表达，抑制细胞凋亡减轻炎症反应；下调肾细胞中miR-21-3p或上调p53可能加重I/R导致的AKI。此外，肾组织中miR-21-3p的含量可能代表一类新的肾损伤生物标志物；（3）建立早期 miR-21-3p-肾脏关系网络，外源性上调miR-21-3p可能是AKI治疗的新策略，为肾脏IRI患者的预后评估和靶向治疗提供参考。然而，miR-21-3p的来源以及p53影响细胞凋亡及炎症反应的更具体的作用机制在今后的工作中将进一步验证。综上所述，miR-21-3p在I/R中下调，抑制p53，导致细胞凋亡和炎症反应，加重肾功能损伤；上调miR-21-3p 表达并确定到肾脏更有效的靶向运输是缓解肾损伤的重要治疗方案。【Authors contributions】LEI Xiaolin，LIU Yanxiu，ZHANG Chan performed the experiments and analyzed the data.ZHANG Chan deI/R+agomir+PIF组I/R+PIF组I/R+agomir组I/R组Sham组*1.00.80.60.40.20.0Relative protein expressionof Caspase3（GAPDH）1.20.80.40.0*Relative protein expressionof Bcl2（Bax）0.60.40.20.0Relative protein expressionof p53（GAPDH）I/R+agomir+PIF组I/R+PIF组I/R+agomir组I/R组Sham组53 kDa28 kDa20 kDa32 kDa36 kDap53Bcl2BaxCaspase3GAPDHABCDI/R+agomir+PIF组I/R+PIF组I/R+agomir组I/R组Sham组I/R+agomir+PIF组I/R+PIF组I/R+agomir组I/R组Sham组注：A，Western blot结果；B，p53表达水平；C，Bcl-2表达水平；D，Caspase-3表达水平。*P 0.05图6各组小鼠肾组织中p53、Bcl-2、Bax和Caspase-3表达水平的比较Fig.6Comparison of p53、Bcl-2、Bax and Caspase-3 protein expression in renal tissue of mice in each group2481实用医学杂志 2023年第39卷第19期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.19signed and supervised the study and wrote the paper.All authors read and approved the final manuscript.参考文献1 黄巍，张庆祥，罗丹，等.LncRNA MAGI2-AS3调控miR-374b-5p/HOXb7信号通路对脓毒症相关脑损伤的影响 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