EGFR突变对肺腺癌预后及治疗意义生物信息分析.pdf

第5 9卷 第4期2 0 2 3年0 8月青 岛 大 学 学 报(医 学 版)J OUR NA LO FQ I N G D AOUN I V E R S I T Y(ME D I C A LS C I E N C E S)V o l.5 9,N o.4A u g u s t 2 0 2 3 收稿日期2 0 2 2-0 4-0 3;修订日期2 0 2 3-0 5-2 6 基金项目国家自然科学基金项目(8 1 6 7 0 8 2 2,8 1 3 7 0 9 9 0);青岛市医疗卫生重点学科建设项目(青卫科教字2 0 1 99号)第一作者朱明雪(1 9 9 6-),女,硕士研究生。通信作者牟晓峰(1 9 7 0-),男,硕士,主任技师,硕士生导师。E-m a i l:m u x i a o f e n g 2 0 0 51 2 6.c o m。E G F R突变对肺腺癌预后及治疗意义生物信息分析朱明雪1,闫清2,王鹏2,王晔2,牟晓峰2(青岛大学,山东 青岛 2 6 6 0 7 1 1 医学部;2 附属青岛市中心医院检验科)摘要 目的 探讨表皮生长因子受体(E G F R)突变对肺腺癌预后及治疗的意义。方法 从癌症基因组图谱(T C GA)数据库下载肺腺癌的R NA测序数据、基因表达矩阵及临床信息,应用基因突变景观分析了解E G F R在肺腺癌中的突变情况,分析与E G F R突变相关的临床特征。利用差异分析得到差异表达基因(D E G s),基于D E G s的重叠基因构建L A S S O-C o x风险预后模型,依据模型风险评分中位值将样本分为高、低风险组进行K a p l a n-M e i e r生存分析。应用单因素C o x风险比例回归分析肺腺癌预后特征基因,并对其与E G F R突变相关性进行分析。分析E G F R突变与免疫细胞浸润和铁死亡基因的关系。结果 E G F R在肺腺癌中的突变率为1 1.6 4%,E G F R突变与性别(2=5.1 3 9,P0.0 5)和吸烟(2=3 6.8 2 2,P0.0 1)有关。生存分析显示,高风险组生存率较低(HR=1.9 3 2,9 5%C I=1.4 3 32.6 0 6,P0.0 5)。G L B 1 L 3、TMEM 6 3 C、F AM 8 3 A基因与肺腺癌的预后相关,其中G L B 1 L 3、TMEM 6 3 C与E G F R突变呈正相关(r=0.3 8 31、0.3 8 26,P0.0 5)。肺腺癌组织中C D 8+T细胞比例较高,且与E G F R突变状态相关;在E G F R突变型和野生型肺腺癌中,有1 0个铁死亡基因表达差异具有统计学意义(t=1.8 9 6 3.7 6 5,P0.0 5)。结论 E G F R突变与肺腺癌的不良预后相关,且与肿瘤免疫细胞浸润和铁死亡存在紧密联系,这为肺腺癌的治疗提供了新思路。关键词 肺腺癌;E r b B受体;突变;预后;治疗学;铁死亡;计算生物学 中图分类号 R 7 3 4.2 文献标志码 A 文章编号 2 0 9 6-5 5 3 2(2 0 2 3)0 4-0 5 2 2-0 5d o i:1 0.1 1 7 1 2/j m s.2 0 9 6-5 5 3 2.2 0 2 3.5 9.1 2 1 开放科学(资源服务)标识码(O S I D)网络出版 h t t p s:/l i n k.c n k i.n e t/u r l i d/3 7.1 5 1 7.R.2 0 2 3 0 9 2 0.0 9 3 1.0 0 4;2 0 2 3-0 9-2 1 1 2:1 1:4 2S I G N I F I C A N C EO FE P I D E RMA L G R OWT H F A C T O R R E C E P T O R MU T A T I O NI N T H E P R O G N O S I SA N D T R E A T ME N T O FL U N GA D E N O C A R C I N OMA:AB I O I N F O RMA T I C SA N A L Y S I S ZHU M i n g x u e,Y AN Q i n g,WANGP e n g,WANGY e,MUX i a o f e n g(M e d i c a lC o l l e g eo fQ i n g d a oU n i v e r s i t y,Q i n g d a o2 6 6 0 7 1,C h i n a)A B S T R A C T O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h es i g n i f i c a n c eo f e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r(E G F R)m u t a t i o n i nt h ep r o g-n o s i sa n dt r e a t m e n to f l u n ga d e n o c a r c i n o m a.M e t h o d s R NAs e q u e n c i n gd a t a,g e n ee x p r e s s i o nm a t r i x,a n dc l i n i c a l i n f o r m a t i o no f l u n ga d e n o c a r c i n o m aw e r ed o w n l o a d e df r o mt h eC a n c e rG e n o m eA t l a sd a t a b a s e,ag e n em u t a t i o n l a n d s c a p ea n a l y s i sw a su s e d t oi n v e s t i g a t eE G F Rm u t a t i o n i n l u n ga d e n o c a r c i n o m a,a n d t h e c l i n i c a l f e a t u r e s a s s o c i a t e dw i t hE G F Rm u t a t i o nw e r e a n a l y z e d.Ad i f-f e r e n t i a l a n a l y s i sw a sp e r f o r m e dt oo b t a i nd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e s(D E G s),a n daL A S S O-C o xr i s kp r o g n o s t i cm o d e lw a sc o n s t r u c t e db a s e do nt h eo v e r l a p p i n gg e n e so fD E G s.T h e s a m p l e sw e r ed i v i d e d i n t oh i g h-a n d l o w-r i s kg r o u p sb a s e do nt h em e d i a nr i s ks c o r eo f t h em o d e l,a n dt h e nt h eK a p l a n-M e i e rm e t h o dw a su s e d t op e r f o r mt h e s u r v i v a l a n a l y s i s.Au n i v a r i a t eC o xp r o p o r t i o-n a l-h a z a r d s r e g r e s s i o nm o d e l a n a l y s i sw a su s e dt o i n v e s t i g a t e t h ec h a r a c t e r i s t i cg e n e sa s s o c i a t e dw i t ht h ep r o g n o s i so f l u n ga d e n o-c a r c i n o m a,a n dt h e i r c o r r e l a t i o nw i t hE G F Rm u t a t i o nw a sa n a l y z e d.T h ea s s o c i a t i o no fE G F Rm u t a t i o nw i t h i mm u n e c e l l i n f i l t r a-t i o na n df e r r o p t o s i sg e n e sw a sa n a l y z e d.R e s u l t s T h e r a t eo fE G F Rm u t a t i o nw a s 1 1.6 4%i n l u n ga d e n o c a r c i n o m a,a n dE G F Rm u t a t i o nw a sa s s o c i a t e dw i t hs e x(2=5.1 3 9,P0.0 5)a n ds m o k i n g(2=3 6.8 2 2,P0.0 1).T h eh i g h-r i s kg r o u ph a da r e l a t i v e l yl o ws u r v i v a l r a t e(HR=1.9 3 2,9 5%C I=1.4 3 3-2.6 0 6,P0.0 5).T h eG L B 1 L 3,TMEM 6 3 C,a n dF AM 8 3 Ag e n e sw e r ea s s o c i a-t e dw i t ht h ep r o g n o s i so f l u n ga d e n o c a r c i n o m a,a m o n gw h i c hG L B 1 L 3a n dTMEM 6 3 Cw e r ep o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t hE G F Rm u-t a t i o n(r=0.3 8 31,0.3 8 26,P0.0 5).T h e r ew a sar e l a t i v e l yh i g hp r o p o r t i o no fC D 8+Tc e l l s i nl u n ga d e n o c a r c i n o m at i s s u e,w h i c hw a sc o r r e l a t e dw i t ht h es t a t u so fE G F Rm u t a t i o n,a n dt h e r ew e r es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s i nt h ee x p r e s s i o no f1 0f e r r o p t o s i sg e n e sb e t w e e nE G F R-m u t a n t l u n ga d e n o c a r c i n o m aa n dw i l d-t y p e l u n ga d e n o c a r c i n o m a(t=1.8 9 6-3.7 6 5,P1、P0.0 5为筛选条件,筛选E G F R突变型、野生型肺腺癌和癌旁正常组织样本中两两比较的差异表达基因(D E G s)。然后利用V e n n图获取3组D E G s的重叠基因。1.4 预后模型构建及评价基于D E G s的重叠基因构建L A S S O-C o x风险预后模型,依据模型风险评分中位值将样本分为高、低风险组进行K a p l a n-M e i e r(KM)生存分析。R软件包g l m n e t用于s i g n a t u r e模型的分析,L o gr a n k检验用于比较高、低风险组的生存差异,时间依赖的受试者工作特征(R O C)曲线用于分析特征基因和风险评分预测的准确性,单因素C o x风险比例回归分析用于筛选对肺腺癌有预后意义的基因。采用S p e a r m a n相关性分析方法分析E G F R突变与关键基因之间的相关性,利用R软件包p h e a t m a p展示多基因相关性热图。1.5 肺腺癌E G F R突变与免疫细胞关系分析利用R软件包i mm u n e d e c o n v对E G F R突变组和野生组肺腺癌样本进行免疫评分评估,使用W i l c o x检验比较两组之间的差异。采用S p e a r m a n相关性分析方法分析肺腺癌中E G F R突变与免疫细胞之间的相关性。利用R软件包p h e a t m a p绘制热图。1.6 肺腺癌E G F R突变与铁死亡基因关系分析分析肺腺癌中2 4个铁死亡相关基因在E G F R突变型、野生型肺腺癌组织中的差异表达。1.7 统计学方法本研究中所有分析均应用R软件(3.6.2版本)完成。正态分布计量数据以xs表示,组间比较采用t检验;计数数据组间比较采用卡方检验;两组之间生存差异比较采用L o gr a n k检验;相关性检验采用S p e a r m a n相关性分析。以P0.0 5为差异具有统计学意义。2 结 果2.1 E G F R在肺腺癌中的突变率E G F R在肺腺癌中存在突变,体细胞突变率为1 1.6 4%(图1 A)。瀑布图显示,8 1.4 8%的样本出现突变(图1 B)。2.2 E G F R突变与临床特征的关系E G F R突变与性别(2=5.1 3 9,P0.0 5)和吸烟(2=3 6.8 2 2,P0.0 1)有关,而与其他临床特征无关。见表1。2.3 肺腺癌差异基因分析对E G F R突变型、野生型肺腺癌和癌旁正常组织样本进行两两比较,得到3组D E G s。火山图显示,E G F R突变型与野生型肺腺癌组织D E G s中有4 2个上调基因,3 0个下调基因(图2 A);E G F R突变型肺腺癌与癌旁正常组织D E G s中有18 0 9个上调基因,21 4 3个下调基因(图2 B);E G F R野生型肺腺癌和癌旁正常组织D E G s中有15 1 7个上调基因,23 8 8个下调基因(图2 C)。对这3组D E G s取交集,得到3 1个重叠基因(图2 D)。2.4 预后风险模型构建及评价用L A S S O回归分析从3 1个重叠基因中筛选出4个(G L B 1 L 3、TMEM 6 3 C、F AM 8 3 A、G PX 2)5 2 4青 岛 大 学 学 报(医 学 版)5 9卷A:E G F R在肺腺癌中突变的棒棒糖图;B:瀑布图显示了肺腺癌的体细胞突变景观。图1 E G F R的突变景观表1 两组临床特征比较(例)组别n状态生存 死亡年龄(岁,xs)性别*女性 男性种族亚洲人黑人 白人印第安人p T NM分期ABAB AB吸烟*否是野生组4 4 42 8 5 1 5 96 5.31 0.22 3 0 2 1 444 53 3 4141 1 3 1 2 514 26 16 382 14 7 3 8 4突变组6 53 92 66 5.2 8.94 42 1374 9011 71 30781 0352 63 8 两组比较,*2=5.1 3 9、3 6.8 2 2,P0.0 5。A:E G F R突变型和野生型肺腺癌组织的差异基因分析;B:E G F R突变型肺腺癌和癌旁正常组织的差异基因分析;C:E G F R野生型肺腺癌和癌旁正常组织的差异基因分析;D:利用V e n n图获取3组D E G s的重叠基因。图2 肺腺癌差异基因分析建立预后模型,基因筛选过程见图3 A、B。模型风险评分 的 计 算 公 式:风 险 评 分=(-0.0 0 29)G L B 1 L 3表达量+(-0.0 3 52)TMEM 6 3 C表达量+0.1 4 57F AM 8 3 A表达量+0.0 0 46G PX 2表达量。计算出每个样本的风险评分值,依据中位值将样本分为高风险组和低风险组。KM曲线分析结果显示,高风险组生存率较低(HR=1.9 3 2,9 5%C I=1.4 3 32.6 0 6,P0.0 5)(图3 C)。R O C曲线分析显示,风险评分预测病人1、3、5年生存率的曲线下面积(AU C)分别为0.7 0 0、0.6 5 8和0.6 2 2(图3 D)。单因素C o x风险比例回归分析显示,在3 1个重叠基因中,G L B 1 L 3、TMEM 6 3 C、F AM 8 3 A是肺腺癌的预后特征基因(图3 E)。相关性分析结果显示,E G F R突变与G L B 1 L 3和TMEM 6 3 C呈正相关(r=0.3 8 31、0.3 8 26,P0.0 5)(图3 F)。4期朱明雪,等.E G F R突变对肺腺癌预后及治疗意义生物信息分析5 2 52.5 肺腺癌E G F R突变与免疫细胞关系免疫细胞评分热图显示,有6种免疫细胞在E G F R突变型和野生型肺腺癌中的分布差异具有显著性(P0.0 5),其中C D 8+T细胞分布差异最大(图4 A)。利用C I B E R S O R T算法估算2 2种免疫细胞在肺腺癌样本中的浸润丰度,其中C D 8+T细胞的浸润丰度最大(图4 B)。分析预后特征基因与免疫细胞的相关性,其中B细胞和C D 4+T细胞均与G L B 1 L 3、TMEM 6 3 C有显著相关性(P0.0 1)(图4 C)。A:L A S S O回归系数分布图,取最小值时对应的基因数为4个;B:根据十折交叉验证结果选择最优值,在值最小时筛选出4个基因;C:高、低风险组的KM生存曲线;D:预后风险模型预测病人1、3、5年总生存率的RO C曲线与AU C;E:单因素C o x风险比例回归分析预后特征基因;F:预后特征基因与E G F R突变的相关性。图3 L A S S O-C o x预后风险模型构建及评价A:免疫细胞评分热图,*P0.0 5,*P0.0 1,*P0.0 0 1;B:肿瘤免疫浸润细胞在每个样本中的百分比丰度;C:预后特征基因与免疫细胞的相关性分析。图4 肺腺癌E G F R突变与免疫细胞关系2.6 肺腺癌E G F R突变与铁死亡基因关系在E G F R突变型和野生型肺腺癌中,A T L 1、S L C 7 A 1 1、G L S 2等1 0个铁死亡基因表达差异具有显著性(t=1.8 9 63.7 6 5,P0.0 5)(图5)。图5 铁死亡相关基因在E G F R突变型及野生型肺腺癌组织中的表达热图3 讨 论肺腺癌是肺癌最常见的类型。E G F R基因突变是导致肺腺癌发生的重要因素。E G F R突变型肺腺癌病人预后较差1 0-1 2。即使临床上广泛应用E G F R-T K I治疗E G F R突变型肺腺癌病人,最终也不可避免产生耐药性,进而影响预后。本研究通过生物信息学分析探讨E G F R突变与肺腺癌预后、免疫细胞浸润和铁死亡的关系,以期为E G F R突变型肺腺癌的治疗提供思路。本研究生物信息学分析显示,E G F R在肺腺癌中的体细胞突变率为1 1.6 4%。一项口腔肿瘤研究结果表明,吸烟可以上调E G F R信号,并且能够促进体外和体内口腔肿瘤的发生1 3。本文研究结果显示,E G F R突变与肺腺癌病人性别和吸烟有关,进一步印证了E G F R与吸烟的关系。本研究建立 5 2 6青 岛 大 学 学 报(医 学 版)5 9卷了预后风险模型,并且发现G L B 1 L 3、TMEM 6 3 C、F AM 8 3 A是肺腺癌的预后特征基因,这3个基因或将成为未来预测肺腺癌预后的重要因子。进一步分析发现,E G F R突变与G L B 1 L 3、TMEM 6 3 C呈正相关,这2个基因的表达或许促进了E G F R的突变,下一步可以通过细胞和动物实验进行验证。免疫疗法具有提高肿瘤缓解率、毒副作用小的特点。然而不同E G F R突变状态的肿瘤对免疫治疗的反应不同。T细胞在肿瘤细胞免疫中起到中心调控作用1 4。C D 8+T细胞作为效应细胞,其在免疫微环境中的比例升高通常与病人的良好预后相关1 5。本研究结果显示,肺腺癌组织中C D 8+T细胞比例较高,且与E G F R突变状态相关,预后特征基因与B细胞和C D 4+T细胞具有显著相关性,表明E G F R突变可能通过影响免疫细胞浸润进而影响免疫治疗。铁死亡是一种铁依赖性的细胞程序性死亡,它通过改变细胞代谢方式,使细胞大量积累脂质过氧化物和活性氧来诱导细胞程序性死亡1 6。既往有研究表明,肺癌组织中血清铁蛋白的表达普遍增高,血清铁蛋白的高表达在肺癌的远处转移中起着重要作用,并导致较差的远期预后1 7-1 8。本研究结果显示,铁死亡相关基因C I D S 1和A T P 5 MC 3与E G F R突变具有显著相关性,这或许提示铁死亡对于肺腺癌的重要作用可细分至E G F R基因的突变状态。综上所述,E G F R突变与肺腺癌的不良预后相关,且与肿瘤免疫细胞浸润和铁死亡存在紧密联系,这为肺腺癌的进一步研究和治疗提供了新思路。参考文献1HOWL A D E RN,F O R J A ZG,MOO R A D I ANMJ,e t a l.T h ee f f e c to f a d v a n c e s i n l u n g-c a n c e r t r e a t m e n t o np o p u l a t i o nm o r-t a l i t yJ.T h eN e w E n g l a n dJ o u r n a lo fM e d i c i n e,2 0 2 0,3 8 3(7):6 4 0-6 4 9.2S I E G E LRL,M I L L E R K D,J EMA L A.C a n c e rs t a t i s t i c s,2 0 2 0J.C A:aC a n c e r J o u r n a l f o rC l i n i c i a n s,2 0 2 0,7 0(1):7-3 0.3GOUV I NHA SC,D E ME L L O R A,O L I V E I R A D,e ta l.L u n gc a n c e r:ab r i e f r e v i e wo f e p i d e m i o l o g ya n ds c r e e n i n gJ.F u t u r eO n c o l o g y,2 0 1 8,1 4(6):5 6 7-5 7 5.4THA IA A,S O L OMON BJ,S E QU I S T L V,e ta l.L u n gc a n c e rJ.L a n c e t,2 0 2 1,3 9 8(1 0 2 9 9):5 3 5-5 5 4.5HA R R I S ONPT,VY S ES,HUAN GP H.R a r ee p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r(E G F R)m u t a t i o n si nn o n-s m a l lc e l ll u n gc a n c e rJ.S e m i n a r si nC a n c e rB i o l o g y,2 0 2 0,6 1:1 6 7-1 7 9.6L E ON E T T IA,S HA RMAS,M I NA R IR,e ta l.R e s i s t a n c em e c h a n i s m st oo s i m e r t i n i bi n E G F R-m u t a t e dn o n-s m a l lc e l ll u n gc a n c e rJ.B r i t i s hJ o u r n a lo fC a n c e r,2 0 1 9,1 2 1(9):7 2 5-7 3 7.7WUSG,S H I HJY.M a n a g e m e n to fa c q u i r e dr e s i s t a n c et oE G F R T K I-t a r g e t e dt h e r a p yi na d v a n c e dn o n-s m a l lc e l l l u n gc a n c e rJ.M o l e c u l a rC a n c e r,2 0 1 8,1 7(1):3 8.8 张祥鑫,董星星,耿涛,等.基于与铁死亡相关基因的肺腺癌的新型预后模型构建J.医学信息,2 0 2 1,3 4(1 5):9 6-1 0 1.9T A B NAKP,HA J I E S MA I L P OO RZ,S O R AN EHS.F e r r o p-t o s i s i n l u n gc a n c e r:f r o m m o l e c u l a rm e c h a n i s m s t op r o g n o s t i ca n dt h e r a p e u t i c o p p o r t u n i t i e sJ.F r o n t i e r si n O n c o l o g y,2 0 2 1,1 1:7 9 2 8 2 7.1 0YUAN W Q,WE IF,OUYAN G H Q,e ta l.CMTM 3s u p-p r e s s e sc h o r d o m ap r o g r e s st h r o u g hE G F R/S T A T 3r e g u l a t e dEMTa n dT P 5 3s i g n a l i n gp a t h w a yJ.C a n c e rC e l l I n t e r n a t i o-n a l,2 0 2 1,2 1(1):5 1 0.1 1S UNJ,C HE N L,D ON G M.m i R-3 3 8-5 pi n h i b i t sE G F-i n-d u c e dEMTi np a n c r e a t i c c a n c e r c e l l sb y t a r g e t i n gE G F R/E R Ks i g n a l i n gJ.F r o n t i e r s i nO n c o l o g y,2 0 2 1,1 1:6 1 6 4 8 1.1 2高楚伊,聂俊,朱颖,等.E G F R突变对云南省晚期肺腺癌疗效及预后影响的真实世界研究J.实用肿瘤杂志,2 0 2 1,3 6(1):3 7-4 2.1 3T S OU H H,T S A IH C,C HU CT,e ta l.C i g a r e t t es m o k ec o n t a i n i n ga c r o l e i nu p r e g u l a t e sE G F Rs i g n a l i n gc o n t r i b u t i n g t oo r a l t u m o r i g e n e s i s i nv i t r oa n di nv i v oJ.C a n c e r s,2 0 2 1,1 3(1 4):3 5 4 4.1 4燕翔,赵晓,焦顺昌,等.晚期肺腺癌患者一线化疗后T淋巴细胞亚群变化及临床意义J.中国肺癌杂志,2 0 1 2,1 5(3):1 6 4-1 7 1.1 5T O GA S H IY,S H I T A R AK,N I S H I KAWAH.R e g u l a t o r yTc e l l si nc a n c e ri mm u n o s u p p r e s s i o n-i m p l i c a t i o n sf o ra n t i c a n c e rt h e r a p yJ.N a t u r eR e v i e w sC l i n i c a lO n c o l o g y,2 0 1 9,1 6(6):3 5 6-3 7 1.1 6D I X ONSJ,S T O C KWE L LBR.T h eh a l l m a r k so f f e r r o p t o s i sJ.A n n u a lR e v i e wo fC a n c e rB i o l o g y,2 0 1 9,3:3 5-5 4.1 7YAN GJS,L I NLG,J I AN G W T,e ta l.E a r l yd i a g n o s i so fl u n gc a n c e r i nt h ee l d e r l yu s i n g f o u r t u m o rm a r k e r s a n ds e r u mf e r r i t i nf o rb e t t e rs u r g i c a lm a n a g e m e n tJ.A s i a nJ o u r n a lo fS u r g e r y,2 0 2 0,4 3(1 1):1 0 8 8-1 0 8 9.1 8R AM R E Z-C A RMONA W,D A Z-F A B R E GA T B,YUR IYO S H I GA EA,e ta l.A r es e r u mf e r r i t i n l e v e l sar e l i a b l ec a n-c e rb i o m a r k e r?As y s t e m a t i c r e v i e wa n dm e t a-a n a l y s i sJ.N u-t r i t i o na n dC a n c e r,2 0 2 2,7 4(6):1 9 1 7-1 9 2 6.(本文编辑 马伟平)