IBS-D诊断及治疗的潜在靶点——脂质、类花生酸及胆汁酸类差异代谢物.pdf

中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023，39（8）：1467-1474杂志网址：http:/IBS-D诊断及治疗的潜在靶点脂质、类花生酸及胆汁酸类差异代谢物*于官正1，2，李鸿1，2，涂星1，张燕2，杨宝2，聂娟2（1湖北民族大学武陵山中药材检验检测中心，湖北 恩施 445000；2湖北民族大学医学部，湖北 恩施 445000）摘要 目的：探讨多因素（母婴分离联合束缚应激与醋酸直肠刺激及番泻叶灌胃）复合诱导腹泻型肠易激综合征（IBS-D）大鼠模型结肠组织内源性差异代谢物，寻找IBS-D诊断和治疗的潜在作用环节和靶点。方法：将SD大鼠随机分为正常（normal）组与模型（model）组，以母婴分离联合束缚应激与直肠醋酸刺激及番泻叶灌胃诱导IBS-D大鼠模型。对大鼠进行一般行为学观察、粪便Bristol评分、粪便含水量测定及腹部回缩反射（AWR）评分压力阈值并观察肠组织病理变化；采用超高效液相色谱-串联三重四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术测定大鼠肠组织内源性代谢物的表达，通过主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）筛选潜在差异代谢物，MetaboAnalyst 5.0进行代谢通路分析。结果：与正常组比较，模型组大鼠一般行为学评分与AWR评分压力阈值显著降低（P0.05），粪便Bristol评分及粪便含水量显著升高（P0.05），结肠组织上皮细胞未见脱落，无炎症细胞浸润，无水肿，肌纤维结构紧密，杯状细胞大小整齐，隐窝和绒毛无消融现象。在大鼠结肠组织中鉴定出76个差异代谢物，包括磷脂酰乙醇胺、前列腺素E1、胆酸等，与甘油磷脂代谢和醚脂代谢等代谢通路密切相关。结论：母婴分离联合束缚应激与直肠醋酸刺激及番泻叶灌胃多因素复合诱导的IBS-D大鼠模型具有典型的腹痛、腹泻等症状，且肠组织无病理学改变，高度拟合其临床特征。脂质、类花生酸及胆汁酸类代谢物在IBS-D大鼠中存在着明显的差异性调节，可能是其发病的潜在靶点及临床诊疗可筛选的潜在指标。关键词 腹泻型肠易激综合征；代谢组学；超高效液相色谱-串联三重四极杆飞行时间质谱；脂质代谢；类花生酸类；胆汁酸类中图分类号 R363.2；R574 文献标志码 A doi：10.3969/j.issn.1000-4718.2023.08.015Potential targets for diagnosis and treatment of IBS-D,differential metabolites of lipids,eicosanoids and bile acidsYU Guanzheng1，2，LI Hong1，2，TU Xing1，ZHANG Yan2，YANG Bao2，NIE Juan2（1Chinese Medicinal Materials Products Quality Supevision and Inspection Center in Wuling Mountainous Area，Enshi 445000，China；2Health Science Center，Hubei Minzu University，Enshi 445000，China.E-mail：）ABSTRACT AIM：To explore the endogenous differential metabolites in colon tissue of diarrhea-type irritable bowel syndrome（IBS-D）rats induced by multiple factors（maternal separation combined with restraint stress，acetic acid stimulation of rectum and folium sennae by intragastric administration），so as to search for the potential links and targets for the diagnosis and treatment of IBS-D.METHODS：SD rats were divided into control group and IBS-D（model）group randomly.The IBS-D rat were induced by maternal separation combined with restraint stress，acetic acid stimulation of rectum and folium sennae by intragastric administration.General behavioral observations，Bristol integral system，moisture of the feces and AWR score pressure threshold of rats were performed，and the pathological changes of intestinal tissues were observed by HE and AB-PAS.Endogenous metabolites in colon tissue was detected by UPLC-Q-TOF-MS and the endogenous differential metabolites were analyzed by principal component analysis and orthogonal partial least squares discriminant analysis.The metabolic pathways were established by MetaboAnalyst 5.0 software.RESULTS：Comparing with control group，the general behavioral score and AWR score pressure threshold of rats in IBS-D group decreased significantly（P0.05），while Bristol integral system and moisture of the feces increased significantly（P0.05）.There were not shed of epithelial cells in the colon tissue，no infiltration of inflammatory cells and edema.The structure of muscle fi文章编号 1000-4718（2023）08-1467-08 收稿日期 2023-04-27 修回日期 2023-07-13*基金项目 湖北省教育厅科学技术研究项目（No.B2022097）；湖北民族大学2022年揭榜挂帅资助项目（No.JB22003）；湖北省科技厅科学技术研究项目（No.2022BCE043）；恩施州科技项目技术支撑类重点项目（No.D20220065）通讯作者 Tel：[phone]；E-mail：1467bers was compact，the size of goblet cells was neat，and there was no ablation of crypts and villi.Metabolomics analysis identified 76 different metabolites in rat intestinal tissues，including phosphatidyl ethanolamine，prostaglandin E1，cholic acid，etc.The main metabolic pathways involved were glycerophospholipid metabolism and ether lipid metabolism.CONCLUSION：The IBS-D rat model induced by maternal separation combined with restraint stress，acetic acid stimulation of rectum and folium sennae by intragastric administration showed typical symptoms such as abdominal pain，diarrhea，and no pathological changes in colon，which highly fit its clinical characteristics.Significant differential regulation of lipids，eicosanoids and bile acids metabolites exist in IBS-D rats，which may be the pathological potential targets and diagnostic potential indicator in basic research and clinical practice of IBS-D.KEY WORDS diarrhea-type irritable bowel syndrome；metabolomics；ultra-high-performance liquid chromatography tandem triple quadrupole time-of-flight mass spectrometry；lipid metabolism；eicosanoids；bile acids腹 泻 型 肠 易 激 综 合 征（diarrhea-type irritable bowel syndrome，IBS-D）属于肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）分型之一，以持续或间歇性腹痛、腹泻或腹部不适且肠组织无器质性病变为主要临床特征，受到外界刺激后症状会加重，多发于2050岁中青年人群，是一种跟心理因素息息相关的功能性胃肠疾病1-3。IBS-D发病机制复杂，肠道生理和内脏敏感性的变化是其主要原因4。目前IBS-D动物模型诱导手段多样，单因素造模方法在模型稳定性与重复性方面略显欠缺5，通过多因素复合造模方法建立稳定性强、持续性好的IBS-D动物模型，对于 IBS-D 的病因及发病机制研究、临床治疗意义重大。代谢组学技术可从整体上综合分析生物样品中的内源性代谢物及代谢途径变化，可快速、精准地筛选潜在生物标志物，分析机体状态6。目前针对IBS-D主要集中于粪便代谢组学分析，初步发现其粪便胆汁酸类代谢、不饱和脂肪酸代谢、氨基酸代谢等代谢途径可能与IBS-D的发生、发展及转归有关，但其肠组织代谢组学特征尚未见相关报道。基于此，本研究拟以多因素（母婴分离、束缚应激、醋酸直肠刺激和番泻叶灌胃）诱导的 IBS-D大鼠模型为研究对象，采用超高效液相色谱-串联三重四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）代谢组学技术从结肠组织内源性差异代谢物及代谢通路的角度分析其代谢组学特征，挖掘主要代谢途径，为IBS-D的病因研究及临床诊疗提供理论支撑。材料和方法1动物SPF级健康SD乳鼠3窝（每窝乳鼠不少于8只），性别不限，在温度（262），湿度55%75%，12 h/12 h光暗体系的环境下饲养，购自辽宁长生生物科技有限公司，许可证号：SCXK（辽）2020-0001。适应性喂养1周，进食、饮水自由，生存状态良好，经湖北民族大学生物医学科研伦理审查通过（编号：2022004）。2仪器与试剂Acquity UPLC 液相色谱仪、Xevo G2-XS Q-TOF质 谱 仪（waters）；微 量 冷 冻 离 心 机（OHAUS，FC5515R）；电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，XPR226CDR/AC）；高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技股份有限公司，SCIENTZ-48）；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，KQ-500DE）反渗透超纯水系统（美国密理博中国有限公司，Milli-Q integral）；远红外快速水分测定仪（梅特勒-托利多仪器有限公司，HC103/02）；偏光显微镜成像系统（奥林巴斯中国有限公司，BX53）。乙 酸（国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司，202010108）；乙腈（HPLC，上海安谱实验科技股份有限公司，D3721440）；甲醇（HPLC，上海麦克林生化科技股份有限公司，C12581334）；液体石蜡（国药集团化学试剂有限公司，20170110）；番泻叶饮片（四川中庸药业有限公司，201101）。3方法3.1IBS-D大鼠模型制备与分组参考文献7-8采用母婴分离联合束缚应激、直肠醋酸刺激、番泻叶灌胃多因素诱导IBS-D大鼠模型。3窝乳鼠随机选取1窝作为正常（normal）组（n=8），其余进行造模。采用多因素（母婴分离联合束缚应激与醋酸直肠刺激及番泻叶灌胃）复合诱导IBS-D大鼠模型。母婴分离：乳鼠出生第7天起母婴分离，持续2周后按性别分笼；束缚应激法：自分笼后将大鼠每天固定时间束缚，每次约120 min，持续21 d；直肠醋酸刺激：自分笼后给予造模大鼠 0.05 mol/L 醋酸溶液灌肠，第 1 天给药0.1 mL，之后每天递增0.1 mL，达到0.5 mL后保持不变，持续14 d；番泻叶灌胃法：自分笼后按体重10 mL/kg给予造模大鼠0.5 g/mL番泻叶水提液灌胃，连续7 d。造模期间，正常组大鼠自由饮食饮水，不做任何处理。将造模成功大鼠作为模型（model）组（n=9），造模流程见图1。3.2大鼠一般行为学观察、粪便Bristol评分、粪便含水量及内脏敏感性测定根据文献方法8，观察1468记录各组大鼠的毛色、大便及精神状态等基本情况，进行半定量积分评分；收集大鼠粪便，采用Bristol分型积分评价每粒粪便的形态，将测定Bristol评分时段收集的粪便，测定含水量；造模后对各组大鼠通过直肠气囊扩张（colon rectal distension，CRD）实验进行腹部回缩反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）评分压力阈值测定。3.3大鼠肠组织HE染色及AB-PAS染色造模后处死大鼠并分离结肠组织，4%多聚甲醛固定液中固定，透明、包埋、切片、染色、封片后显微镜观察。3.4代谢组学样本处理取大鼠结肠组织按 1：5比例加入预冷的甲醇水（4 1）溶液置EP管中，高通量组织研磨机50 Hz研磨5 min，超声提取5 min后采用高速离心机，4 500 r/min 离心 15 min，取上清液，20 冰箱冷冻 24 h，13 000 r/min离心 15 min后取上清液50 L置进样瓶中，同时各样本各取20 L上清液制备质控（quality control，QC）样本。3.5 UPLC-Q-TOF-MS 条 件 色 谱 条 件：Acquity UPLC液相色谱仪、Acquity HSS T3色谱柱（100 mm2.1 mm，1.8 m）；0.1%甲酸乙腈（A）-水（B）梯度洗脱，洗脱程序为（0.01.5）min，2%A；（1.513.5）min，2%95%A；（13.517.0）min，95%100%A；（17.020.5）min，100%2%A；流速0.4 mL/min，柱温40，进样量5 L。质谱条件：Xevo G2-XS Q/TOF质谱仪，配备电喷雾离子源，毛细管电压 3.0 kV（2.5 kV），锥孔电压40 V（-40 V），脱溶剂气900 L/h，温度 550，锥孔气 50 L/h，扫描范围 m/z 501 000，亮氨酸脑啡肽用于实时校正，分别于正、负离子模式下采集数据。4统计学处理动物实验计量资料采用SPSS 26.0处理，数据符合正态分布，则采用均数标准差（meanSD）表示，方差齐性采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，自身前后对照采用配对t检验；若数据方差不齐则采用 Tamhanes T2法检验，以 P1.0，组间变化倍数1.50且P0.05为标准筛选生物标志物。根据精确分子量、自带数据库（mz Cloud）、HMDB 数据库鉴定差异代谢物，将差异代谢物导入 MetaboAnalyst 5.0软件中进行代谢通路富集分析。结果1大鼠一般行为学观察、粪便Bristol评分、粪便含水量及内脏敏感性变化由图2可知，造模后与正常组相比，模型组一般行为学评分显著降低（P0.05）；与造模前相比，造模后模型组评分显著降低（P0.05）。造模后与正常组相比，模型组大鼠粪便 Bristol 评分显著升高（P0.05）；与造模前相比，模型组大鼠粪便Bristol评分显著升高（P0.05）。造模后，与正常组相比，模型组大鼠粪便含水量明显上升（P0.05）；与造模前相比，模型组大鼠粪便含水量均显著上升（P0.05）。因腹部球囊扩张会引起内脏敏感性的升高，为减少对实验结果的干扰，造模前没有进行内脏敏感性测定，造模后与正常组相比，模型组大鼠AWR评分压力阈值明显降低（P0.05）。2大鼠肠组织HE染色及AB-PAS染色由HE染色可观察到各组大鼠肠组织结构基本正常，黏膜层上皮细胞排列整齐紧密，未见脱落；黏膜层隐窝结构正常，未见炎症细胞浸润；黏膜下层未见水肿；基层肌纤维结构紧密，未见异常；由AB-PAS染色可观察到各组大鼠肠组织杯状细胞大小整齐，不伴随充血，隐窝和绒毛无消融现象，结构正常，见图3。3IBS-D大鼠代谢组学分析3.1代谢轮廓分析通过PCA分析肠组织正、负离子模式下的代谢轮廓。如图4所示，QC样本紧密聚集，证明仪器具备良好精密度与稳定性；正常组与模Figure 1.Process of IBS-D rats model preparation图1IBS-D大鼠模型制备进程1469型组在95%的置信区间内各自聚集，组间分离，表示各组代谢物组间存在差异。结果表明，经多因素复合方法造模后，代谢物的种类或水平发生变化。Figure 2.Therapeutic indexes of rats in each group.MeanSD.n=8.P0.05 vs normal group；#P0.05 vs 3 weeks group.图2各组大鼠疗效指标Figure 3.HE staining and AB-PAS staining in intestinal tissue of rats in each group（scale bar=50 m）.图3各组大鼠肠组织HE染色及AB-PAS染色Figure 4.PCA scores plots of normal group and model group.A：the negative ion mode；B：the positive ion mode.QC represents the quality control group.图4正常组、模型组PCA得分图14703.2正交偏最小二乘法-判别分析基于 PCA 结果进行OPLS-DA分析。如图5所示，模型组与正常组在正、负离子模式下均显著分离，各自聚集，肠组织样本在正离子模式 R2Y=0.875，Q2=0.692，负离子模式下 R2Y=0.979，Q2=0.691；表示模型拟合度与预测能力较好。置换检验分析肠组织样品，显示Q2 所在回归线与Y轴截距均0，表明模型未发生过度拟合，质量高。3.3差异代谢物的鉴定根据代谢物的峰面积、FC值及P值大小绘制火山图，见图6。以FC1.50且P1为条件进行差异代谢物的筛选，经文献查阅及HMDB数据库分析，鉴定出大鼠结肠组织中76个差异代谢物。将筛选出的代谢物绘制热图，直观显示组间差异，见图7。4代谢通路分析将筛选的差异代谢物录入MetaboAnalyst5.0分析代谢通路，以Impact0.1，P0.05为条件，筛选出IBS-D模型组与正常组差异代谢产物相关通路，富集最显著的为甘油磷脂代谢、醚脂代谢，见表1、图8。讨论IBS-D作为一种胃肠功能紊乱性疾病，以腹痛、腹泻为主要特点，且常伴随精神、心理异常，尚未发现器质性病变。近年来，全球范围内IBS-D发病率逐步增加，至今仍未研发出安全高效的治疗药物，迁延Figure 5.OPLS-DA score plots of inter-group and the 200 iterations permutations test.A：the negative ion mode；B：the positive ion mode.图5组间OPLS-DA得分图及200次置换检验Figure 6.Volcanic map of metabolites in rat colon tissue.A：the negative ion mode；B：the positive ion mode.图6大鼠结肠组织代谢物火山图1471难愈反复发作，严重降低患者生活质量，加重患者心理负担9-10。本研究发现，以母婴分离联合束缚应激、直肠醋酸刺激、番泻叶灌胃诱导的IBS-D大鼠模型一般行为学评分及AWR压力阈值显著降低，表明大鼠出现扎堆、易激惹、毛发枯燥等异常精神状态，内脏敏感性升高等腹痛、腹部不适症状；粪便Bristol评分及粪便含水量显著升高，出现腹泻症状；HE染色及AB-PAS染色显示肠组织黏膜层上皮细胞无脱落，未出现炎症细胞浸润，黏膜下层未见水肿，基层肌纤维结构紧密，杯状细胞大小整齐，不伴随充血，隐窝和绒毛无消融现象，结构正常，提示模型组大鼠肠组织未出现病理学改变。该研究结果表明多因素复合造模法诱导的IBS-D大鼠模型具有临床特征高度拟合性11-12。基于 UPLC-Q-TOF-MS 代谢组学技术在大鼠肠组织中鉴定出76个差异代谢物，主要属于脂质、氨基酸、甘油磷脂等类。与正常组比较，模型组L-丝氨酸（L-Serine）、溶血磷脂酰丝氨酸 LysoPS（18：2）、次黄嘌呤（hypoxanthine）等16个代谢物显著上调（P0.05），皮质醇酮（cortexolone）、血栓素B2（thromboxane B2）、腺苷基琥珀酸（adenylosuccinic acid）等60个成分显著下调（P0.05），差异代谢物在甘油磷脂代谢、醚脂代谢等代谢通路上富集显著，提示经多因素复合方法造模后，大鼠内源性代谢物水平发生改变，与正常组存在差异。代谢通路富分析结果与本实验前期基于网络药理学研究四君子汤与痛泻要方同病异治IBS-D得出的主要信号通路相互关联13。脂质主要包含磷脂、甘油三酯、胆固醇、鞘脂等，是构成生Figure 7.Heatmaps based on different metabolites.图7差异代谢物热图表1差异代谢物代谢通路Table1.Metabolic pathways involved in differential metabolitesPathwayGlycerophospholipid metabolismEther lipid metabolismAminoacyl-tRNA biosynthesisGlycine，serine and threonine metabolismTotal36204834Hits4211P value0.0000.0120.3440.257Impact0.2590.1450.1670.207Figure 8.Metabolic pathways involved in differential metabolites.图8差异代谢物代谢通路1472物体的基本物质之一，体内脂质代谢复杂多样，受机体各方面因素影响与调控14。樊燕婷15基于UPLC-QTOF-MS/MS技术及脂质组学方法对 IBS-D 大鼠脂质代谢物进行分析，发现IBS-D大鼠脂质代谢轮廓变化显著，多个潜在生物标志物相对丰度异常变化。本研究鉴定出的76个差异代谢物中以脂质类居多，包括磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）、神经酰胺（ceramide，Cer）、磷脂酰胆碱（phosphatidyl cholines，PC）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）等磷脂类成分，结合本研究代谢组学分析结果，推测回调脂质代谢的相对丰度可能对IBS-D有一定治疗效果，可为临床治疗IBS-D提供思路与借鉴。类花生酸是多不饱和脂肪酸花生四烯酸的代谢产物，不饱和脂肪酸可以通过调控脂质代谢使机体免疫得到增强，还可促进肠道内益生菌如双歧杆菌、乳酸杆菌等含量的增加16，前列腺素等表达水平异常与肠道敏感性增强密切相关17-18。本研究鉴定出前列腺素E1（prostaglandin E1）、前列腺素A2（prostaglandin A2）、血栓素B2（thromboxane B2）等5个类花生酸类差异代谢物，推测类花生酸代谢异常与IBS-D发病切相关。研究表明，适量的胆汁酸可促进肠道蠕动，加快肠道内脂类的消化，但当胆汁酸含量过高时则会引起腹泻。胆汁酸还可发挥杀菌作用，胆汁酸过量是引起肠道高敏，产生痛觉的主要原因之一19。据统计，有超过 60%的 IBS-D 患者伴随胆汁酸异常20，上调的胆汁酸能够促进机体 5-HT 的释放，进一步与肠黏膜内神经元上的 5-HT3R 受体结合，在外周敏化机制的作用下，使内脏敏感性增强21-22。本研究鉴定出胆酸（cholic acid）、3-氧代胆酸（3-oxocholic acid）、胆基组氨酸（cholylhistidine）3个胆汁酸及其衍生物类差异代谢物，在模型组中显著上调（P0.05）。基于此，推测胆汁酸代谢异常导致的内脏高敏可能为IBS-D发病机制之一。综上所述，本研究采用母婴分离联合束缚应激、直肠醋酸刺激和番泻叶灌胃多因素诱导的IBS-D动物模型，具有IBS-D典型的腹痛、腹泻等症状，且肠组织无病理学改变，符合IBS-D的临床症状，但其结肠组织代谢组学上存在显著差异，可能是其发病的潜在靶点及临床诊疗可筛选的潜在指标。后续可结合肠道菌群、血清及粪便多代谢组学对其深入研究，以适宜的药物进行干预，观察相关代谢产物的调节情况，充分验证脂质、类花生酸及胆汁酸类差异代谢物在IBS-D发生、发展及转归中的角色。参考文献1刘良浩，蒋志滨，于海洋，等.黄连素缓解肠易激综合征作用机制的研究进展J.中国病理生理杂志，2022，38（5）：944-948.Liu LH，Jiang ZB，Yu HY，et al.Research progress in mechanisms underlying attenuation of irritable bowel syndrome by berbrineJ.Chin J Pathophysiol，2022，38（5）：944-948.2杨焱麟，陈敏，周彦妮，等.P物质与肝郁脾虚型腹泻型肠易激综合征关系及中医药调控的研究进展 J.中华中医药学刊，2021，39（9）：82-85.Yang YL，Chen M，Zhou YN，et al.Research progress of substance P，liver stagnation and spleen deficiency type of IBS-D and traditional Chinese medicine regulation J.Chin Arch Tradit Chin Med，2021，39（9）：82-85.3何苏月，马卓琳，范昕然，等.机械敏感性离子通道Piezo1参与慢性避水应激肠易激综合征大鼠内脏高敏感性和 5-羟色胺代谢异常 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