miR-122-5p靶向调控人骨髓间充质干细胞诱导成骨分化的分子机制研究.pdf

中医康复2024年1月 第1卷 第1期Traditional Chinese Medicine Rehabilitation,Jan.2024,Vol.1,No.1miR-miR-122122-5 5p p靶向调控人骨髓间充质干细胞诱导成骨分化靶向调控人骨髓间充质干细胞诱导成骨分化的分子机制研究的分子机制研究*蔡立雄，缪忠绿（佛山市中医院，广东 佛山528051）摘摘要要 目的目的：研究miR-122-5p对人骨髓间充质干细胞hBMSCs细胞成骨分化诱导的作用分子机制。方法方法：运用茜素红S、碱性磷酸酶活性ALP染色试剂盒检测hBMSCs成骨分化的钙结节与成骨活性；使用双荧光素酶报告基因实验验证miR-122-5p与 BRCC3之间的靶向关系；运用 qRT-PCR分别检测Runx2、Osterix、wnt3a、-catenin、GSK3-、miR-122-5以及BRCC3基因的表达情况；Western 印迹检测-catenin蛋白的表达量。结果结果：过表达miR-122-5p对人骨髓间充质干细胞hBMSCs细胞成骨分化诱导21天后的钙结节与干细胞成骨活性均有明显促进作用，对成骨分化中wnt/-catenin信号通路主要转录因子Runx2、Osterix及wnt3a、-catenin、GSK3-主要基因均激活作用，过表达BRCC3对干细胞成骨分化中wnt/-catenin信号通路主要转录因子Runx2、Osterix及wnt3a、-catenin、GSK3-主要基因有抑制作用；并且通过双荧光素酶报告基因与回复性实验确定miR-122-5p与 BRCC3之间的靶向关系，差异均有统计学意义（P0.05）。结论结论：miR-122-5p靶向抑制BRCC3 的表达诱导hBMSCs细胞通过wnt/-catenin通路进行成骨分化诱导。关键词关键词 miR-122-5p；人骨髓间充质干细胞；成骨分化；wnt/-catenin信号通路 中图分类号中图分类号 R R966966 文献标识码文献标识码 B B 文章编号文章编号 20972097-31283128(20242024)0101-00260026-0606DOIDOI：1010.1978719787/j/j.issnissn.20972097-31283128.20242024.0101.006006Study on The Molecular Mechanism of MiR-Study on The Molecular Mechanism of MiR-122122-5 5p Targeted Regulation of Osteogenic Differentiation Inducedp Targeted Regulation of Osteogenic Differentiation Inducedby Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cellsby Human Bone Marrow Mesenchymal Stem CellsCAI Li-xiong,MIAO Zhong-lu(Foshan hospital of TCM,Foshan,Guangdong 528051)AbstractObjectiveAbstractObjective:To explore the role and mechanism of miR-122-5p on the osteogenic differentiation of hBMSCs.MethodsMethods:we investigated therole of miR-122-5p in osteogenic differentiation by alkaline phosphatase staining and Alizarin red staining，Dual luciferase reporter gene assay wasused to verify the targeting relationship between miR-122-5p and BRCC3,Expression of Runx2、Osterix、wnt3a、-catenin、GSK3-、miR-122-5 andBRCC3 mRNA in hBMSCs were detected by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-qPCR).Western blot was used to detect the expression of-catenin protein.ResultsResults:The over expression of MiR-122-5p significantly promoted the activation of alkaline phosphatase(ALP)and formation of calcified nodules in osteoblasts,The mRNA expressions of-catenin、Runx2、Osterix、wnt3a、GSK3-and the protein expression of-catenin were significantly higher than those in control group.The dual-luciferase reporter gene experiment confirmed that BRCC3 was thedownstream target gene of miR-122-5p.At the same time,inhibited osteogenic differentiation was also observed after BACC3 overexpression,the expression levels of-catenin、Runx2、Osterix、wnt3a、GSK3-were inhibited.ConclusionConclusion:miR-122-5p can promote osteogenic differentiation of hBMSCs,and targeting BACC3affects the activation of the wnt/-catenin signaling pathway and regulates the process of osteoporosis treatment.KeywordsKeywordsMiR-122-5p;BRCC3;wnt/-catenin signaling;osteoporosis骨质疏松症（Osteoporosis,OP）是一类以骨代谢失衡造成的病理生理性疾病，其表现为成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞异常骨吸收导致1。随着我国老龄化的加重，骨质疏松的发病率出现每年急剧上升的趋势，据统计显示，我国骨质疏松发病率已经达到25%，其患者也是高达1.4亿人次2。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是一类具有良好增殖效能与多项分化潜能的母细胞，可在特定的诱导环境下使细胞定向发生聚集、迁移，并且诱导分化为成骨细胞，完成骨组织修复与重建等3。目前有研究者通过对 BMSCs等干预诱导其向成骨细胞定向分化，促进成骨细胞的形成来达到预防甚至治疗骨质疏松症4。BRCC3（BRCA1/BRCA2-Containing ComplexSubunit 3）是一种含锌的金属蛋白酶，是 JAMM/MPN+蛋白酶家庭成员之一，参与 DNA 损伤修改以及调控细胞周期5。BRCC3 的主要研究多集中在心血管方面6，有研究表明BRCC3可能是一种新型的心脏保护机制7，但BRCC3在骨质疏松症方面的研究尚少，我们前期发现BRCC3 可以通过调控-catenin 通路影响成骨细胞的分化；miR-122-5p 与BRCC3的作用机制曾在尿酸肾病中有少许报道8，在骨质疏松症方面亦未见阐明。本研究以骨髓间充质干细胞为研究对象，通过对骨髓间充质干细胞*基金项目基金项目：佛山市科技局医学类科技攻关项目（NO.1920001001298）作者简介作者简介：蔡立雄（1985-），男，博士，副主任中医师，研究方向：中西医结合治疗骨与关节损伤疾病。26第1期蔡立雄 等miR-122-5p靶向调控人骨髓间充质干细胞诱导成骨分化的分子机制研究中miR-122-5p、BRCC3的过表达处理，阐明其对骨髓间充质干细胞向成骨分化的作用机制。1 1材料与方法材料与方法1.1 细胞培养 hBMSCs从塞业生物科技有限公司（中国广州）购买，细胞正常培养于37、5%CO2、95%湿度的培养箱中，当细胞增殖到80%密度左右时，进行传代处理，培养期间每 2天更换一次培养基；hBMSCs成骨分化诱导试验，采用赛业的成骨分化诱导液体进行成骨分化诱导，将 hBMSCs 以 2104/cm2的密度进行接种，细胞增殖至80%左右的密度后，更换成骨分化诱导液进行诱导，诱导过程中，每个三天更换一次培养基。成骨分化诱导的hBMSCs选用第6代的细胞进行。1.2 细 胞 转 染 miR-122-5p 模 拟 物（miR-122-5pmimics）和阴性对照（miR-NC），BRCC3过表达质粒（BRCC3）均由上海吉玛公司构建;正常培养hBMSCs细胞用胰蛋白酶消化细胞后接种于6孔板，调整细胞密度为2104/cm2，并且更换成骨分化诱导液开始诱导，待细胞生长至80%融合时，按照脂质体LipofectamineTM 2000 说明书操作步骤要求转染至hMSCs细胞，分别标记为OM+miR-122-5p组、OM+miR-NC 组、OM+BRCC3 组、OM+miR-122-5p+BRCC3组，转染48 h后，用qRT-PCR检测转染效率。转染成功后，用于后续试验。1.3 双荧光素酶报告基因实验验证 miR-122-5p 与BRCC3的靶向关系 StarBase生物信息学网站预测miR-122-5p与BRCC3 mRNA 3 非翻译区（untranslated region,UTR）之间的结合位点。将有预测靶位点的 BRCC3 3 UTR 野生序列或突变序列扩增后插入pGL3启动子载体中以构建荧光素酶报告载体（BRCC3 WT 和 BRCC3MUT）。将 hBMSCs 以 2104/cm2密度接种于 24孔板上，培养 24 h 后，使用荧光素酶报告载体与miR-122-5p模拟物或miR-NC共转染细胞。48 h后，使用双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。1.4 成骨分化诱导检测 采用细胞碱性磷酸酶活性ALP和细胞外钙沉积茜素红S染色试剂盒检测，碱性磷酸酶活性 ALP染色试剂盒和钙沉积茜素红 S（ARS）染色试剂盒说明书操作进行（上海杰美生物有限公司），染色后用显微镜观察拍照。其中钙得率定量检测方法，用 10%氯化十六烷吡啶溶解15min后，将其置于562nm的酶标仪下检测其光密度（OD）值，计算其成骨分化率；碱性磷酸酶活性定量分析检测方法，将提取细胞用RIPA溶剂进行分解细胞样本，高速低温离心后获得蛋白上清液，再通过ALP活性检测试剂盒（上海碧云天生物技术科技有限公司），检测各细胞样本中的ALP活性。1.5 qRT-PCR实验 取各组hBMSCs细胞样本，按照RNA 抽提试剂盒说明书要求提取 RNA，并对各样本进行定量测定，然后按逆转录试剂盒说明书操作合成 cDNA。最后按 qRT-PCR 试剂盒说明书操作进行基因检测。结果采用2Ct 计算方法，检测各组样本之间的各基因的表达含量。1.6 Western Blot蛋白印迹实验 收集各组hBMSCs细胞样本，加入含PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30 min。12000 r/min离心10 min，取上清置于空白EP管，对其溶液采用BCA蛋白含量测定方法测定其各样本的蛋白含量，最后加入 5 X loadingbuffer上样缓冲液，100金属浴加热10 min，使蛋白充分稳定变性。将变性后的各组蛋白样本进行 SDS-PAGE蛋白电泳检测，蛋白电泳后对 SDS-PAGE胶进行转膜，将蛋白转移至PVDF膜上，转膜后用5%脱脂奶粉将膜室温封闭 2 h，洗膜，加入一抗（beita-catenin，GAPDH,美国 abcam），4过夜孵育，次日加相对应二抗，室温孵育 2 h，洗膜三次后，加ECL化学发光液，对PVDF膜进行曝光。1.7 统计学处理 用SPSS 20.0 统计软件对试验数据进行统计分析，计量资料以均值加减标准差（x s）表示，数据先进行正态性检验和方差齐性检验，多组间比较采用单因素方差分析。多组间及自身前后对照均值比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较方差齐时采用 LSD 检验，方差不齐时采用Dunnetts T3检验,以=0.05为检验水准。2 2结果结果2.1 miR-122-5p基因可促进hBMSCs向成骨分化诱导 成骨分化诱导21天后，茜素红结果显示如图1，其中转染阴性对照（miR-NC）的细胞组与诱导分化（OM）对照组相比较，其中茜素红S的结果没有明显影响，转染miR-122-5p的细胞组与转染miR-NC相比较，钙结节有明显的增多的趋势，并且对其钙结节用10%氯化十六烷吡啶溶解检测其钙的率，同样显示 miR-122-5p组的钙的率明显高于 miR-NC；碱性磷酸酶活性ALP结果如图2所示，转染miR-122-5p的细胞组与转染miR-NC相比较，成骨细胞活力在诱导21天后有明显的增升高。27中医康复2024年第1卷（1）对照组（2）空载组（3）转染组图1 三组成骨分化诱导茜素红S染色（100）（1）对照组（2）空载组（3）转染组图2 三组成骨分化诱导ALP染色（100)2.2 双荧光素酶报告基因实验结果 通过StarBases网站预测miR-122-5p的下游靶点，发现miR-122-5p与 BRCC3的非编码区之间存在互补序列，BRCC3:AGACUCC;miR-122-5p:UGUGAGG。与 miR-NC组相比，miR-122-5p 组 BRCC3WT 的荧光素酶活性显著下降（P0.05），而BRCC3 MUT 的荧光素酶活性没有影响。见图 3。预测 miR-122-5p与 BRCC3的非编码区互补序列如下：BCRR3 3UTR 5.UGUGAUCACACCACCACACUCCA.hsa-miR-122-5p 3 GUUGUGGUAACAGUGUGAGGUBCRR3 mut5.UGUGAUCACACCACCUGUGAGGA.2.3 过表达miR-122-5p 对hBMSCs向成骨分化诱导wnt/-catenin信号通路的影响 将处于正在对数期的hBMSCs的细胞进行miR-122-5p过表达，并同时进行成骨分化诱导，结果如图4所示，对成骨分化过的主要启动子基因 Runx2、Osterix 以及 wnt3a、-catenin、GSK3-、BRCC3 的基因表达，较 OM+NC组比较，OM+mir-122-5p组的各基因表达量均有明显升高（P0.05）。图3 相对双荧光素酶活性结果（1）Wnt-3a基因（2）-catenin基因（3）GSK3-基因（4）BRCC3基因（5）Osterix基因（6）Runx2基因图4 miR-122-5p对hBMSCs成骨诱导wnt/-catenin信号通路的影响 28第1期蔡立雄 等miR-122-5p靶向调控人骨髓间充质干细胞诱导成骨分化的分子机制研究2.4 过表达 BRCC3 对 hBMSCs 向成骨分化诱导wnt/-catenin信号通路的影响 将处于正在对数期的hBMSCs的细胞进行BRCC3过表达，并同时进行成骨分化诱导，结果如图5所示，对成骨分化过的主要启动子基因Runx2、Osterix以及wnt3a、-catenin、GSK3-、miR-122-5p 的基因表达，较 OM+NC 组比较，OM+BRCC3 组的各基因表达量均有明显抑制作用（P0.05）。（1）Wnt-3a基因（2）-catenin基因（3）GSK3-基因（4）miR-122-5p基因（5）Osterix基因（6）Runx2基因图5 BRCC3对hBMSCs成骨诱导wnt/-catenin信号通路的影响2.5 过表达 miR-122-5p 对 BRCC3 刺激 hBMSCs 成骨分化 wnt/-catenin 信号通路的影响 为了检测hBMSCs 成 骨 过 程 中，miR-122-5p 是 否 可 通 过BRCC3对wnt/-catenin信号通过进行分化诱导，对hBMSCs 细 胞 进 行 miR-122-5p 过 表 达 后，用BRCC3siRNA对细胞进行再处理。图7为茜素红S染色结果，加入BRCC3后，成骨过程钙结节明显收到抑制；图8碱性磷酸酶活性ALP结果显示成骨分化活力在BRCC3的影响下也明显减弱；图9为基因结果可见Runx2、Osterix、wnt3a、-catenin的基因表达含量在BRCC3的影响下显著降低，差异均有统计学意义（P0.05）。（1）对照组（2）miR-122-5p组（3）BRCC3组（4）miR-122-5p+BRCC3组图6 各组成骨分化诱导茜素红S染色（100）（1）对照组（2）miR-122-5p组（3）BRCC3组（4）miR-122-5p+BRCC3组图7 各组成骨分化诱导ALP染色（100）29中医康复2024年第1卷（1）Wnt-3a基因（2）-catenin基因（3）Runx2基因（4）Osterix基因图8 miR-122-5p对BRCC3刺激hBMSCs成骨分化wnt/-catenin信号通路的影响3 3讨论讨论众所周知，骨平衡的破坏是骨质疏松症发生的显著特征，而骨失衡主要又成骨细胞的骨形成与破骨细胞的骨吸收构成，骨髓间充质干细胞的多能潜分化效应可定向诱导的骨分化及促进成骨的骨形成3。因此本研究采用 hBMSCs 作为体外研究模型，探究miR-122-5p在骨质疏松症中的作用机制。BRCC3作为JAMM/MPN+蛋白酶家庭成员之一17，近年的主要的研究方向围绕心脑血管展开，而我们的前期研究，分析与骨质疏松相关芯片数据找出BRCC3为关键 Hub 基因，且通过实验验证BRCC3在骨质疏松患者成骨细胞表达高于正常成骨细胞，且BRCC3可以通过调控-catenin 通路影响成骨细胞的分化18。因此，本研究深入探讨miR-122-5p对干细胞成骨分化的调控机制是否是通过靶向BRCC3基因再调控Wnt/-catenin信号通路。据相关文献报道，在股骨头骨坏死模型中，过表达的miR-122-5p后，兔来源的骨髓间充质干细胞的可以通过提高股骨头骨密度、小梁骨密度等途径促进坏死股骨头的伤口愈合，保护因疾病或者外伤引起的骨组织受伤9；也有研究显示，miR-122-5p有促进骨质疏松症的诊断10。本研究通过对hBMSCs细胞进行成骨分化诱导，发现 miR-122-5p 可促进hBMSCs 细胞在分化过程中钙结节与成骨活性，miRNA基因过表达体外干预的hBMSCs细胞可促进干细胞的成骨分化，提示过表达 miR-122-5p可促进骨形成的诱导，亦可作为骨质疏松症成骨细胞方向潜在的治疗靶点。作为成骨分化的经典信号通路，Wnt/-catenin 信号通路一直是骨髓间充质干细胞定向分化成成骨细胞的明星通路11,12，该通路的由细胞膜上wnt蛋白被激活后，进入细胞开启一系列的活性转化，进入细胞质后激活 GSK-3结合蛋白，而在胞质内通过影响-catenin 的磷酸化以阻止其降解，使-catenin 在细胞质内不断增多，进入细胞核调控靶基因的转录与表达13,14。RUNX2 与 Osterix 是成骨分化特异性转录因子，通过增强成骨相关的基因转录，达到促进成骨分化的目的15,16。本研究发现，诱导成骨分化过程中，过表达 miR-122-5p后，经过RT-PCR与Western的检测手段，分别检测细胞内 Wnt/-catenin信号通路与成骨分化相关的特异性转录因子-catenin、Wnt3a、GSK3-及RunX2、Osterix的mRNA表达水平，结果显示，过表达miR-122-5p组的 mRNA表达量明显高于空载对照组（P0.05）。综上所述，miRNA-122-5p可通过促进hBMSCs细胞成骨分化来治疗骨质疏松症的机制是与靶向BRCC3基因有关，其通过BRCC3基因进一步调控Wnt/-catenin通路，来完成成骨分化的诱导，本研究为骨质疏松症的靶向治疗提供了理论依据。参考文献参考文献1Zhang L,Sugamori 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