miR-142-3p通过调控Hmgb1抑制雨蛙素诱导的大鼠胰腺外分泌细胞系AR42J凋亡.pdf

年 月第 卷 第 期基础医学与临床 收稿日期：修回日期：基金项目：国家自然科学基金（）；广西自然科学基金（）；右江民族医学院附属医院高层次人才科研项目（）；广西研究生教育创新计划（）通信作者（）：文章编号：（）研究论文 通过调控 抑制雨蛙素诱导的大鼠胰腺外分泌细胞系 凋亡苏拾香，王语阳，覃宗帅，黄桂香，徐 键，岑兰英，覃月秋 右江民族医学院附属医院，广西 百色；右江民族学院 研究生院，广西 百色 摘要：目的 探讨 调控 对大鼠胰腺外分泌细胞系 凋亡的影响。方法 将 细胞分为空白组（）、急性胰腺炎模型组（，雨蛙素作用 ），再分别用 、和 转染模型组细胞，记为 组、组、组 和 组。用 检测细胞中 表达；检测、蛋白表达；染色测定细胞凋亡；流式细胞测量术检测细胞凋亡率；双荧光素酶报告基因实验明确 和 的靶向关系。结果 与空白组相比，组中 表达水平显著下调（），、蛋白表达量上调（），蛋白表达量显著上调（），蛋白表达量显著降低（），细胞凋亡率显著升高（）；与 组相比，组 水平显著上调（），、蛋白表达量显著下调（），蛋白表达量上调（），细胞凋亡率显著降低（）；与 组相比，组 表达水平下调（），、蛋白表达量显著上调（），蛋白表达量降低（），细胞凋亡率显著升高（），差异均有统计学意义。双荧光素酶报告基因实验显示 为 的靶基因。结论）在模型组细胞中低表达。）可靶向抑制 表达进而抑制 细胞凋亡。关键词：；凋亡；急性胰腺炎；高迁移率族蛋白 中图分类号：文献标志码：，；，：（），（，），基础医学与临床 （），（），（），（），（）（），（），（），（），（），（），（），（）（）：；急性胰腺炎（，）是临床常见的消化系统疾病，以严重炎性反应和腺泡细胞死亡为特征，该病起病急，进展快，部分可发展为重症急性胰腺炎，病死率高且预后差。急性胰腺炎的发生发展和细胞凋亡密切相关，而微（，）可通过直接调控其靶基因影响细胞凋亡，参与急性胰腺炎的发生和发展。高迁移率族蛋白（，）可以通过调控细胞凋亡而参与胰腺损伤、炎性反应、肿瘤的发生发展过程。研究发现，靶向 在一些疾病中调控细胞凋亡，但在急性胰腺炎中尚未见文献报道。本研究采用大鼠胰腺外分泌细胞 细胞构建 模型，以研究 靶向 调控腺泡细胞凋亡的影响及机制，为治疗 提供新思路。材料与方法 细胞系及主要试剂大鼠胰腺外分泌细胞系 和 培养基（上海澳睿赛生物技术有限公司）；、多聚赖氨酸、胎牛血清（武汉普诺赛生命科技有限公司）；青链霉素混合液、蛋白磷酸化酶抑制、胰蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司）；雨蛙素（，纯度，上海源叶生物科技有限公司）；细胞凋亡 染色试剂盒、快速封闭液、彩虹 （上海碧云天生物技术有限公司）；裂解液（北京英文特生物技术有限公司）；、山羊抗兔免疫球蛋白（）、山羊抗小鼠（）（江苏亲科生物研究中心有限公司）；、抗体（公司）；质粒（上海吉玛制药技术有限公司）；、电泳缓冲液、转膜缓冲液、凝胶快速制备试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）；、（上海赛默飞世尔科技有限公司）；膜（公司）；超敏 化学发光试剂盒（苏州莫纳生物科技有限公司）；（公司）；第一链 反转录试剂盒、扩增试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；引物（广州易锦生物技术有限公司）；细胞凋亡检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）。方法 细胞的分组及处理：将 细胞分为空白组（），急性 胰 腺 炎 细 胞 模 型 组（，雨蛙素作用 ），造模 后细胞胞质内出现大量空泡。再分别用 、和 转染模型组细胞 ，记为 组、组、组 和 组，继续培养、后用于试验检测。苏拾香 通过调控 抑制雨蛙素诱导的大鼠胰腺外分泌细胞系 凋亡 检测 表达：转染 后各组细胞加入 试剂提取细胞，利用 第一链 反转录试剂盒合成。反应条件为：预变性 ；变性 ，退火 ，延伸 ，个循环。以 作为 的内参，结果使用 法分析。各基因引物序列见表。表 引物序列 （）检测、蛋白：转染 后收集各组细胞，用 裂解液裂解细胞，收集上清液，用 试剂盒测定样品蛋白浓度。分离条件为 ，常规湿法转膜后，快速封闭液封闭，各 组 分 别 加 入 各 兔 抗 人 抗 体（）、兔抗人 抗体（）、鼠抗人 抗体（）、兔抗人 抗体（）摇床孵育过夜，洗涤，标记的羊抗兔（）、羊抗鼠（）二抗室温摇床孵育 ，洗涤，显影。蛋白质条带使用 软件分析吸光度值。染色测定细胞凋亡：各组细胞接种于 孔板内，使其约为 汇合度。刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入 固定液，固定 或更长时间（可 过夜）。去固定液，用 洗涤。加入 染色液染色。去染色液，用 洗涤。滴抗荧光淬灭封片液。荧光显微镜观察。流式细胞测量术测定各组细胞凋亡率：转染后 ，制 备 各 组 重 悬 细 胞，各 组 细 胞 按 照 细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，流式细胞仪上机检测。双荧光素酶报告基因实验验证靶向关系：构建 和 的荧光素酶报告载体，分别与 、共转染，按双荧光素酶报告基因检测试剂盒技术手册操作，转染 后收集细胞，比较各组相对荧光素酶活性。统计学分析统计学处理采用 分析数据，计量资料以均数标准差（）表示，两组间的比较采用两独立样本 检验，所有数据均进行正态分布和方差齐性检验。用 软件（版本 ）作图。当 时，视为差异有统计学意义。结果 细胞培养及转染常规培养的 细胞呈上皮细胞样，贴壁增殖，细胞增殖速度缓慢，有密度依赖，成片增殖（图）。雨蛙素刺激造模 后，细胞胞质内出现大量空泡，部分细胞变形，伪足增多（图）。转染后细胞松散，形态较圆，部分细胞可见脱落死亡（图）。；，（）；，（）图 细胞培养和转染效果 （）基础医学与临床 （）各组细胞 的表达与空白组相比，组的 表达水平显著下调（）；与 组相比，组 表达水平显著上调（）；与 组 相 比，组表达水平下调（）（图）。各组细胞、蛋白表达与空白组相比，组的、蛋白表达量上调（）（图），蛋白表达量显著上调（）（图），蛋白表达量显著降低（）（图）。与 组相 ；，图 各组细胞 相对表达量 （，）；，；图 各组细胞、蛋白表达情况 ，（，）苏拾香 通过调控 抑制雨蛙素诱导的大鼠胰腺外分泌细胞系 凋亡比，组、蛋白表达量显著下调（）（图 ），蛋白表达量上调（）（图）。与 组相比，组、蛋白表达量显著上调（）（图 ），蛋白表达量降低（）（图）。各组细胞凋亡情况空白组正常细胞的细胞核呈正常的蓝色（图），与空白组相比，组细胞的细胞核呈致密浓染，部分颜色发白（图）；与 对照组相比，组细胞核致密浓染较少（图）；与 组相比转染 后细胞核致密浓染增多（图）。二维散点图记录 细胞凋亡，为横坐标，为纵坐标，以阴性对照设定正常界限，将细胞分为：正常 活 细 胞（左 下 象 限，、）；早期凋亡细胞（右下象限，、）；晚期凋亡和死亡细胞（右上象限，、）。与空白组相比，组早期凋亡细胞增多，凋亡率显著升高（）（图）；与 对照组相比，组早期细胞凋亡减少，凋亡率显著降低（）（图）；与 组相比，组早期细胞凋亡增多，凋亡率显著升高（）（图）。；，（）；图 各组细胞 染色结果 （）基础医学与临床 （）；图 流式细胞测量术检测各组 细胞凋亡水平 （，）靶向调控 的表达 数 据 库 显 示 与 存在结合位点（图）。为了进一步验证 与 之间的互作关系，进行 荧 光 素 酶 报 告 基 因 检 测，实 验 结 果 显 示 与 含有互补的核苷酸序列（图 ）；与 转 染 相 比，共 转 染 的荧光素酶活性显著降低（）。由此可见，可靶向调控 的表达（图）。讨论急性胰腺炎是临床常见的消化系统疾病，起病急，进展快，大多数患者表现为轻症急性胰腺炎，呈自限性，但仍有 发展为重症急性胰腺炎。近来研究发现细胞凋亡与 的发生、发展密切相关，在轻症急性胰腺炎中存在广泛的腺泡细胞凋亡，但在重症急性胰腺炎中则以腺泡细胞坏死为主。苏拾香 通过调控 抑制雨蛙素诱导的大鼠胰腺外分泌细胞系 凋亡图 数据库显示 与 的互作靶点 图 与 靶位点结合示意图 ；图 双荧光素酶报告基因实验检测 与 相互作用 （，）通常作为损伤相关模式分子，是炎性反应、免疫和代谢反应的介质，近年研究发现 可通过调控细胞凋亡而参与胰腺损伤、炎性反应和肿瘤的发生发展过程。经雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠模型、细胞炎性模型中，、蛋白水平升高，蛋白水平降低。急性胰腺炎患者血清中 水平升高。本研究发现，与空白组相比，模型组、蛋白表达量升高，蛋白表达量下降，这与文献报道一致。作为一类小非编码，在机体生理和病理过程中发挥着关键的调节作用。研究发现，模拟物靶向 信号通路，促进 表达，抑制 和 表达，从基础医学与临床 （）而抑制新生大鼠心肌细胞凋亡，保护小鼠心脏组织免 受 缺 血 再 灌 注 的 侵 害，从 而 改 善 心 脏 功能。在实验性骨关节炎小鼠的关节软骨组织中，表达水平下降，的过表达靶向 介导的 信号通路来抑制软骨细胞凋亡。上述研究表明，与细胞凋亡及疾病进展密切相关，但是否靶向 调控雨蛙素诱导的大鼠外分泌系细胞 的凋亡尚不明确。本研究发现在 组中 低表达，、表达上调，表达下调，细胞凋亡水平 升 高。上 调 表 达 后，、表达下调，表达上调，细胞凋亡水平下降；而下调 表达可逆转上述结果。提示 可能通过 调控凋亡相关蛋白、和 的表达来调控急性胰腺炎 细胞的凋亡。为明确 与 靶向关系，本研究进行双荧光素酶基因实验，结果证实 为 的靶基因。综上所述，通过靶向 调控凋亡相关蛋白、和 的表达水平，进而影响雨蛙素诱导的大鼠胰腺外分泌细胞系 的凋亡，这为临床治疗 提供新思路。参考文献：，：，：，：，：，：，：，：黄伟，孔丽君，叶亚群，等 激活剂减轻重症急性胰腺炎模型大鼠胰腺损伤 基础医学与临床，：，：，：潘春风，陶 丽 菊，覃 宗 帅，等 靶 向 调节急性胰腺炎腺泡细胞凋亡的实验研究右江民族医学院学报，：，：朱绍华，何创业，赵芯 血清微管相关蛋白 轻链、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶 及高迁移率族蛋白 在不同程度急性胰腺炎中的表达及意义陕西医学杂志，：，：，：，：