miR-145-5p靶向FGF5对神经细胞缺血_再灌注损伤诱导的神经元细胞凋亡和氧化应激的影响.pdf

miR-145-5p 靶向 FGF5 对神经细胞缺血/再灌注损伤诱导的神经元细胞凋亡和氧化应激的影响贾燕燕,张小林,潘 燕,赵 迪摘要 目的:探讨 miR-145-5p 靶向成纤维细胞生长因子 5(FGF5)对神经细胞缺血/再灌注(I/R)损伤导的神经元细胞凋亡和氧化应激的影响。方法:采用氧糖剥夺/复氧(OGD/R)建立神经元细胞损伤模型,氧糖剥夺后复氧 6、12、24 h 检测氧化应激指标的含量,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测 miR-145-5p 的表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告实验分析miR-145-5p 与 FGF5 的靶向关系,蛋白质印迹法检测 miR-145-5p 对 FGF5 表达水平的影响。miR-145-5p inhibitor 与 FGF5 siRNA 单独或共转后 OGD/R,检测氧化应激指标变化。结果:神经细胞经氧糖剥夺复氧后,细胞氧化应激损伤明显增加,乳酸脱氢酶(LDH)、活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量明显增加,超氧化物歧化酶(SOD)活性明显降低,miR-145-5p 表达量及细胞凋亡率均增加,差异均有统计学意义(P0.01)。miR-145-5p 与 FGF5 存在靶向关系,miR-145-5p inhibitor 转染神经细胞后 OGD/R,细胞氧化应激反应和凋亡被抑制,而 FGF5siRNA 逆转了 miR-145-5p inhibitor 对 OGD/R 细胞模型氧化应激、细胞凋亡和 FGF5 表达水平的影响。结论:miR-145-5p 可通过靶向结合 FGF5 诱导 HT22 细胞凋亡和氧化应激损伤,miR-145-5p 可能是 I/R 的潜在治疗靶点。关键词 缺血/再灌注损伤;miR-145-5p;成纤维细胞生长因子 5;神经细胞;氧化应激;实验研究d o i:1 0.1 2 1 0 2/j.i s s n.1 6 7 2-1 3 4 9.2 0 2 3.1 7.0 1 2 缺 血 性 脑 血 管 病(ischemic cerebrovasculardiseases,ICVD)是具有高发病率、高致残率及高死亡率的急性脑血管疾病 1-2,其中缺血性脑卒中的发病率占所有脑卒中的 87%,临床通常采用及时溶栓、介入等方式恢复缺血区域的血流再灌注,但血流再灌注可能 引 发 缺 血 性 再 灌 注 损 伤(ischemia/reperfusioninjury,I/R)。神经元细胞是对缺血缺氧最敏感的细胞,I/R 对神经元细胞的损伤非常大。研究表明,缺血性脑卒中的病理生理机制包括兴奋神经毒性神经递质释放、细胞内 Ca2+积聚、自由基损伤、细胞凋亡、神经炎症及脂质分解等 3,但 I/R 的发病机制仍不完全清楚,因此,进一步研究缺血性脑卒中的发病机制以寻找潜在的治疗靶点,从而提高缺血性脑卒中疗效,降低病人死亡率和致残率。miRNA 是真核生物中具有调控功能的短链非编码 RNA 4,包含 2123 个核苷酸 序列 5,可与目标基因 mRNA 的 3-非编码区(3-UTR)碱基配对结合,对目标基因发挥调控作用。近年来的研究表明,miRNA 对缺血再灌注损伤具有调控作用,如miR-429 的表达可缓解氧糖剥夺/复氧(OGD/R)对神经细胞的损伤 6,而 microRNA-320 可通过抑制胰岛素生长因子-1 调控脑缺血/再灌注损伤 7;miR-145-5p作者单位 南阳市中心医院(河南南阳 473000)通讯作者 张小林,E-mail:引用信息 贾燕燕,张小林,潘燕,等.miR-145-5p 靶向 FGF5 对神经细胞缺血/再灌注损伤诱导的神经元细胞凋亡和氧化应激的影响 J.中西医结合心脑血管病杂志,2023,21(17):3170-3176.受长链非编码 RNA SNHG14 调控,参与脑梗死的发生发展 8。最近的研究表明,缺血时 miR-145-5p 表达水平的改变可影响神经元的活性 9。成纤维细胞生长因子 5(FGF5)是小鼠拟胚体外胚层标志物,在胚胎发育和神经发育中发挥重要作用。本实验以体外培养的小鼠海马区神经元细胞为研究对象,构建 OGD/R 模型,研究 miR-145-5p 与 FGF5 的靶向关系及其对氧化应激反应的影响,为脑缺血再灌注提供潜在靶点。1 材料与方法1.1 实验材料小鼠海马神经元 HT22 细胞购自中国科学院上海细胞库;miR-145-5p inhibitor 由广州锐博生物有限公司合成;小干扰 RNA(siRNA)靶向 FGF5 购自上海Genechem 公司;胎牛血清、DMEM 培养基和胰蛋白酶购自美国 Gibco 公司;活性氧(ROS)检测试剂盒、放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒均购自上海碧云天生物技术研究所;丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒均购自北京康为世纪生物科技有限公司。1.2 细胞培养与 OGD/R 模型建立细胞培养:采用含 10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的 DMEM 培养基培养 HT22 细胞,培养条件为 37、5%CO2。OGD/R 模型建立:HT22 细胞置于无糖平衡盐溶液中,在三气缺氧细胞培养箱(37、1%O2、94%N2、5%CO2)中培养 4 h 后,更换为含 4.5 g/L 葡萄糖的培养基,常规复氧培养(95%空气、5%CO2)12、24 h 制备OGD/R 模型,对照组不进行 OGD/R 处理,常规条件下0713CH I N E S EJ OURNA LO FI N T E G R AT I V E ME D I C I N EONC AR D I O-C E R E B ROVA S C U L ARD I S E A S E S e p t e m b e r 2 0 2 3 V o l.2 1 N o.1 7培养。1.3 流式细胞术检测神经元细胞凋亡将 HT22 细胞(密度为 2105个/mL)接种于六孔板,按上述 OGD/R 模型建立方法处理 HT22 细胞 6、12、24 h,收集细胞并离心,用预冷磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤两次,调整细胞密度为1106个/mL。将5L 的 V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和 10L的碘化丙啶(PI)加入 100L 的 1Binding Buffer 重悬细胞悬液中混匀,室温避光孵育 5 min,最后加入400L 的 1Binding Buffer 混匀,在流式细胞仪上进行检测,并采用 BD FAC-Suite 软件作图。1.4 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测蛋白表达复氧 24 h 后收集各组细胞,加入 RIPA 蛋白裂解液冰上裂解 30 min,在低温冷冻离心机上以 12 500 r/min离心 10 min,取上清,采用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白总浓度。取 50g 总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳,电转至聚偏二氟乙烯膜(PVDF),Tris 缓冲盐溶液(TBS)洗膜 10 min,5%牛血清白蛋白封闭 2 h,加一抗 4孵育过夜,次日加入相应二抗孵育 12 h,增强型化学发光剂(ECL)显色,采用 ImageJ2x 图像分析系统分析蛋白条带灰度值,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参。1.5 氧化应激标志物检测分别采用 MDA、SOD、ROS 及 LDH 试剂盒检测细胞 MDA、SOD、ROS 及 LDH 含量。1.6 荧光素酶报告实验验证靶向关系采用 Targetscan 和 MiRDB 生物信息学预测软件预测miR-145-5p和FGF5的结合位点,合成携带miR-145-5p 结合位点的野生型(WT)FGF5 3-UTR,并将其克隆至 pMIR-control 荧光素酶报告质粒中,293T细胞 接 种 到 95 孔 板 中,使 用 Lipofectamine3000将pcDNA3.0-FGF5 WT 和 突 变 型(MUT)质 粒 分 别 与miR-145-5p mimic 共转染,48 h 后,通过双荧光素酶报告试验系统测定荧光素酶活性。1.7 细胞转染将 siRNA 靶 向 FGF5 和 对 照 siRNA 分 别 插 入pcDNA3.0 质粒,取对数生长期的 HT22 细胞,调整细胞密度为 1104个/mL,接种于 24 孔板,常规培养 24 h后,采用 Lipofectamine 3000 将上述 pcDNA3.0 质粒转染至 HT22 细胞。1.8 实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)采用 TRIzol 试剂提取细胞总 RNA,然后将 RNA逆转 录 为 cDNA,然 后 以 cDNA 为 模 板 采 用 SYBRGene RealtimePCRMaster Mix 进 行 RT-PCR,使 用Fast Real-time PCR 7300 系 统 分 析 miR-145-5p 的mRNA 水平,反应均以 U6 为内参计算蛋白的相对表达量,采用 2-Ct计算 mRNA 相对表达量。详见表 1。表 1 基因名称及引物序列 基因名称 引物序列(5-3)miR-145-5p mimic正向:GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU反向:GGAUUCCUGGGAAAACUGGACUUmiR-145-5p正向:ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA反向:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGGGATTCFGF5 siRNA1正向:CAUAAGUUGUAUAGGCUAA反向:CAACAAUAAGCCACGUCAAFGF5 siRNA2正向:GCAAGUUCAGGGAGCGUUU反向:GUAUUGAAGUCACGUCAUUU6正向:CTCGCTTCGGCAGCACA反向:AACGCTTCACGAATTTGCGT1.9 统计学处理采用 SPSS 22.0 统计学软件分析实验数据,绘图采用 Graphpad Prism 5.0 软件。符合正态分布的定量资料以均数标准差(xs)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。以P0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 OGD/R 处理对神经细胞氧化应激反应的影响 神经细胞经氧糖剥夺后复氧,细胞 ROS、MDA 及细胞 上 清 LDH 含 量 随 复 氧 时 间 的 增 加 而 增 加,而SOD 活性则随复氧时间的增加而降低,OGD/R 6、12、24 h 时 ROS、MDA、LDH、SOD 水平与 0 h 比较,差异均有统计学意义(P0.01),提示 OGD/R 诱导神经细胞出现氧化应激反应。详见图 1、图 2。1713中西医结合心脑血管病杂志2 0 2 3年9月第2 1卷第1 7期图 1 OGD/R 处理对神经细胞 LDH、SOD 水平的影响(A 为 OGD/R 处理后 LDH 含量变化;B 为 OGD/R 处理后 SOD 含量变化。与 0 h 比较,*P0.01)图 2 OGD/R 处理对神经细胞 ROS、MDA 水平的影响(A 为 OGD/R 处理后 ROS 水平变化;B 为 OGD/R 处理后 MDA 含量变化。与 0 h 比较,*P0.01)2.2 OGD/R 处理对 miR-145-5p 表达的影响神经细胞经氧糖剥夺后复氧不同时间,miR-145-5p表达均高于对照组(P0.01),并且随着复氧时间的增加,miR-145-5p 表达量增加,提示 OGD/R 能诱导神经细胞中 miR-145-5p 的表达,详见图 3。神经细胞转染 miR-145-5p mimic 后氧糖剥夺,miR-145-5p 表达水平明显高于 OGD/R 24 h;而 miR-145-5p inhibitor 组miR-145-5p 表达水平明显低于 OGD/R 24 h 组,差异均有统计学意义(P0.01),详见图 4。提示 miR-145-5p的高表达与 I/R 损伤相关。图 3 神经细胞经 OGD/R 不同时间miR-145-5p 表达比较(与 0 h 比较,*P0.01)图 4 神经细胞转染 miR-145-5p mimic 后氧糖剥夺对 miR-145-5p 表达的影响(OGD/R 24 h 组与 OGD/R 0 h 组比较,*P0.01;与 OGD/R 24 h 组比较,#P0.01)2.3 OGD/R 处理对神经元细胞凋亡的影响流式细胞术检测结果显示,与 0 h 比较,OGD/R处理 6、12、24 h 神经元凋亡细胞及凋亡率均增加,差异均有统计学意义(P0.01)。详见图 5、图 6。2713CH I N E S EJ OURNA LO FI N T E G R AT I V E ME D I C I N EONC AR D I O-C E R E B ROVA S C U L ARD I S E A S E S e p t e m b e r 2 0 2 3 V o l.2 1 N o.1 7图 5 流式细胞术检测 HT22 神经元细胞凋亡情况图 6 OGD/R 处理对 HT22 神经元细胞凋亡率的影响(与 0 h 比较,*P0.01)2.4 miR-145-5p 与 FGF5 的靶向关系miR-145-5p 在 miRTar base、Target scan、Targetminer 及 miRDB 在线软件中分别存在 15 064、890、1 305、495 个潜在靶基因,经过绘制 Venn 图并取其交集共有100 个潜在的靶基因,FGF5 为其中之一。详见图 7。采用 Targetscan 验证 miR-145-5p 与 FGF5 的靶向关系,结果显示,miR-145-5p 与 FGF5 的 3-UTR 有互补序列。荧光素酶报告结果显示,WT FGF5 3-UTR 与miR-145-5p mimic 共转染后,荧光素酶的活性明显降低;MUT FGF5 3-UTR 与 miR-145-5p mimic 共转染后,荧光素酶的活性变化不明显。与 OGD/R 比较,miR-145-5p inhibitor 明 显 上 调 FGF5 表 达,FGF5siRNA 明显下调 FGF5 表达,差异均有统计学意义(P0.01)。详见图 8、图 9。图 7 Venn 图图 8 荧光素酶实验验证 FGF5 与miR-145-5p 的靶向关系(与 FGF5 WT 比较,*P0.01)图 9 miR-145-5p 靶向负向调控 FGF5 表达(与 OGD/R 组比较,*P0.01;与 OGD/R+FGF5 siRNA 组比较,#P0.01)2.5 miR-145-5p inhibitor 抑制 OGD/R 诱导的 HT22细胞凋亡与 OGD/R 组比较,OGD/R+miR-145-5p inhibitor组 HT22 细胞凋亡率明显降低(P0.01),OGD/R+FGF5 siRNA 组 HT22 细胞凋亡率明显增加(P0.01)。OGD/R+miR-145-5p inhibitor+FGF5 siRNA 组 与OGD/R+FGF5 siRNA 组比较,HT22 细胞凋亡率明显降低(P0.01)。详见图 10、图 11。3713中西医结合心脑血管病杂志2 0 2 3年9月第2 1卷第1 7期图 10 流式细胞术检测 HT22 神经元细胞凋亡情况图 11 miR-145-5p inhibitor抑制 OGD/R 诱导的 HT22 细胞凋亡(与 OGD/R 组比较,*P0.01;与 OGD/R+FGF5 siRNA 组比较,#P0.01)2.6 miR-145-5p inhibitor 减轻 OGD/R 诱导的氧化应激损伤 细胞氧化应激损伤检测结果显示,与 OGD/R 组比较,OGD/R+miR-145-5p inhibitor 组细胞 MDA、ROS和 LDH 含量均明显降低,SOD 活性明显升高,差异均有统计学意义(P0.01);OGD/R+FGF5 siRNA 组细胞 MDA、ROS 和 LDH 含量均明显增加,SOD 活性明显降低,差异均有统计学意义(P0.01)。OGD/R+miR-145-5p inhibitor+FGF5 siRNA 组 与 OGD/R+FGF5 siRNA 组比较,细胞 MDA、ROS 和 LDH 含量均明显降低,SOD 活性明显升高,差异均有统计学意义(P0.01)。详见图 12、图 13。图 12 miR-145-5p inhibitor 对 OGD/R 诱导的 LDH、SOD 水平的影响(A 为各组 LDH 表达;B 为各组 SOD 表达。与 OGD/R 组比较,*P0.01;与 OGD/R+FGF5 siRNA 组比较,#P0.01)图 13 miR-145-5p inhibitor 对 OGD/R 诱导的 ROS、MDA 水平的影响(A 为各组 ROS 表达;B 为各组 MDA 表达。与 OGD/R 组比较,*P0.01;与 OGD/R+FGF5 siRNA 组比较,#P0.01)4713CH I N E S EJ OURNA LO FI N T E G R AT I V E ME D I C I N EONC AR D I O-C E R E B ROVA S C U L ARD I S E A S E S e p t e m b e r 2 0 2 3 V o l.2 1 N o.1 73 讨 论I/R 是一个复杂的生理病理过程,涉及多种发病机制,如神经元的死亡、胶质细胞的激活和炎症反应等。miRNA 在大脑功能中扮演重要角色,包括神经发生、神经发育、导致突触可塑性发生改变的细胞反应等。研究表明,miR-145-5p 在血管内皮细胞损伤、心肌细胞存活及 H2O2所致神经元细胞损伤等过程中均明显上调 10-11,小胶质细胞 OGD/R 处理 2 h 后和大脑中动脉栓塞(MCAO)12 h 后大脑皮质中 miR-145-5p 也明显上调。以上研究表明,miR-145-5p 可能在 OGD/R过程中损伤神经元细胞。本实验结果显示,对 HT22细胞进行氧糖剥夺复氧不同时间后,细胞 ROS、MDA、LDH 含量明显升高,SOD 的活性明显降低,提示造模成功。I/R 发生后机体氧化和抗氧化能力失衡,发生氧化应激反应并产生大量氧自由基,清除自由基、抑制氧化应激反应是治疗 I/R 的重要方式之一。本研究结果显示,在 I/R 细胞模型中,miR-145-5p 表达增加,抑制miR-145-5p 表达后,细胞氧化应激反应得到缓解。研究表明,氧自由基可诱导产生大量细胞因子,从而刺激脑血管内皮细胞黏附因子的表达,引起再灌注的大量炎症反应,最终导致神经细胞的凋亡和坏死 12。ROS是高含氧活性小分子,有效清除过剩的 ROS 可改善缺血性脑卒中转归。SOD 是清除氧自由基的蛋白酶,可通过磷酸化蛋白激酶 B(AKT)降低缺血脑损伤导致的细胞凋亡 13。本研究中,神经细胞经氧糖剥夺后复氧,细胞 ROS、MDA 及细胞上清 LDH 含量随复氧时间的增加而增加,而 SOD 活性则随复氧时间的增加而降低。成熟 miRNA 通过与靶 mRNA 的 3-UTR 的互补结合调节基因表达,此种调节作用将导致靶 mRNA 降解或蛋白质翻译抑制,从而使细胞功能发生变化 14。本研究中 I/R 损伤细胞 miR-145-5p 表达升高,并且FGF5 受到抑制,通过生物信息学分析及荧光素酶实验证实两者之间具有较强的靶向关系,HT22 细胞转染miR-497-5p inhibitor 后 OGD/R,细胞中氧化应激、炎症反应和细胞凋亡 明显减轻,而 FGF5 siRNA 转 染HT22 细胞后,细胞氧化应激反应及细胞凋亡增加,提示 miR-145-5p 靶向 FGF5,调节 I/R 损伤诱导的细胞凋亡和氧化应激损伤。FGF5 属于成纤维细胞生长因子家族(FGFs)成员,在小鼠胚胎和成年小鼠的中枢神经系统及原肠胚、肌肉、运动神经元形成中被检测到 15。有研究表明,成年小鼠 FGF5 的信息水平在海马、脊髓和大脑皮层比在其他神经节、小脑、中脑和后脑略高,可视为神经元或神经胶质持续释放的营养因子 16。FGF5 具有多种生物学功能,并发挥重要作用。Walter 等 17研究表明,FGF5 及其主要受体 FGFR1 介导的信号可作为人多形性胶质母细胞瘤的治疗靶点。Fang 等 18研究结果表明,miR-188-5p 通过靶向 FGF5 基因抑制肝癌细胞的增殖和转移,在肝癌中起抑癌作用。此外,FGF5在高血压疾病中也发挥重要作用,FGF5 基因内部或附近区域是原发性高血压的易感区域,原发性高血压外周血中 FGF5 基因 T/C 突变与舒张压和收缩压呈正相关,提示 FGF5 mRNA 和蛋白质水平异常表达可能与高血压疾病的发生发展有关 19-20。本研究结果显示,FGF5 在 OGD/R 诱导的 HT122 中表达减少,并通过 Targetscan 证明 FGF5 是 miR-145-5p 的下游靶点,此外,miR-145-5p inhibitor 转染 HT22 细胞后,FGF5蛋白表达增加,细胞凋亡和氧化应激损伤均得以改善。而 FGF5 siRNA 转染 HT22 细胞后,FGF5 蛋白表达减少,氧化应激反应加强。以上结果提示 miR-145-5p 通过抑制 FGF5 表达从而增加 OGD/R 环境下 HT22 细胞的凋亡和损伤。综上所述,miR-145-5p 可通过靶向结合 FGF5 诱导 HT22 细胞凋亡和氧化应激损伤,miR-145-5p 可能是 I/R 的潜在治疗靶点。但本研究仅通过体外细胞培养探讨相关机制,关于 miR-145-5p 对 I/R 的作用和影响机制还需进一步深入研究。参考文献:1 FAN J,LI Y,FU X,et al.Nonhuman primate models of focalcerebral ischemia J.Neural Regeneration Research,2017,12(2):321-328.2 张佳琳,李元元,杨文亮,等.黄芪甲苷基于 PI3K/Akt/Bcl-2 信号通路对 PC12 细胞 OGD/R 损伤的保护机制研究 J.神经药理学报,2017,7(5):1-8.3 杨红星,李绍旦,杨明会.microRNA 调控自噬在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展 J.安徽医科大学学报,2018,53(9):1485-1488.4 OLENA A F,PATTON J G.Genomic organization of microRNAs J.Journal of Cellular Physiology,2009:296-301.5 ZHI Y,PAN J,SHEN W,et al.Ginkgolide B inhibits human bladdercancer cell migration and invasion through microRNA-223-3p J.Cellular Physiology and Biochemistry,2016,39(5):1787-1794.6 XIAO J,KONG R,HU J.Inhibition of microRNA-429 attenuatesoxygen-glucosedeprivation/reoxygenation-inducedneuronalinjury by promoting expression of GATA-binding protein 4 J.Neuroreport,2018,29(9):723-730.7 TIAN Z Q,JIANG H,LU Z B.miR-320 regulates cardiomyocyteapoptosis induced by ischemia-reperfusion injury by targetingAKIP1 J.Cell Mol Biol Lett,2018,23:41.8 QI X,SHAO M,SUN H J,et al.Long non-coding RNA SNHG14promotesmicrogliaactivationbyregulatingmiR-145-5p/PLA2G4A in cerebral infarction J.Neuroscience,2017,348:98-106.9 谢雪梅.miR-145-5p/Nurr1/TNF-轴信号在大鼠脑缺血再灌注损伤的调控作用研究 D.重庆:重庆医科大学,2019.10 SAUGSTAD J A.microRNAs as effectors of brain function withrolesinischemiaandinjury,neuroprotection,andneurodegeneration J.Journal of Cerebral Blood Flow andMetabolism,2010,30(9):1564-1576.11 CHEN R,CHEN S,LIAO J,et al.miR-145 facilitates proliferationand migration of endothelial progenitor cells and recanalizationof arterial thrombosis in cerebral infarction mice via JNK signalpathway J.International Journal of Clinical and ExperimentalPathology,2015,8(10):13770-13776.5713中西医结合心脑血管病杂志2 0 2 3年9月第2 1卷第1 7期心肌缺血再灌注致认知障碍与海马体自噬关系的实验研究杨文曲1,韩冲芳1,王 慧1,陈 焱2,贺建东1,师高翔1,段应磊1,赵雪丽2,常 鑫2摘要 目的:探讨心肌缺血再灌注致认知障碍与海马体自噬关系的实验研究。方法:将 SD 大鼠 60 只随机分为未处理组(U 组)、假手术组(S 组)和缺血再灌组(I/R 组),每组 20 只。6 d 水迷宫训练后,采用结扎左冠状动脉前降支 30 min 后再灌注的方法制备心肌缺血再灌注致认知障碍模型,S 组只穿线不结扎,U 组不处理。各组大鼠于造模后 1 d 行 Morris 水迷宫试验,后立即处死并取海马体,采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测 Beclin1、LC3的蛋白表达水平。结果:与 U 组、S 组比较,I/R 组穿越平台次数减少(P0.05),Beclin1、LC3蛋白表达上调(P0.05);Beclin1、LC3蛋白表达与穿越平台次数均呈正相关(r=0.578,P0.05;r=0.513,P0.05)。结论:大鼠心肌缺血再灌注过程伴随有脑海马体神经元自噬水平的提高,且可能有利于减轻心肌缺血再灌注过程所致大鼠认知障碍。关键词 心肌缺血再灌注;认知障碍;海马体;自噬;实验研究d o i:1 0.1 2 1 0 2/j.i s s n.1 6 7 2-1 3 4 9.2 0 2 3.1 7.0 1 3 心肌缺血再灌注损伤是心脏手术和冠心病病人非心脏手术中常见的病理生理过程,在损伤心肌组织的同时,还会引发脑细胞线粒体膜去极化和线粒体功能障碍,同时表现出认知功能下降 1-3。自噬是一种分解、清除细胞内异常蛋白质和细胞器的分解代谢机制,可在神经元细 胞稳态和突 触可塑性 调节中 发 挥 作用 4。研究表明,激活海马体自噬对术后认知功能障碍有神经保护作用 5。而心肌缺血再灌注所致认知障碍与海马体自噬之间的关系尚未明确,本研究拟探讨心肌缺血再灌注致大鼠认知障碍与海马体自噬的关系。1 材料与方法1.1 实验动物及分组选取 SD 大鼠 60 只,1921 月龄,体质量 300350 g,采用随机数字表法分为未处理组(U 组)、假手术组(S 组)和心肌缺血再灌注组(I/R 组),每组 20 只。大鼠于洁净、干燥环境中适应性喂养 7 d。基金项目 山西省科技厅面上青年基金项目(No.201901D211509)作者单位 1.山西医科大学第三医院/山西白求恩医院/山西医学科学院/同济山西医院(太原 030032),E-mail:;2.山西医科大学麻醉学院引用信息 杨文曲,韩冲芳,王慧,等.心肌缺血再灌注致认知障碍与海马体自噬关系的实验研究 J.中西医结合心脑血管病杂志,2023,21(17):3176-3178.1.2 模型制备方法制备心肌缺血再灌注致认知障碍模型。大鼠禁食12 h 后进行麻醉 3%仙台病毒(SeV)诱导,2%SeV维持。行光棒引导下气管插管,连接动物呼吸机行机械通气(频率 60 次/min,潮气量 20 mL/kg,吸/呼比 12),经 BL-420F 生物机能实验系统行心电图(ECG)监测。参考文献 1,采用结扎左冠状动脉前降支(LAD)30min 后开放 LAD 的方法制备心肌缺血再灌注致认知障碍模型。经第 3 肋与第 4 肋间开胸,在左心耳根部与肺动 脉 圆 锥 之 间 用 6-0 丝 线 结 扎 LAD。结 扎 后ECG 显示 ST 段抬高,结扎线以下心肌组织发绀,说明实现心肌缺血。30 min 后去除丝线,恢复灌注,关闭胸腔,采用荷包缝合法缝皮。去除丝线后 ECG 显示ST-T 段降低 50%以上,先前缺血的心肌复红,表明实现心肌再灌注。S 组仅穿线不结扎,U 组不处理。1.3 Morris 水迷宫行为学试验进行 Morris 水迷宫行为学试验。1)造模前连续 6 d行定向航行训练(每日 3 次)检测大鼠空间学习、运动能力,平台固定于 SE 象限,大鼠在平台上学习 30 s后,进入水迷宫水池中。经水浴池上方的摄像系统化软件跟踪记录其游泳速度和潜伏期,潜伏期上限设置为 60 s,潜伏期60 s 者均记为 60 s 并被引导至平台停留学习 15 s。2)造模次日行空间探索试验检测造模 12 陈霜霜.miRNA125b-5p 对缺血再灌注脑损伤的保护作用及作用机制 D.苏州:苏州大学,2017.13 闫海清,岳学静,贵永堃,等.miR-497-5p 靶向 AKT3 对缺血/再灌注损伤诱导的神经细胞氧化应激和炎症反应的影响 J.免疫学杂志,2019,35(11):927-933.14 门颖超,张蕾,艾浩.miR-145-5p 靶向双特异性磷酸酶 6 对人子宫内膜癌增殖、迁移、侵袭与凋亡的影响 J.南方医科大学学报,2020,40(1):61-66.15 杨丹,田海山,李校堃.成纤维细胞生长因子 5 的研究进展 J.中国生物工程杂志,2020,40(3):117-124.16 HAUB O,DRUCKER B,GOLDFARB M.Expression of the murinefibroblast growth factor 5 gene in the adult central nervous system J.The European Respiratory Journal,1990,87(20):8022-8026.17 WALTER B,SIGRID A,HENDRIK F,et al.FGF5/FGFR1-mediatedsignals as therapeutic targets in human glioblastoma multiforme J.Cancer Research,2009,69:18-22.18 FANG F,CHANG R M,YU L,et al.microRNA-188-5p suppressestumor cell proliferation and metastasis by directly targeting FGF5in hepatocellular carcinoma J.Journal of Hepatology,2015,63(4):874-885.19 REN Y C,JIAO X Q,ZHANG L.Expression level of fibroblastgrowth factor 5(FGF5)in the peripheral blood of primaryhypertension and its clinical significance J.Saudi Journal ofBiological Sciences,2018,25(3):469-473.20 雷蕾,包鹏甲,梁春年,等.成纤维细胞生长因子 5 研究进展 J.生物技术通报,2019,35(3):144-150.(收稿日期:2021-06-07)(本文编辑 郭怀印)6713CH I N E S EJ OURNA LO FI N T E G R AT I V E ME D I C I N EONC AR D I O-C E R E B ROVA S C U L ARD I S E A S E S e p t e m b e r 2 0 2 3 V o l.2 1 N o.1 7