miR-125b-2-3p表达对鼻咽癌细胞HNE1增殖和凋亡的影响.pdf

基金项目：蚌埠医学院自然科学重点项目（）；安徽省高等学校科学研究项目（）作者简介：陶露，女，生，硕士，研究实习员，：收稿日期：表达对鼻咽癌细胞 增殖和凋亡的影响陶露，汤迎凯，韦卓利，项平（蚌埠医学院第一附属医院中心实验室，蚌埠 ；蚌埠医学院人体解剖学教研室；蚌埠医学院组织移植安徽省重点实验室；通讯作者，：）摘要：目的探讨 表达对鼻咽癌细胞 增殖和凋亡的影响。方法荧光定量 检测 在人永生化鼻咽上皮细胞 和鼻咽癌细胞中的表达。荧光定量 检测上调和下调 表达转染效率。实验分为 组（未处理）、组（）、组（）、组（）和 组（）。实验、细胞集落形成实验和活细胞 死细胞双染色实验检测细胞增殖的情况；流式细胞术检测细胞凋亡情况；细胞核染色检测细胞核的形态变化；线粒体膜电位检测细胞早期凋亡情况。结果与人永生化鼻咽上皮细胞 相比，鼻咽癌细胞中 的表达较高（）。与 组和 组相比，组 表达上调（）；与 组和 组相比，组 表达下调（）。与 组相比，组细胞增殖能力较强（），细胞凋亡能力较弱（），线粒体膜电位较高（）；相较于 组，组细胞增殖能力被抑制（），细胞凋亡能力较强（），核固缩核碎裂较多，线粒体膜电位较低（）。结论下调 能抑制鼻咽癌细胞 的增殖，促进细胞的凋亡。关键词：；鼻咽癌；细胞增殖；细胞凋亡；中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（，；，；，；，：）：（），（），（）（）（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）：；，鼻咽癌（，）是由鼻咽上皮癌变引起的一种头颈部上皮性恶性肿瘤，在中国南方、北非和东南亚地区发病率较高 。近年来，随着放疗技术的进步，鼻咽癌早期治疗效果良好 ，然而，的新诊断患者的临床结果很差，他们通常表现为晚期疾病。因此，开发有效的治疗策略从而使这种致命疾病得以根除是至关重要的。（）是一类非编码 ，可通过与 的 非翻译区（）碱基配对，增强 降解或抑制其翻译，大约三分之一的人类基因可以被 调控 。最近的研究表明，在许多人类疾病中异常表达，调控多种生物学作用，包括增殖、凋亡、迁移和分化，在肿瘤的发展过程中，既可以作为癌基因，也可以作为肿瘤抑制因子 。研究发现 在结直肠癌 、乳腺癌 和口腔鳞状细胞癌 等肿瘤中发挥作用。在鼻咽癌中发挥何种作用？目前尚未发现相关研究。本研究通过分析 在鼻咽癌细胞中的表达水平及其对鼻咽癌细胞 增殖和凋亡的影响，为鼻咽癌的诊断和治疗提供新的依据。材料和方法 细胞株和主要试剂鼻咽癌细胞 和 为蚌埠医学院第一附属医院中心实验室冻存细胞，人永生化鼻咽上皮细胞 购自赛库生物技术有限公司。购自美国 公司；胎牛血清购自南美 公司；购自美国 公司；、和 以 及 引 物（序列：，：）购自吉玛基因股份有限公司；（货号 ）购自易锦生物技术有限公司；提取分离试剂盒购自天根生化科技有限公司；定量检测体系购自美国 公司；检测试剂盒购自迈珂生物科技有限公司；活细胞 死细胞双染试剂盒和 染色液购自索莱宝科技有限公司；细胞凋亡检测试剂盒和线粒体膜电位检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。细胞培养与转染 、和 细胞株均在 ，条件下培养，完全培养液是由 胎牛血清和 青 链霉素混合 配制。收集对数生长期 细胞，计数并均匀铺板于 孔板，待细胞生长至密度约 时进行细胞转染，分别转染 和 ，和 ，然后验证转染效率。在后续实验中分为 组（未处理）、组（）、组（）、组（）和 组（）。荧光定量 检测 表达水平收集对数生长期细胞，根据 提取分离试剂盒说明书提取总 ，根据 定量检测体系使用说明书依次进行反转录和 反应，设置参数：预变性 ；，个循环。以 为内参，采用相对定量 方法计算。细胞集落形成的测定收集对数生长期转染后 细胞并计数均匀铺板，培养期间间断观察细胞生长情况，后终止培养。组织细胞固定液固定 ，洗 次，结晶紫染色 ，拍照并统计集落形成数目。检测细胞增殖能力收集对数生长期转染后 细胞并计数，孔铺板于 孔板，分别在培养箱中培养 ，后终止培养，更换培养液，每孔加 溶液，在培养箱中孵育 使用酶标仪测定在 处的吸光值。活细胞 死细胞双染色检测细胞活力收集对数生长期转染后 细胞，计数后铺板于 孔板，分别在细胞培养箱中培养 后终止培养，洗 次，根据 活细胞 死细胞双染试剂盒说明书，每孔依次加入 和 孵育 ，洗次，荧光显微镜使用（）激发滤片观察拍照。流式细胞仪检测细胞凋亡取对数生长期转染后 细胞并计数，均匀铺板于 孔板，后更换新鲜培养液，继续培养 后终止培养，收集细胞并计数，取 万重悬细山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期胞于 条件下离心 ，根据 细胞凋亡检测试剂盒说明书，分别依次加入 结合液，和 碘化丙啶染色液，轻轻混匀，避光孵育 ，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。线粒体膜电位检测细胞凋亡早期情况收集对数生长期转染后 细胞，计数铺板于 孔板，放置培养箱培养 后终止。根据线粒体膜电位检测试剂盒说明书，提前配置 染色工作液和 染色缓冲液（）备用。洗涤细胞遍，加入 培养液和 染色工作液，混匀，培养箱孵育 ，染色缓冲液（）洗 次，加入 培养液。在荧光显微镜下观察和拍照。线粒体膜电位下降标志细胞凋亡早期，红 绿荧光强度比值表示细胞去极化程度，比值越高说明膜电位越高 。细胞核 染色取对数生长期转染后 细胞计数铺板于 孔板，培养 后终止，洗 次，组织细胞固定液固定 ，洗 次，染色液染色 ，洗涤后于荧光显微镜下观察细胞核形态。统计学分析使用 进行统计分析，数据以均数 标准差表示，两组间比较采用独立样本 检验。表示差异有统计学意义。结果 在鼻咽癌细胞 中的表达结果 显 示，在 、和 细胞中均有表达，与人永生化鼻咽上皮细胞 相比，在鼻咽癌细胞中表达较高，差异有统计学意义（，见图 ）。与 组和 组相比，在 组中表达上调（）；与 组和 组相比，在 组中表达下调（，见图 ）。与人永生化鼻咽上皮细胞 比较，图 在人永生化鼻咽上皮细胞 和鼻咽癌细胞中表达水平 与 组和相应的 组比较，图 鼻咽癌细胞 中 和 转染效率 对鼻咽癌细胞 增殖的影响结果表明，与 组相比，组吸光值较高（）；与 组相比，组吸光值较低（，见图 ）。细胞集落形成实验结果显示，与 组相比，组细胞集 ，落数目较多（）；与 组相比，组细胞集落数目较少（，见图 ）。活细胞 死细胞双染色检测结果表明，相较于 组，组活细胞较多；相较于 组，组活细胞较少（见图 ）。与各自对应的 组比较，图 对鼻咽癌细胞 增殖能力的影响 与各自对应的 组比较，图 对鼻咽癌细胞 细胞集落形成的影响 对鼻咽癌细胞 凋亡的影响流式细胞术检测结果表明，与 组相比，组细胞凋亡率较低（）；与 组相比，组细胞凋亡率较高（，见图 ）。线粒体膜电位（）检测结果表明，与 组相比，组细胞红 绿荧光强度比值较高；相较于 组，组红 绿荧光强度比值较低（，见图 ）。细胞核染色检测结果表明，相较于 组，组细胞出现核固缩和核碎裂较多（见图 ）。山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期黄绿色荧光表示活细胞；红色荧光表示死细胞图 对鼻咽癌细胞 细胞活力的影响 与各自对应的 组比较，图 对鼻咽癌细胞 凋亡能力的影响 ，与各自对应的 组比较，图 对鼻咽癌细胞 线粒体膜电位的影响 蓝色荧光表示细胞核；红色箭头指核固缩和核碎裂图 对鼻咽癌细胞 细胞核形态的影响 山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 讨论 广泛参与各种关键的细胞过程，通过降解靶基因转录本和抑制 的翻译在许多类型的肿瘤细胞中发挥作用 ，。有报道称 在鼻咽癌的发生发展中发挥着重要作用，例如 在鼻咽癌组织和细胞系中表达下调，鼻咽癌肿瘤分级越重、肿瘤越大 表达水平越低，过表达使细胞周期停滞在 期，抑制细胞增殖能力 。本研究以 为研究对象，通过荧光定量 检测 在人永生化鼻咽上皮细胞 和鼻咽癌细胞中的表达，结果发现相较于人永生化鼻咽上皮细胞 ，在鼻咽癌细胞中表达上调，说明 在鼻咽癌诊断中具有潜在的价值。上调在体外促进细胞增殖、迁移、侵袭，抑制细胞凋亡，在体内促进肿瘤生长，研究表明 通过与 结合，破坏 的稳定，作为竞争内源性 ，导致 的直接靶标 的表达上调，促进口腔鳞状细胞癌的发展 。也有研究表明 上调通过靶向 作为透明细胞肾细胞癌转移的重要启动子，促进透明细胞肾细胞癌的发展 。在肿瘤发展中发挥重要的作用。为了进一步阐明 在鼻咽癌细胞 中的生物学功能，本研究构建了下调或上调 表达水平的鼻咽癌细胞 转染细胞株。实验结果显示，在鼻咽癌细胞 中转染 后，与转染 相比 表达水平明显下调；相较于 组，组细胞增殖能力明显受到抑制，细胞凋亡增多，说明下调 能够抑制鼻咽癌细胞 的体外增殖，促进 细胞的凋亡。细胞凋亡是在基因水平上受到调控，从而有序和有效地清除受损细胞，癌前病变中 损伤导致的细胞凋亡可以清除潜在的有害细胞，从而阻止肿瘤的生长，这一死亡过程的解除与未受抑制的细胞增殖、癌症的发展和进展有关 ，。因此，推测可能通过 下调使鼻咽癌细胞增殖受到抑制，细胞凋亡增加，从而抑制鼻咽癌的发展。综上，本研究初步证实了下调 能够抑制鼻咽癌细胞 的增殖，促进 细胞的凋亡。是许多细胞过程的关键调控因子，在癌症中经常被解除控制，包括细胞凋亡，可能通过分别直接靶向促凋亡或抗凋亡 ，同时发挥促凋亡和抗凋亡的作用 ，将 作为合成 模拟物或抑制物已经成为一种很有前途的治疗癌症的方法。因此，推测 对鼻咽癌细胞凋亡的影响可能是通过靶向调控下游 发挥作用，由于实验的局限性尚未研究。未来我们将深入研究 上下游调控鼻咽癌生物学功能的潜在分子，为进一步了解鼻咽癌发生机制以及临床靶点治疗提供新的理论依据。参考文献：，：，：，：，：，（）：，：，：，：，：，：，：，：，（）：，：，（）：杨乾舸，覃禹铭，李武志 左布比卡因对子宫内膜癌细胞 生长和线粒体膜电位的影响 中国临床药理学杂志，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，：山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期