DKK-1抑制剂对大鼠蛛网膜下腔出血后脑水肿影响的研究.pdf

系统医学 SYSTEMS MEDICINE系统医学 2023 年 8 月第 8 卷第 15 期 基础医学系统研究 DKK-1抑制剂对大鼠蛛网膜下腔出血后脑水肿影响的研究张贵强1，许文锋2，杨和平11.广西壮族自治区民族医院神经内科，广西南宁 530001；2.广西壮族自治区工人医院神经内科，广西南宁 530022摘要 目的 探讨 DKK-l对大鼠蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）后水通道蛋白-4（aquaporin-4,AQP-4）和水通道蛋白-1（aquaporin-1,AQP-1）表达的影响。方法 选取 2022年 112月期间由广西医科大学动物实验中心提供的雄性大鼠 72只，按随机数表法分为假手术组、SAH模型组和 DKK-1抑制剂组，每组24只。分别比较各组在不同时间点（术后1、2、4周）的脑组织含水量和AQP-4、AQP-1的表达水平。结果 假手术组大鼠的脑组织含水量未改变，另两组脑组织含水量自第 1 周均慢慢提高，且在 1 周时增至最高。DKK-1抑制剂组术后1、2、4周时间点脑组织含水量均低于SAH模型组，差异有统计学意义（P0.05）。DKK-1抑制剂组术后1、2、4周AQP-4表达水平（0.780.14）%、（0.870.16）%、（0.980.18）%与术后1、2、4周AQP-1表达水平（0.790.15）%、（0.890.17）%、（0.970.19）%不断上调，差异有统计学意义（P0.05）。假手术组未出现AQP-1上调，其余各组AQP-1从术后1周时均逐渐增高上调；SAA模型组和DKK-1抑制剂组于术后4周时AQP-1表达值达到顶峰。DKK-1抑制剂组术后1、2、4周时间点AQP-1表达低于SAH模型组，差异有统计学意义（P0.05）。结论 DKK-1抑制剂可以减少SAH后大鼠脑组织含水量，可抑制AQP-4及AQP-1表达，从而减轻SAH后大鼠神经功能损害。关键词 蛛网膜下腔出血；DKK-l；水通道蛋白-4；水通道蛋白-1中图分类号 R4 文献标识码 A 文章编号 2096-1782（2023）08(a)-0038-04Effect of DKK-1 Inhibitor on Cerebral Edema after Subarachnoid Hemorrhage in RatsZHANG Guiqiang1,XU Wenfeng2,YANG Heping11.Department of Neurology,Guangxi Zhuang Autonomous Region Nationality Hospital,Nanning,Guangxi Zhuang Autonomous Region,530001 China;2.Department of Neurology,Guangxi Zhuang Autonomous Region Workers Hospital,Nanning,Guangxi Zhuang Autonomous Region,530022 ChinaAbstract Objective To explore the effect of DKK-l on the expression of aquaporin-4 and aquaporin-1 after subarachnoid hemorrhage(SAH)in rats.Methods 72 male rats provided by the Animal Experimental Center of Guangxi Medical University from January to December 2022 were selected and randomly divided into sham surgery group,SAH model group,and DKK-1 inhibitor group,with 24 rats in each group.Compared the brain tissue water content and the expression levels of AQP-4 and AQP-1 in each group at different time points(1,2,and 4 weeks after surgery).Results The water content of the brain tissue in the sham operated group remained unchanged,while the water content of the brain tissue in the other two groups gradually increased from week 1 and reached its maximum at week 1.The brain tissue water content of the DKK-1 inhibitor group was lower than that of the SAH model group at 1,2,and 4 weeks after surgery,the difference was statistically significant(P0.05).The expression levels of AQP-4 in the DKK-1 inhibitor group at 1,2,and 4 weeks after surgery were(0.780.14)%,(0.870.16)%,(0.980.18)%,and(0.79DOI：10.19368/ki.2096-1782.2023.15.038基金项目 广西壮族自治区卫生健康委员会自筹经费科研项目（Z20190542）。作者简介 张贵强（1981-），男，硕士，副主任医师，研究方向为脑血管疾病及神经免疫。通信作者 杨和平（1964-），女，博士，主任医师，研究方向为脑血管疾病及神经介入，E-mail:。38系统医学 2023 年 8 月第 8 卷第 15 期 基础医学系统研究 SYSTEMS MEDICINE 系统医学0.15)%,(0.890.17)%,and(0.970.19)%,respectively,the difference was statistically significant(P0.05).The sham surgery group did not show an upregulation of AQP-1,while the other groups gradually increased and upregulated AQP-1 from 1 week after surgery;The model group and DKK-1 inhibitor group reached their peak in AQP-1 expression at 4 weeks after surgery.The expression of AQP-1 in the DKK-1 inhibitor group was lower than that in the SAH model group at 1,2,and 4 weeks after surgery,the difference was statistically significant(P0.05).Conclusion DKK-1 inhibitor can reduce the water content of rat brain tissue after SAH,inhibit the expression of AQP-4 and AQP-1,and thus reduce the damage of rat nerve function after SAH.Key words Subarachnoid hemorrhage;DKK-l;AQP-4;AQP-1蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）属于全球健康难题，其存在高致死、病死风险，同时具持久性，严重威胁患者生命健康和生活质量1。SAH发生后引起严重的脑水肿和脑积水2。在脑水肿发生过程中，水通道蛋白-l（aquaporin-1,AQP-l）和水通道蛋白-4（aquaporin-4,AQP-4）起着非常关键的作用，是中枢神经系统中最关键的两类水通道蛋白3。经典 Wnt/-catenin 信号通路具有阻止细胞凋亡、促进细胞再生的功能，在中枢神经系统内环 境 稳 定 的 维 持 中 发 挥 着 至 关 重 要 的 作 用4。DKK-1是调控Wnt通路的关键负性因子5。已有研究表明，应用DKK-1的拮抗剂或中和抗体诱导Wnt经典通路激活，在缺血性脑卒中发挥了脑保护作用6。而关于 SAH 后脑水肿影响未见相关报道，为进一步深入研究，本实验研究于2022年112月选取 72只由广西医科大学动物实验中心提供的雄性健康SD大鼠，通过建立大鼠SAH模型，检测不同时间点（术后1、2、4周）大鼠脑组织含水量以及AQP-4、AQP-l变化，探讨DKK-l对SAH后慢性脑水肿的影响及其作用机制，为治疗提供新的思路及手段。现报道如下。1 材料与方法1.1 材料实验动物：72 只雄性、成年的健康 SD 大鼠，体质量 180220 g，采购来源于广西医科大学动物实验中心。实验试剂：AQP-4 抗体和 AQP-1 抗体（购自康为世纪公司），Western blotting-抗稀释液（购自康为世纪公司），Wnt/-catenin抑制剂DKK-1（购自上海康朗生物科技有限公司），脑立体定位仪（购自美国Stoelting公司），5、100 L微量注射器，电子分析天平（购自上海天平仪器厂）。本研究已获医院医学伦理委员会及动物实验伦理委员会同意许可。1.2 方法1.2.1 SAH 大鼠模型 术前禁食 1 d，自来水饲养。经右侧腹腔注入 10%水合氯醛用量为 300 mg/kg（国药准字 H37022673）行麻醉处理，再进行头颈部、左侧腹股沟区的备皮处理。取俯卧位使用立体定位仪固定大鼠。颈部稍屈，常规消毒铺巾，在显微镜下沿头颈部交界处作一长约 34 mm 的纵切口，暴露环枕筋膜，对枕大池行垂直穿刺，抽出0.1 mL清亮脑脊液（cerebro-spinal fluid,CSF）后，自原股静脉置管区域采集 0.2 mL 新鲜血，向枕大池低速注入，缝合后头低位放置 30 min。SAH模型组操作与实验组完全相同，但两次注射均以生理盐水代替自体血。1.2.2 实验分组及实验模型建立 成年健康雄性SD 大鼠 72 只，体质量 180220 g，按随机数表法分为假手术组（n=24）、SAH 模型组（n=24）和 DKK-1抑制剂组（n=24）。SAH 模型组和 DKK-1 抑制剂组均采用枕大池二次注血法制作大鼠 SAH 模型，DKK-1抑制剂组于造模前15 min侧脑室注射DKK-1，2 mg/kg,100 L，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline,PBS）冲洗，而假手术组大鼠也经相同的手术过程，假手术组和SAH模型组于造模前15 min侧脑室注射等量生理盐水。1.2.3 脑水肿的测定 利用干湿法测定大鼠脑组织水含量：大鼠于相应时间点处死后，取脑组织，用滤纸轻吸去表面水分，标记后称湿重，置烘干箱11024 h 烘至恒重，再称干重，用电子分析天平称量。然后按Eliot公式计算：脑含水量（%）=（湿重-干重）/湿重100%。1.2.4 免 疫 组 化 法（Western blot）测 定 AQP-4 与AQP-1 蛋白的表达 石蜡切片经 H0处理 10 min后，用10%正常羊血清封闭30 min，一抗（浓度为1 600）为兔抗大鼠AQP-4多克隆抗体，室温下孵育过夜，SABc试剂盒(武汉博士德公司)按说明书进行操作，二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）显色后光镜观察。阴性对照用磷酸缓冲盐溶液（phosphate 39系统医学 2023 年 8 月第 8 卷第 15 期 基础医学系统研究 系统医学 SYSTEMS MEDICINEbuffered saline,PBS）代替一抗进行孵育。1.3 统计方法所用统计学软件为SPSS 28.0，计量资料符合正态分布，数值由（x s）呈现，组间均数实施独立样本t检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 3组大鼠脑组织含水量比较假手术组大鼠的脑组织含水量未改变，另两组脑组织含水量自第 1 周均慢慢提高，且在 1 周时增至最高。DKK-1 抑制剂组术后 1、2、4 周时间点脑组织含水量均低于SAH模型组，差异有统计学意义（P0.05）。见表1。2.2 3组大鼠AQP-4表达水平比较假手术组AQP-4未见提高，另两组AQP-4表达水平自术后 1 周时均慢慢提高；且均于术后 4 周增至最大。DKK-1 抑制剂组术后 1、2、4 周时间点AQP-4 表达低于 SAH 模型组，差异有统计学意义（P0.05）。见表2。2.3 3组大鼠AQP-1表达水平比较假手术组未出现AQP-1上调，其余各组AQP-1从术后1周时均逐渐增高上调；模型组和DKK-1抑制剂组于术后4周时AQP-1表达值达到顶峰。DKK-1抑制剂组术后1、2、4周时间点AQP-1表达低于SAH模型组，差异有统计学意义（P0.05）。见表3。3 讨论SAH 是最常见的出血性脑血管病之一，而脑水肿是 SAH 后主要的神经损伤，是一种脑细胞间质空间水量病态增加的现象7。脑水肿的发生是十分复杂的病理过程，目前尚不清楚其分子水平的发病机制。AQPs是一类表达于各种细胞的疏水性蛋白水通道家族，其参与调节体内水稳态和脑水肿的形成，是缓解脑卒中所致脑水肿的有效靶点8。在中枢神经系统中存在 5 种水通道蛋白，分别是 AQP-l、AQP-4、AQP-7、AQP-9 和 AQP-，其中 AQP-l、AQP-4 含量最高9，分别分布于脉络丛上皮靠近脑脊液一侧的顶部和毛细血管周围星形胶 质 细 胞 足 突 的 质 膜、胶 质 界 膜 和 室 管 膜10。DKK 为动物进化期间一类极具保守性的分泌性糖蛋白，此蛋白的功能以抑制信号途径 Wnt 传导为主，内含 4 个成员11。DKK-1 是 Wnt信号通路中重要的拮抗分子之一，DKK-1 可以抑制 Wnt 蛋白与LRP5/6 等受体的结合，从而抑制 Wnt 信号通路12。同时也是 Wnt 通路的下游靶基因，从而形成了一个负反馈调节环，在维持成体组织的动态平衡中起到了重要作用13。本研究结果显示，假手术组术后 1、2、4周未出现 脑 组 织 含 水 量 变 化（77.107.19）%、（77.117.23）%、（78.917.01）%，大鼠脑组织含水量从术后第 1 周起均逐渐增多，并在术后 1 周时脑组织含水量达到顶峰，而在此时间段内，以 DKK-1抑制剂组为例，在脑含水量增大的同时，术后1、2、4周AQP-4 表 达 水 平（0.780.14）%、（0.870.16）%、（0.980.18）%与 术 后 1、2、4 周 AQP-1 表 达 水 平（0.790.15）%、（0.890.17）%、（0.970.19）%不断上调，这两者的表达水平与脑含水量呈正向相关，也与 Hao JQ 等14的研究认为上调的 AQP-4（0.880.15）%、（0.860.17）%、（0.990.17）%及 AQP-1（0.800.14）%、（0.910.18）%、（0.980.18）%参与了脑水肿的形成的研究结果相一致，即脑水肿发生与AQP-4及AQP-1密切相关。在本研究中，在各时间节点的脑组织含水量方面，相较模型组，DKK-1 抑制剂组均偏低（P0.05）；另外，在各节点 AQP-1 与AQP-4 表达量上，相较模型组，DKK-1 抑制剂组均偏低，从而能够发现，DKK-1 抑制剂能够减少 SAH后大鼠脑组织含水量，能够使 AQP-1、AQP-4 表达下调，减轻 SAH 后大鼠神经功能损害。SAH 后，脑表13组大鼠脑组织含水量比较(x s)，%组别假手术组（n=24）SAH模型组（n=24）DKK-1抑制剂组（n=24）术后1周77.107.19（83.8711.41）*（80.3111.24）术后2周77.117.23（81.8510.02）*（79.0211.43）术后4周78.917.01（79.028.81）*（76.3111.21）注：与假手术组相比，*P0.05；与SAH模型组相比，P0.05。表23组大鼠各个时间点AQP-4表达水平比较(x s)，%组别假手术组（n=24）SAH模型组（n=24）DKK-1抑制剂组（n=24）术后1周0.510.11（0.970.17）*（0.780.14）术后2周0.470.12（1.080.24）*（0.870.16）术后4周0.500.11（1.200.23）*（0.980.18）注：与假手术组相比，*P0.05；与SAH模型组相比，P0.05。表33组大鼠各个时间点AQP-1表达水平比较(x s)，%组别假手术组（n=24）SAH模型组（n=24）DKK-1抑制剂组（n=24）术后1周0.610.21（0.980.16）*（0.790.15）术后2周0.500.22（1.090.21）*（0.890.17）术后4周0.490.12（1.210.26）*（0.970.19）注：与假手术组相比，*P0.05；与SAH模型组相比，P0.05。40系统医学 2023 年 8 月第 8 卷第 15 期 基础医学系统研究 SYSTEMS MEDICINE 系统医学组织含水量增多，AQP-4及AQP-1表达增多；AQP-4及 AQP-1表达值与脑含水量关系密切，原因在于脑组织的 AQP-4 及 AQP-1 主要分布于血脑屏障，当SAH发生后，血脑屏障受损，内环境发生紊乱，血肿 AQP-4及 AQP-1大量聚集，周围产生炎性水液，水通道异常，引起脑水肿，是 SAH 后的重要病理基础15-16。本研究结果提示 DKK-1 抑制剂能够降低SAH 后大鼠脑组织含水量，能够使 AQP-1、AQP-4表达下调，一方面揭示了SAH后脑水肿形成相关的分子机制，同时为 DKK-1 抑制剂治疗 SAH 给予实验上的指导。综上所述，DKK-1抑制剂可以减少SAH 后大鼠脑组织含水量，可抑制AQP-4及AQP-1表达，从而减轻SAH后大鼠神经功能损害。参考文献1 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